G扩增出C端带有His标签的LT成熟肽基因，并 在下游引入了六个组氨酸编码序列，使LT的B亚基N段也含His标签，方便纯化。
[0044] 2.质粒提取及验证
[0045] 提取保存的质粒并进行凝胶电泳验证：质粒提取使用Axygen质粒小量提取试剂 盒，按操作说明书进行，提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小进行验证，具体过 程如下：
[0046] 1)将分别保有pET30a_LTRG质粒、pcoldll质粒的DH5a甘油菌从_80°C冰箱取出， 蘸取少量菌液划线接种至相应抗性的LB培养板（pET30a为kan抗性，pcoldll为Amp抗 性），37°C倒置培养12~16小时。
[0047]2)分别从平板上挑取单菌落接种到含5mLLB液体培养液的试管中，37°C摇床中 以200r/min培养过夜。
[0048] 3)吸取菌液lmL转移到1. 5mL离心管中，12000rpm离心2min，弃上清收集菌体；
[0049] 4)向沉淀中加入250μLsolutionA重悬菌体；
[0050] 5)加入250 μ L solution B，上下颠倒几次使混匀，直至形成透亮的溶液。此步骤 不超过5min〇
[0051] 6)加入350 μLsolution C并温和翻转几次混匀液体，4°C，以12000rpm离心 10min〇
[0052] 7)小心吸取步骤6中的上清转移到置于收集管的DNA吸附柱中，12000rpm/min离 心lmin，弃滤液，将吸附柱放回收集管。
[0053] 8)加入Wash I液500 μ L，12000rpm离心lmin，弃滤液后将吸附柱放回收集管。
[0054] 9)在吸附柱中加入700 μ L的Wash II洗脱液，12000rpm离心lmin，弃滤液。并重 复一次。
[0055] 10)弃滤液后仍将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心lmin。
[0056] 11)将吸附柱转移到新的1.5mLEP管，向膜中央小心加入60yL预热到65°C 的双蒸水溶解质粒，静置3min后以12000rpm的速度离心2min，EP管内即为所提质粒 pET30a-LTRG，置-20°C保存备用。
[0057] 3. PCR扩增目的片段
[0058] 以步骤2中提取的pET30a_LTRG质粒为模板，用相应的引物进行PCR扩增，分别扩 增出含有His标签的LTRG基因目的片段，扩增出的LTRG基因片段大小为1300bp，与预期相 符，见图1。
[0059] PCR反应体系：
[0060]
[0061] PCR反应参数：
[0062]
[0063] 4.胶回收目的片段
[0064] 使用Axygen凝胶DNA回收试剂盒从PCR产物中回收目的片段，操作按说明书进 行：
[0065] 1)制备浓度1%的TAE琼脂糖凝胶。
[0066] 2)将PCR产物与6 X Loading buffer混合均匀后上样，100V恒压电泳20分钟，切 胶，将含目的片段的凝胶放入洁净EP管。
[0067] 3)按重量比1:3(含DNA的琼脂糖：溶液S1)加入溶液S1。
[0068] 4) 50°C水浴lOmin，每2min颠倒混匀1次，使琼脂糖完全融化。
[0069] 5)将融化后的琼脂糖液移到置于收集管上的吸附柱中，12000g离心lmin后倒掉 收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
[0070] 6)向吸附柱中加入500yL的W1液，静置lmin后，12000g离心15秒。倒掉收集 管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。如果室温低于20°C，离心前先静置lmin。
[0071] 7)在吸附柱中加入500yL的W2液，静置lmin后，离心15秒。倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中，12000g离心lmin。
[0072] 8)将吸附柱放入一个干净的1. 5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μLT1液，静置 lmin后，离心lmin。将回收的DNA保存于_20°C。
[0073] 5.目的片段与质粒pcoldll双酶切
[0074] 将质粒pcoldll及PCR目的片段进行双酶切，获取可以进行连接的片段。
