筛 选做准备。
[0074] 将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数 期后加入M13辅助噬菌体超感染，28°C培养过夜扩增噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用 于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
[0075] 实施例2、抗ro-i噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选
[0076] 经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的 96孔深孔板，37°C，220rpm培养至其对数生长期，每孔加入约10 1°的辅助噬菌体M13K07， 37°C静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，28°C，220rpm 培养过夜。4000rpm，4°C离心15min，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定。筛选得到亲 和力较高的单链抗体DFPD1-1，其重链可变区命名为DFPD1-H1，其氨基酸序列见SEQ NO. 1 ; 其轻链可变区命名为DFPD1-L1，氨基酸序列见SEQ NO. 5。
[0077] 实施例3、对筛选出的抗ro-Ι单链抗体DFPDl-I进行体外亲和力成熟
[0078] 3. I. DFPDl-I 轻链 CDR1、2、3 突变库的构建
[0079] 设计引物PVLFl和PVLRl以合成的轻链突变库（SEQ NO. 12)为模板，PCR扩增轻 链库基因（图3);设计引物PVHFl和PVHRl以DFPDl-I质粒为模板扩增其重链及linker 区（图 2)。反应条件：95°C 30s，lcycle ;95°C 15s，60°C 10s，72°C 30s, 3cycles ;95°C 15s， 72°C 40s，25cycles，72°C 5min，4°C保存。天根通用回收试剂盒回收PCR目的片段。
[0080] 引物如下所示：
[0081] PVLFl :5, -GATATCCAGATGACCCAGAGC-3，
[0082] PVLRl :5' -CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC-3'
[0083] PVHFl :5, -CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG-3'
[0084] PVHRl :5, -GCTCTGGGTCATCTGGATATCGGATCCACCACC-3'
[0085] 将上述两部分PCR反应产物进行Overlap PCR扩增获得DFPDl-I的轻链突变 库基因。反应条件：95°C 30s，lcycle ;95°C 15s，72°C 30s，4cycle ;(加入引物 PVHFl 和 PVLR2)，95°C 15s，72°C 40s，25cycles ;72°C 5min，4°C保存。天根通用回收试剂盒回收 PCR 目的片段，对应的PCR产物命名为VLCDR123M-DFPD1-1 (图4)。
[0086] 用NcoI-HF和NotI对质粒pScFvDisb-s进行双酶切，酶切产物经0. 8%琼脂糖凝 胶电泳（图5)，切胶回收；用NcoI-HF和NotI分别对VLCDR123M-DFPD1-1PCR产物进行双酶 切。PCR酶切产物采用通用回收试剂盒进行回收。回收后的PCR片段与pScFvDisb-s按摩 尔比4 :1比例经T4DNA连接酶16°C连接4h。将连接产物电击法转化至TGl感受态中。使 用SOC培养基37°C培养Ih复苏。按比例取菌液，涂平板，计算库容量。其余菌液4000rpm， 室温下离心15min。弃上清，沉淀涂布于2YTAG大平板上，37°C倒置培养过夜。
[0087] 构建抗体库库容大约为108,从上述抗体库中分别随机挑取20个克隆进行序列分 析正确率95%，抗体库库容远远超过抗体库的多样性。
[0088] 3. 2.噬菌体抗体库的生物淘选和阳性克隆的筛选
[0089] 在按照实施例1的方法进行筛选，得到亲和力较高的克隆测序，共得到6种不同 的单链抗体序列，分别命名为 DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPDlUt 应的轻链可变区命名为 DFPDl-L2、DFPDl-L3、DFPDl-L4、DFPDl-L5、DFPDl-L6、DFPDl-L7,它 们对应的氨基酸序列分别见 SEQ NO. 6、SEQ NO. 7、SEQ NO. 8、SEQ NO. 9、SEQ NO. 10 和 SEQ NO. 11。单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力如图3所示。
[0090] 3. 3.梯度稀释phage ELISA鉴定抗PDl单链抗体的亲和力
