一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物催化领域，具体设及一种脂肪酶催化混合油的游离脂肪酸及栋桐 酸甘S醋（tripalmitin，PP巧合成母乳脂肪替代品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 母乳脂肪作为婴幼儿生长发育期间的重要营养物质，它对婴儿细胞膜的构建、维 生素的吸收、能量补充及智力发育有着重要的作用。当母乳供应不足，或者婴儿断奶后需 要增加辅食时，母乳脂肪替代品（HumanmUkfatsubsititute,HMF巧作为代替母乳的 婴儿喂养食物，其结构功能应当与天然母乳脂肪及其类似，除了提供母乳所能提供的营养 物质之外，还必须给予婴幼儿更多有助于他们身体、智力发育的必要元素和有机物。添加 HMK的配方奶粉，在体内主要Wsn-2栋桐酸甘油单醋和游离油酸的形式吸收，防止产生游 离栋桐酸和Ga2+形成不溶的皂巧影响脂肪酸和Ga2+的吸收，造成大量巧质的流失化ipid Technology, 2010, 22 (6) : 126-129)，从而引起婴幼儿便秘及腹痛。
[0003] 此外，与喂食普通奶粉的婴儿相比，喂食高含量sn-2栋桐酸配方奶粉的婴儿骨骼 矿物质的吸收率更高，从而更好地支持婴幼儿体格和骨骼的自然成长。因此，HMK的化学 结构和脂肪酸组成是影响婴幼儿配方奶粉营养功能的重要因素。
[0004] 目前，现阶段市场上的人工合成HMFS的原料主要有鱼油、猪油、牛乳脂等动物油， 栋桐油、菜巧油等植物油，虽然来源丰富，但是运些底物均有相应的缺点。如鱼油易氧化 不稳定，猪油中含过多硬脂酸，易使产物结块，影响婴儿吸收并且会受人文宗教因素的限 审IJ;牛乳代替母乳直接喂养，难W被婴儿吸收，已被市场所淘汰；植物油中虽然说其组成与 HMFS具有相似性，但是脂肪酸甘油S醋中分布结构的不同（AmericanDai巧ScienceAsso ciation，2007, 90(4) :2147-2154)，导致了婴儿还是难W吸收。综上，运些原材料来源往往 受到诸多方面的限制，且营养价值也良莽不齐；制备工艺过程繁琐，不饱和脂肪酸易氧化， 生产成本高；不同国家、地区、民族、及文化背景等地域文化的限制客观存在。因此，都不是 人工合成HMFS的最佳原料。 阳0化]近年来，随着陆地资源的枯竭，促使人类走向海洋寻求新型的资源，与此同时，易 培养、高油脂、富含DHA、脂肪酸组成及分布多样化的微藻的出现带给人类前所未有的机遇。 研究表明，藻油作为一种新兴的纯天然油脂，其总多不饱和脂肪酸含量很高（50%W上）， 含有丰富的DHA、DPA等W-3 不饱和脂肪酸巧uropeanJournalofLipidScienceand Technology, 2013, 115(9) :965-976)，而且具有安全、无污染、营养价值高等优点，理论上是 制备功能性HMK的优质原料。但是，由于藻油甘油S醋中脂肪酸组成及分布的自身特点， 其sn-1，3位含有一定量的栋桐酸，不利于婴幼儿的消化吸收，不能直接用作HFMS。因此， 本专利选择将天然的藻油进行合理的酶法结构改造，将其与富含短碳链的挪子油、富含单 不饱和脂肪酸的橄揽油和富含DHA的藻油按照相应的比例制备成酷基供体，与PPP酶促合 成更加符合婴幼儿营养需求的母乳化HMK是一种非常合理且切实可行的途径。
[0006] 酶法制备母乳脂肪替代品，除了上述酶和原材料的开发和研究W外还有生物 催化技术的改进。由于油脂粘度较高，给反应过程的传质传热效应带来负面的影响，然 而，近年来发展的利用低溫微波技术来增强液-液非均相体系的传质是一种有效的解 决油脂流动性问题的手段度ioresource Technology, 2011, 102(11) :6617-6620)。与 传统反应器相比，微波场强化能够增强醋类合成反应的场效应，促使酶促反应高效进 行，大大提高了目标产物的时空产率，缩短了反应时间，提高酶的稳定性度ioresource Technology, 2013, 149:367-374)等优点被广泛应用于生物催化中，尤其是非水相酶促反应 中。
[0007] 目前"微波福射-酶禪合催化技术"已被广泛应用于实验研究度ioresourceTec hnology，2010, 101 (13) :4851-4861)，用恒定的微波福射功率结合恒定的反应溫度，使微波 的非致热效应得到显著加强。然而，截至目前，利用微波辅助酶促合成母乳脂肪替代品的文 献报道较少，但是，考虑到微波的场致特性，它在HMK合成中的应用将会逐渐扩大。因此， 本文考察了脂肪酶催化混合游离脂肪酸与PPP反应制备HMK的同时，通过控制水活度来试 图提高产物得率，将低溫微波技术应用到酶促转醋化制备富含DHA的HMK上，分别阐明微 水、微波对酶促转醋化的影响。
【发明内容】