[0075] PCR目的片段酶切体系：
[0076]
[0077] 质粒酶切体系：
[0078]
[0079] 6.酶切目的片段与酶切质粒连接
[0080] 使用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物和质粒的酶切片段，方法同步骤4,获得片 段后进行连接。
[0081] 连接体系：
[0082]
[0083] 7.连接产物转化到DH5a
[0084] 1)将连接产物转化到克隆菌DH5a，克隆并扩增质粒。
[0085] 2)从-80°C冰箱取出50μL分装的DH5α感受态细胞放置冰上5min;
[0086] 3)加入连接产物2μL，缓慢摇动以混匀，冰浴30min。
[0087] 4)在42°C水浴中热激90s，冰浴4min。
[0088] 5)加入800μLSOB培养基，37 °C，摇动培养30min，同时取相应抗性 (pcoldll-LTRG用Amp抗性，pET28a-LTB用Kan抗性）LB平板于37°C培养箱中预热。
[0089] 6)吸取菌液200μL涂布平板，干燥后放37°C培养箱倒置培养14~16小时。
[0090] 8. pcoldll-LTRG重组质粒提取和验证
[0091] 1)质粒提取，方法同步骤2。用Axygen质粒小量提取试剂盒提取质粒，操作按说 明书进行。
[0092] 2)质粒双酶切验证：连接产物用PstI和XhoI/Ncol进行双酶切，经琼脂 糖电泳检测，图2所示为构建的表达质粒进行双酶切验证之后的核酸电泳图，泳道1为 pcoldll-LTRG质粒双酶切后，2为未酶切，3、4为pcoldll质粒，可见pcoldll-LTRG质粒双 酶切后出现的两条带一条与pcoldll大小一致，一条大小约1300bp与LTRG片段大小一致。
[0093] 3)将阳性质粒转化到DH5a后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，其碱基 序列如SEQIDN0. 3所示。
[0094] 实施例2重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的制备方法
[0095] 1.将重组载体pcoldll-LTRG转化到BL21 (DE3)感受态菌
[0096] 融化感受态：从_80°C冰箱取出50uL分装的BL21(DE3)感受态细胞，冰上放置 5min；
[0097] 1)冰浴：加入连接产物2μL，缓慢摇动以混匀，冰浴30min。
[0098] 2)热激：在42°C水浴中热激90s，冰浴4min。
[0099]3)培养：加入800μL的SOB培养基，37°C，摇动培养30min，同时取相应抗性 (pcoldll-LTRG用Amp抗性，pET28-LTB用Kan抗性）LB平板于37°C培养箱中预热。
[0100] 4)涂板：吸取菌液200μL涂布平板，干燥后放37°C培养箱倒置培养12小时。
[0101] 2.诱导表达
[0102] 1)种子液制备：挑取单个基因工程菌菌落，接种于5mL相应抗性的LB培养液， 37°C，180r/min振荡培养过夜作为种子液。
[0103] 2)培养：取lmL种子液接入100mLLB培养液中（4管），37°C，180r/min扩大培养 1. 5小时后每半小时取菌液lmL测0D600。
[0104] 3)pcoldII-LTRG诱导表达：当0D600达到(λ4~(λ5时，将培养液转至15°C低温 培养箱放置30分钟使降温，添加IPTG至1. OmM终浓度，在15°C继续震荡培养24小时后收 获菌液。
[0105] 4)收获菌体：将收获的菌液以8000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS重悬清洗， 离心弃上清；
[0106] 5)胞质周隙蛋白提取：取少量表达pcoldll-LTRG的菌体先后用20%蔗糖和去离 子水进行高渗和低渗处理，使菌体胞质周隙中的蛋白释放，离心后分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE，确定表达产物位置是胞内还是胞质间隙。
[0107] 6)破碎菌体：将收获菌体用10mL的PBS重悬，进行超声破碎（功率：300W，工作时 间5秒，间歇时间10秒，总次数30)。
[0108] 7)离心：破碎的菌液以12000rpm离心10min，吸取上清100yL至EP管，加入