SeqIDNo:9)，轻链恒定区可以是kappa亚型（SeqIDNo: 10)或者Lambda亚型（SeqID No:ll)〇
[0033] 根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重 组蛋白的基因（包含His-tag或者mFc编码基因）。利用常规的分子生物学技术将合成的各 种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3. 1等)，然后利 用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等）或其它转染试剂(如PEI等）将制备的重组 蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条 件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。
[0034]His-tag融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。而mFc融合表达的重组蛋白和重组抗体用 ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的MabselectSURE等）进行一步纯化。然后利用脱盐 柱(如GE公司的Hitrapdesaulting等）将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者 其它合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20°C。
[0035] 实施例2:利用噬菌体呈现抗体库抟术筛诜和优化抗人PCSK9单抗。
[0036] 以制备的重组huPCSK9_his(以下简写为PCSK9_His)为抗原，参照文献(抗人 IL-17单克隆抗体，专利申请号201510097117. 0)，利用固相筛选策略筛选呈现人单链抗体 库的噬菌体，获得多株序列不同但特异性结合人PCSK9的人抗体，包括克隆：S2B8(SeqID No:12)，S2F5(SeqIDNo:13)，S2Gl(SeqIDNo:14)，S3A12(SeqIDNo:15)。其中重组 全抗体S3A12能够有效抑制PCSK9结合重组人LDLR胞外区EGF-AB结构域（图1)。
[0037] 然后参照文献(抗人IL-17单克隆抗体，专利申请号201510097117. 0)利用轻链置 换和重链CDRs突变的策略对抗体进行体外亲和力成熟，最终获得四株亲和力提高的抗人 PCSK9的单抗，具体序列信息见表1。
[0038] 表1:亲和力成熟的抗人PCSK9的单抗。
[0039]实施例3:Blacore3000测定全抗体的亲和力。
[0040]Aminecoulingkit和humanantibodycapturekit以及CM5 芯片和ρΗ7· 4 的 10XHBS-EP均购自GEHealthcare。
[0041] 根据试剂盒中的说明书，将抗人匕段的抗体偶联至芯片CM5的表面上，稀释抗体 蛋白至合适浓度，保证200RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。将huPCSK9设置一系列 的浓度梯度（ex. 100nm，50nm，25nm，12. 5nm，6. 25nm，3. 125nm，1. 5625nm，Onm)流经固定相表 面，测定各单克隆抗体的亲和力，用同样的方法测定Evolocumab(SeqIDNo:21，SeqID No:22)和Alirocumab(SeqIDNo:23，SeqIDNo:24 )的亲和力作为对照。结果如表2所 不。
[0042] 表2.anti_huPCSK9mAbs亲和力常数测定数值。
[0043]实施例4:抗人PCSK9单克降抗体竞争PCSK9夸体LDLR结合PCSK9。
[0044] 功能性的抗PCSK9单抗应该能在蛋白水平上阻断LDLR和PCSK9之间的结合，本实 施例分析了 6 种不同抗PCSK9 单抗（H4H4,H7B12,H8A7,H8F4，Evolocumab和Alirocumab) 抑制LDLR与PCSK9结合的能力。
[0045] 用5. 6ug/ml的PCSK9_his对各单克隆抗体进行梯度稀释，共11个稀释浓度， 前6个梯度1:1稀释，后5个梯度1:2稀释，各抗体起始浓度调整为30ug/ml。利用 HRPnouse-anti-hisIgG单抗检测LDLR与PCSK9的结合信号，然后利用GraphPadPrism 6进行数据分析和作图（图2)。
[0046]实施例5:抗PCSK9单抗在人血清中的稳宙件分析。
[0047] 为了初步分析不同抗PCSK9单抗分子的特异性及血清稳定性，进行了抗PCSK9单 抗在人血清中的稳定性分析。此研究包括6种不同抗PCSK9单抗，分别为H4H4，H7B12，H8A7， H8F4,Evolocumab和Alirocumab。取过滤去菌的单抗样品，分别稀释于200ul无菌的正常 人混合血清或PBS至终浓度30ug/ml，混匀后置37°C水浴放置12天（288小时)。12天后， 利用ELISA分析血清样品（A:Ab/normalhumanserum)，PBS样品（B:Ab/PBS)和冻存的 单抗样品（C:Ab)与huPCSK9的结合（图3 )，并分别比较各单抗样品结合huPCSK9能力的变 化(A/C)。结果(表3)表明本发明中的四株抗huPCSK9单抗具有好的血清稳定性。
[0048] 表3 :不同处理条件下单抗样品结合huPCSK9能力的变化。
[0049]实施例6:抗PCSK9单抗抑制PCSK9诱导HEK293细朐表而LDLR夸体的下调。