[0008] 解决的技术问题：本发明针对用于婴儿配方食品的现有Hire及其制备方法的相 关问题，W富油栋桐酸（C16:0)的橄揽油、含有辛酸（C8:0)、月桂酸（C10:0)等短碳链脂肪 酸的挪子油，及富含DHA的微藻为原料，提供一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替 代品及其制备方法，选择性富集甘油S醋中sn-1，3位上DHA等不饱和脂肪酸的含量，制备 出的HMFS不用再额外添加DHA。本方法制备出的HMK提高了sn-2位上栋桐酸的含量，能 与母乳脂肪sn-2位保持一致，即60%W上。对于HMFS的功能提高有很大帮助。
[0009] 技术方案：一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品的制备方法，其步 骤为：1)水活度的控制方法：分别将3A分子筛及Li化、LiCl、CH3COOK、Mg(N〇3)2?6&0、 化Cl、KCl、Kz化2〇7配制成饱和溶液放置于密闭的容器中，室溫下3A分子筛用于控制水活度 < 0. 01，各个饱和溶液所控制的水活度分别为0. 05、0. 11、0. 23、0. 54、0. 75、0. 85、0. 95 ;将 通过尿素包合法纯化得到的游离脂肪酸橄揽油、挪子油和藻油按照质量比为70:15:15~ 98:1:1混合，与栋桐酸甘=醋一起作为脂肪酶酶促醋交换的底物，并将游离脂肪酸混合物 和栋桐酸甘=醋混合置于同一反应瓶中，将反应瓶及盛有脂肪酶的滤纸分别放入各个密闭 的容器中于室溫下平衡2-3d;2)脂肪酶催化酸解：上步平衡结束后，取出底物、脂肪酶放入 螺口玻璃瓶密闭，分别在恒溫水域摇床及微波反应器中进行酶法醋交换反应，所述栋桐酸 甘=醋与混合游离脂肪酸的混合质量比为1:1~1:15,醋交换反应后，经减压蒸馈分离出 反应所得到的油脂并精炼，即得母乳脂肪替代物。
[0010]所述脂肪酶为Lipozyme RM IM、Lipozyme IM60、Lipozyme IM20、Lipase SP435、 Lipase SP382、Candida rugosa lipase、Lipase MC7、Lipozyme TL IM、Novozym 435、 Candida antarctica lipase B、R275A lipase或猪膜脂肪酶。
[0011] 所述配制成饱和溶液的溶剂为乙醇、正下醇、正己烧、环己烧、乙酸乙醋或乙酸下 醋。
[0012] 所述脂肪酶占反应体系的质量比例为I%~15%，所述酶法醋交换反应的反应溫 度为30~80°C，反应时间为15~120min。
[0013] 上述方法制备得到的母乳脂肪替代品。
[0014] 有益效果：本发明采用sn-1，3位特异性脂肪酶催化混合脂肪酸与PPP定向合成 HMFS。反应终产物中富含DHA且其sn-2位上的栋桐酸含量也相对较高，可W保证与天然母 乳脂肪中sn-2位上栋桐酸含量相当，即达到70%左右。更重要的是，将低溫微波技术应用 到酶促转醋化合成HMK中，为今后规模化制备HMK提供理论基础和技术支撑，对于国外垄 断产品的国产化、提高富油微藻的资源利用度、延伸我国乳品行业的产业链具有积极的现 实指导意义。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0016] 用于脂肪酸的定性定量分析的方法是高效气相色谱，其条件为：采用Agilent 6820气相色谱仪，型号HP-INN0WAX，色谱柱长30m，外径0. 25mm，内径0. 25ym，采用梯度升 溫方式，初始溫度80°C，柱箱最高溫度250°C，后进样口最高溫度250°C，后检测器最高溫度 280°C，总计43min，进样量为1yL。
[0017] 实施例1
[0018] 本实施例说明醋交换所用底物的脂肪酸组成分析。
[0019] 分别将橄揽油、挪子油、藻油通过尿素包合法纯化得到游离脂肪酸，将=种油的游 离脂肪酸按照质量比为70:15:15~98:1:1(橄揽油：挪子油：藻油）混合后经过气相色 谱测定，得到橄揽油、挪子油和藻油W及混合游离脂肪酸中（W质量比橄揽油：挪子油：藻 油=90:5:5为例）各个脂肪酸的含量见下表1。后续实施例所用混合游离脂肪酸均W本实 施例为原料。
[0020] 表1橄揽油、挪子油和藻油W及混合油（橄揽油：挪子油：藻油=90:5:5)中各 个脂肪酸的含量
[0021]
阳0巧 a:未检测到
[0023] W下实施例说明W脂肪酶作催化剂催化醋化反应的过程。
[0024] 实施例2 阳0巧]将PPP(0. 62g)与混合游离脂肪酸（1. 88g)摩尔比1:9混合后，加入sn-1，3位特 异性脂肪酶LipozymeRMIM10% (0.25g)，放入60 °C水浴摇床中反应化。 阳〇%] 反应结束后取出500yL，加入60mg猪膜脂肪酶水解3min，用乙酸萃取，取有机层 进行薄层层析，刮取sn-2位单甘脂条带。加入2血正己烧和2血0.5molKOH