。在一个相关方 面，提供一种治疗具有EGFR+癌细胞的受试者的方法，包括给受试者施用对EGFR+癌细胞具 有细胞毒性量的所述免疫缀合物。
[0026] 现在参考附图更详细的描述本发明的这些和其他方面，其中：
[0027] 附图简述
[0028]图1是显示裸露抗EGFR抗体及其美登素类缀合物针对角质形成细胞的细胞毒活性 的图示。将约2-3,000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养基的各种浓度 的测试物质在37°C温育5天。通过基于WST-8的比色测定确定剩余细胞的生存力。
[0029]图2是显示裸露抗EGFR抗体及其美登素类缀合物针对癌细胞系的细胞毒活性的图 示。将约2-3,000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养基的各种浓度的测 试物质在37°C温育5天。通过基于WST-8的比色测定确定剩余细胞的生存力。
[0030] 本文的图1和2是US 2012/0156217中附图的复制。
[0031]图3是显示裸露抗EGFR抗体西妥昔单抗及其美登素类缀合物针对H226癌细胞系的 细胞毒活性的图示。将约2-3，000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养基 的各种浓度的测试物质在37°C温育72h。通过阿尔玛蓝(alamar blue)细胞生存力测定确定 剩余细胞的生存力。
[0032]图4是显示裸露抗EGFR抗体西妥昔单抗及其美登素类缀合物针对A431癌细胞系的 细胞毒活性的图示。将约2-3，000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养基 的各种浓度的测试物质在37°C温育72h。通过阿尔玛蓝细胞生存力测定确定剩余细胞的生 存力。
[0033]图5是显示裸露抗EGFR抗体西妥昔单抗及其美登素类缀合物针对正常角质形成细 胞系HaCaT的细胞毒活性的图示。将约2-3，000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与 溶于培养基的各种浓度的测试物质在37°C温育5天。通过阿尔玛蓝细胞生存力测定确定剩 余细胞的生存力。
[0034]图6是显示裸露抗EGFR抗体西妥昔单抗及其美登素类缀合物针对原代角质形成细 胞的细胞毒活性的图示。将2-3，000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养 基的各种浓度的测试物质在37°C温育72h或5天。通过阿尔玛蓝细胞生存力测定确定剩余细 胞的生存力。
[0035]图7是显示裸露抗EGFR抗体帕尼单抗及其美登素类缀合物针对原代角质形成细胞 的细胞毒活性的图示。将2-3,000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养基 的各种浓度的测试物质在37°C温育72h或5天。通过阿尔玛蓝细胞生存力测定确定剩余细胞 的生存力。
[0036]图8是显示裸露抗EGFR抗体帕尼单抗及其美登素类缀合物针对原代角质形成细胞 的细胞毒活性的图示。将2-3,000个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板，并与溶于培养基 的各种浓度的测试物质在37°C温育72h或5天。通过阿尔玛蓝细胞生存力测定确定剩余细胞 的生存力。
[0037]图9-13显示掺入不是根据本文规定的标准所选元件的免疫缀合物的结果，如实施 例4所述。
[0038]图9显示帕尼单抗和西妥昔单抗是非常强的EGFR活化阻断剂，因此不会通过缀合 对正常角质形成细胞增强，而部分拮抗性抗体诸如J2898A是增强的（参见图10和11)。
[0039] 图10显示通过缀合（MGN289)，经由頂GN(J2989A)的部分拮抗性抗EGFR抗体在正 常角质形成细胞中得到增强（还可参见Setiady et al,Proceedings of the 104th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research;2013 Apr 6-10; ffashington,DC.Philadelphia(PA):AACR；Cancer Res 2013；73(8 Suppl)!Abstract nr 5463)〇