[0050] 本实施例研究用悬浮培养于293Freestyle培养基（Invitrogen)的HEK293细胞。 将HEK293细胞密度调整至8*10E5cells/ml，接种于24孔板（500ul/孔)。然后按照表4 所列方式处理细胞，悬浮培养3h。然后分别收集各孔中细胞，用1%BSA-PBS洗涤2次，然后 与FITC-anti-LDLR单抗（SinoBiologicalInc.Cat# 10231-R301-F)于冰上孵育45分 钟，用PBS洗涤2次后，用BD公司的AccuriC6流式细胞仪分析FITC信号。以未处理的 HEK293细胞为对照，比较各种处理后细胞表面LDLR的水平。结果（图4)显示：10ug/ml的 PCSK9处理HEK293细胞后导致细胞表明LDLR水平明显下降，而多种抗PCSK9单抗（20ug/ ml)能够明显抑制PCSK9诱导的LDLR水平下调。
[0051] 表4 :HEK293细胞的不同处理方式。
[0052]实施例7:抗PCSK9单抗抑制PCSK9诱导HEK293细朐摄取LDL-C能力的下调。
[0053] 本实施例研究用悬浮培养于293Freestyle培养基（Invitrogen)的HEK293细胞。 将HEK293细胞密度调整至8*10E5cells/ml，接种于24孔板（500ul/孔）。然后按照表5所 列方式处理细胞，悬浮培养2. 5h。然后再分别在每个孔中补加BODIPYFLLDL(Invitrogen， Cat#:L3483)至终浓度6ug/ml，继续悬浮培养2. 5h。然后分别收集各孔中细胞，用PBS洗涤 2次后，用BD公司的AccuriC6流式细胞仪分析BODIPY信号（激发波长488nM，发射波长 520)。以未处理的HEK293细胞为对照，比较各种处理后细胞摄取LDL-C的水平。结果（图 5)显示：10ug/ml的PCSK9处理HEK293细胞后导致细胞摄取LDL-C量明显下降，而多种抗 PCSK9单抗（20ug/ml)能够明显抑制PCSK9诱导的HEK293细胞摄取LDL-C水平的下调。
[0054] 表5 :HEK293细胞的不同处理方式。
【主权项】
1. 一种特异性结合人PCSK9的单克隆抗体，其包含含HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列的重 链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列为SFYNGN;所述 HCDR3序列为GYVMDX4 ;其中X1X2X3序列为AIY、TLN或者ALY;X4为I或者F;而且其中 HCDRs序列根据Chothia定义。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ IDNO: 16、17、18或19所示的氨基酸序列。3. -种特异性结合人PCSK9的单克隆抗体，其包含含IXDRUIXDR2、和IXDR3序列的轻 链可变区，其特征在于：所述IXDR1序列为RASQSINNWLD;所述IXDR2序列为AASTRPS;所述 LCDR3序列为QQDQDIPPT;而且其中LCDRs定义根据Chothia定义。4. 根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区序列如SEQ IDNO:20的氨基酸序列。5. -种特异性结合PCSK9的单克隆抗体，其包含含HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列的重 链可变区及含LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列的轻链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为 GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列为SFYNGN;所述HCDR3序列为GYVMDX4 ;所述LCDR1序列 为RASQSINNWLD;所述LCDR2 序列为AASTRPS;所述LCDR3 序列为QQDQDIPPT;其中X1X2X3 序列为AIY、TLN或者ALY;X4为I或者F;而且其中HCDRs和IXDRs序列根据Chothia定 义。6. 根据权利要求5所述的单克隆抗体，所述抗体的重链可变区序列为SEQIDNO: 16， 轻链可变区序列为SEQIDNO:20 ;或重链可变区序列为SEQIDNO:17,轻链可变区序列为 SEQIDN0:20;或重链可变区序列为SEQIDN0:18,轻链可变区序列为SEQIDN0:20;或 重链可变区序列为SEQIDNO:19,轻链可变区序列为SEQIDNO:20。7. 根据权利要求1至6所述的任何一项的抗体，其中所述抗体为全长抗体、基本上完整 的抗体、Fab片段、F(ab'）2片段或单链Fv片段。8. 根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体是全人源抗体。9. 根据权利要求1至6所述的任何一项的抗体，其中所述抗体还包含选自IgGl、IgG2 或IgG4亚型的重链恒定区和包含选自kappa或Lambda亚型的轻链恒定区。10. 根据权利要求1至6所述的任何一项的抗体，其用作药物。11. 权利要求1-6中任一项的单克隆抗体在治疗由人PCSK9介导的高胆固醇血症中的 用途。12. 根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的高胆固醇血症为原发性高胆固 醇血症、混合型尚脂血症和豕族性尚胆固醇血症。
【专利摘要】本发明公开了一种利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的新型抗人PCSK9的单克隆抗体或其片段，其特征在于对人PCSK9具有高亲和力。本发明抗体可以是全长抗体、基本上完整的抗体、Fab片段、F(abˊ)2片段或单链Fv片段。该单克隆抗体或其片段用于治疗由人PCSK9介导的疾病中的用途，所述的疾病包括但不局限于原发性高胆固醇血症、混合型高脂血症和家族性高胆固醇血症。
【IPC分类】A61P3/06, A61K39/395, C07K16/40
【公开号】CN105348390
【申请号】CN201510697260
【发明人】刘志刚, 刘玉兰, 郭晶晶, 郝小勃
【申请人】北京智仁美博生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月26日