[0091] 将本实施例2中获得的克隆进行单克隆phage的展示和纯化，进行phage梯度稀 释ELISA实验鉴定phage-Abs的亲和力。
[0092] 用邱9.6的碳酸盐缓冲液包被^)1-把8,4°(：包被过夜。？831'洗涤三次，4% milk-PBST 37°C封闭lh。将纯化后的phage用4% milk-PBST三倍稀释，每孔加入IOOul稀 释后的样品，室温静置lh。用PBST洗涤ELISA板，将4%脱脂奶粉稀释后的anti-M13-HRP单 克隆抗体加入ELISA板中，室温放置lh。TMB显色试剂盒显色，室温显色5min。用2M H2SO4 终止显色，50μ1/孔。酶标仪450nm单波长测定光密度值。结果显示筛选出的几株不同的 噬菌体抗体均能与I3D-I进行结合，而且DFPD1-3, DFPD1-7的亲和力明显高于其它克隆（图 4)，选取DFPD1-3和DFPD1-7进行下一步试验。
[0093] 实施例4、对筛选出的抗ro-Ι的单链抗体DFPD1-3, DFPD1-7再次进行体外亲和力 成熟
[0094] 4. 1DFPD1-3 和 DFPD1-7 重链 CDR1、2、3 突变库的构建
[0095] 设计引物PVHF2和PVHR2以合成的重链突变库（SEQ NO. 13)为模板，PCR扩增重 链库基因（图8);设计引物PVLF2和PVLR2以DFPD1-3和DFPD1-7质粒为模板分别扩增 其轻链及linker区（图9)，其中，左侧为DFPD1-3,右侧为DFPD1-7。反应条件：95°C 30s， lcycle ；95〇C 15s,60°C 10s,72〇C30s, 3cycles ；95〇C 15s,72〇C40s, 25cycles ；72〇C 5min, 4°C保存。天根通用回收试剂盒回收PCR目的片段。
[0096] 引物如下所示：
[0097] PVHF2 : '5CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG3'
[0098] PVHR2 : STGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTG 3，
[0099] PVLF2 : SCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGC3'
[0100] PVLR2 : '5CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC3'
[0101] 将上述两部分PCR反应产物进行Overlap PCR扩增获得DFPD1-3和DFPD1-7的重 链突变库基因。反应条件：95°C30s，lcycle ;95°C 15s，72°C30s，4cycles ;(加入引物 PVHF2 和 PVLR2)，95°C 15s，72°C 40s，25cycles ;72°C 5min，4°C保存。天根通用回收试剂盒回收 PCR目的片段，将对应的产物命名为VHCDR123M-DFPDl-3(图10)和VHCDR123M-DFPDl-7(图 11) 〇
[0102] 用NcoI-HF和NotI对质粒pScFvDisb-s进行双酶切，酶切产物经0. 8 %琼 脂糖凝胶电泳（图5)，切胶回收；用NcoI-HF和NotI分别对VHCDR123M-DFPD1-3和 VHCDR123M-DFPD1-7PCR产物进行双酶切。PCR酶切产物采用天根通用回收试剂盒进行回 收。回收后的PCR片段与pScFvDisb-s按摩尔比4 :1比例经T4DNA连接酶16°C连接4h。 将连接产物电击法转化至TGl感受态中。使用SOC培养基37°C培养Ih复苏。按比例取菌 液，涂平板，计算库容量。其余菌液4000rpm，室温下离心15min。弃上清，沉淀涂布于2YTAG 大平板上，37 °C倒置培养过夜。
[0103] 构建了 2个不同的抗体库。每个抗体库库容大约为107,抗体库库容远远超过抗体 库的多样性。从上述抗体库中分别随机挑取20个克隆进行序列分析，正确率为90%。
[0104] 4. 2噬菌体抗体库的生物淘选和阳性克隆的筛选
[0105] 将上述构建的两种抗体库，进行phage展示，纯化和沉淀。然后从该库中淘选抗 PDi的单链抗体。噬菌体抗体库的生物淘选方法同实施案例1。抗ro-i的单链抗体阳性克 隆的筛选的方法同实施案例2。结果发现共筛选到5种不同的抗ro-i抗体序列，分别命名为 DFPD1-9, DFPD1-10, DFPD1-11，DFPD1-12, DFPD1-13。其中 DFPD1-9, DFPDl-Il 和 DFPD1-12 的轻链可变区序列是DFPD1-L3,而DFPD1-10和DFPD1-13的轻链可变区序列是DFPD1-L7 ; DFPD1-9和DFPD1-10的重链可变区序列是DFPD1-H2，DFPD1-11和DFPD1-13的重链可变区 是 DFPD1-H3，DFPD1-12 的重链可变区是 DFPD1-H4。单克隆 phage ELISA 鉴定 phage-Abs 的 相对亲和力如图12所示。
[0106] 4. 3.梯度稀释phage ELISA鉴定抗PDl单链抗体的亲和力
[0107] 将本实施例4. 2中获得的克隆进行单克隆phage的展