[0040]图11显示通过不可切割的接头与负载缀合(6LC-DM1)，增强了西妥昔单抗突变抗 体6-LC(具有降低的亲和力，使其成为针对EGFR的部分拮抗物）的毒性。
[00411图12显示帕尼单抗和帕尼单抗-DMl对角质形成细胞的作用，并显示通过不可切割 的接头将帕尼单抗与DMl缀合(Avid300-DM1)不增加其针对正常细胞的活性;2C9-DM1是用 作对照的西妥昔单抗-DMl缀合物。
[0042]图13显示通过可切割接头(缬氨酸-瓜氨酸)将西妥昔单抗与MMAE抗微管负载的缀 合(Cetux 2C9-MMAE)增强其针对正常细胞和MDA-MB-468癌细胞的毒性，而通过不可切割接 头(SMCC)的缀合(Cetux2C9-DMl)只增强抗癌活性，因此显示良好的治疗窗口。
[0043]优选实施方案的详细说明
[0044]本发明的免疫缀合物基于结合人表皮生长因子受体(hEGFR)的抗体，所述hEGFR是 存在于许多不同细胞类型，尤其包括皮肤细胞诸如角质形成细胞表面的蛋白。如本文使用 的，术语"hEGFR"是指包括人her-Ι基因的表达和加工产物的任意蛋白，其中所述蛋白被指 定为UniProtKB/S Wiss-ProtP00533。术语EGFR在本文中被宽泛使用，是指野生型蛋白及其 所有天然存在的变体。术语"wtEGFR"更特定地用于野生型形式的人EGFR。术语"EGFRvII Γ 是指EGFR变体蛋白，包括缺乏外显子2-7的her-1基因的变体的表达和加工产物，因此包括 仅由her-Ι的外显子1和8编码的多肽序列。术语"结构域III"与EGFRvIII无关，而是指EGFR 内的位置，表示对EGF配体结合以及高拮抗性抗体西妥昔单抗和帕尼单抗的结合非常关键 的胞外位点（Voigt et al, 2012 November; 14(11 ):1023-1031) 〇
[0045]本发明的免疫缀合物包括EGFR抗体，其是EGFR的完全拮抗物。作为"完全拮抗物" 的EGFR抗体是完全或接近完全阻断常规情况下被EGF配体刺激通过WtEGFR到WtEGFR缀合的 酪氨酸激酶的信号传导的抗体。作为完全拮抗物的EGFR抗体尤其是直接结合EGFR结构域 III的EGFR抗体。本发明的免疫缀合物尤其优选包括具有这些特性并且EGFR结合亲和力为5 纳摩(nM)或更低的EGFR抗体。通过这种标准，并且如图9所示，至少下列已知的抗体不适用 于本发明的免疫缀合物：J2898A，intellimab6-LC(W0 2012/100346教导的西妥昔单抗变 体），尼妥珠单抗(nimotuzumab)和马妥珠单抗(matuzumab)。
[0046]发现当选择完全拮抗物EGFR抗体来递送毒性负载时，杀伤作用只对EGFR+癌细胞 增强，但对EGFR+正常细胞诸如角质形成细胞不增强。当EGFR抗体是部分拮抗物，即允许一 些EGF介导信号传导的抗体时，情况不是这样。当缀合毒素时，这些部分拮抗物抗体对EGFR+ 正常细胞和EGFR+癌细胞均显示杀伤作用的增强。
[0047]在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物更具体的基于称为西妥昔单抗的hEGFR 抗体，目前可商购自礼来公司，商品名为EfbiOixli。西妥昔单抗是重组的人/小鼠嵌合IgGl 抗体，其特异性结合wtEGFR的胞外结构域。本文列出西妥昔单抗重链(SEQ ID No. 1-3)和西 妥昔单抗轻链(SEQ ID No.4-6)的⑶R的氨基酸序列。还列出西妥昔单抗的重链可变区（SEQ ID No.7)和轻链可变区（SEQ ID No.8)的氨基酸序列，以及西妥昔单抗的完整重链(SEQ ID No.9)和完整轻链(SEQ ID No. 10)的氨基酸序列。
[0048]可用于本文的西妥昔单抗变体是高度拮抗性的EGFR结合剂，其与西妥昔单抗竞争 结合人EGFR。有用的西妥昔单抗变体已经在上文提及，包括西妥昔单抗的片段，其包括西妥 昔单抗的EGFR结合位点，诸如本文描述的全部轻链和重链CDR。可用于本文的其他西妥昔单 抗变体是在抗原结合结构域之外，诸如框架区或恒定区(Fe)掺入1个、2个或更多个取代的 西妥昔单抗变体。鉴于它们相对于西妥昔单抗自身不降低细胞毒性，这类取代是良性的。
[0049] 在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物基于称为帕尼单抗的EGFR抗体，其现 在是可商购的，并以商品名出售。帕尼单抗是重组的完全人IgG2抗体，其特异性 结合wtEGFR的胞外结构域。US 6，235，883和US 7，807，798列出了帕尼单抗的重链和轻链的 氨基酸序列。帕尼单抗的有效替代物是与帕尼单抗竞争结合EGFR的其EGFR结合变体，诸如 包括其抗原结合位点但具有其他缺失或改变的恒定区的帕尼单抗片段。
[0050] 本发明的免疫缀合物还可以基于其他EGFR抗体，只要它们显示如上所述的完全拮 抗物活性，诸如选择性结合EGFR的结构域III的EGFR抗体，以及与EGF竞争并完全或接近完 全阻断EGF刺激的下游信号传导的任意其他EGFR抗体。
[0051 ]在本发明的免疫缀合物中，完全拮抗物EGFR抗体，诸如西妥昔单抗或帕尼单抗缀 合到抗微管毒素诸如美登素类毒素。"抗微管毒素"表示具有细胞毒性的物质，所述细胞毒 性通过干扰对细胞有丝分裂重要的微管结构来介导，诸如通过抑制微管蛋白的形成或抑制 其组建。
[0052]该毒素家族包括美登素类和奥里斯他汀，以及近年来开发的具有相同作用机制的 许多其他物质。奥里斯他汀具体来说通过抑制微管蛋白的聚合来阻断细胞复制，因此是抗 有丝分裂的。可用于本文并称为MMAE或vedotin的奥里斯他汀的结构如下所示：
[0054]存在美登素类的各种有效形式。这些全部基于天然分子美登素(maytansine)的复 杂结构。
[0055]尤其有用的是包括DM-I和DM-4的美登素类。在一个具体实施方案中，偶联至EGFR MAb的毒素是具有下文所示结构的DM-I。
[0056]还可作为抗微管毒素使用的是do Io s tat in、奥里斯他汀、tubu Iy s in和 cryptophycin。各类有效物质的具体实例包括do Iostatin 10、单甲基do Iostatin 10、奥里 斯他汀E、单甲基奥里斯他汀E (丽A E )、奥里斯他汀F、单甲基奥里斯他汀F、H TI - 2 8 6、 tubulysin M以及微管蛋白结合剂诸如tubulysin IM_l、tubulysin IM_2、tubulysin IM-3、秋水仙碱DA和美登素类AP-3、DM-I和DM-4。
[0057]可以使用目前已知的或今后发展的偶联"不可切割"的接头的任何技术形成完全 拮抗物EGFR抗体，诸如西妥昔单抗或帕尼单抗和抗微管毒素，诸如美登素类或奥里斯他汀 的缀合物。在给受试者施用后通常遇到的条件下(包括胞外环境），这些接头保持完整，并保 留抗体和毒素的共价结合。更具体地，不可切割的接头产生ADC构建体，通过胞内溶酶体破 坏抗体来实现细胞毒性负载的释放。
[0058] 接头整合的方法例如描述于US 5,208,020;US 8,088,387和US 6,441，163。一种 优选的方法是利用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧酸酯（SMCC)修饰 EGFR抗体，例如西妥昔单抗，以引入马来酰亚胺基，然后将修饰抗体与包含硫醇的美登素类 反应以获得硫醚连接的缀合物。获得的化学结构如下所示。每抗体分子缀合1到10个药物分 子。
[0060]不可切割接头的其他有用形式包括N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯（SIA)、硫代-SMCC、 m-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、硫代-MBS和琥珀酰亚胺基-碘乙酸酯，如 文献所述，以引入 1-10个反应基团。（参见，Yoshitake et al, 101 Eur