修饰。在室温搅拌条件下， 在含DMS0(5%v/v)的缓冲液A(95%v/v)中进行反应。
[0137] E .G25层析以去除过量的SMCC
[0138]利用缓冲液A平衡的1.5X4.9cm Sephadex G25树脂的预填充柱凝胶过滤帕尼单 抗-SMCC反应混合物。加载和洗脱体积参照制造商的说明书(Amersham Biosciences)。使用 如上所述的消光系数通过分光光度法测定修饰抗体溶液的浓度。
[0139] F.帕尼单抗-SMCC与DMl的缀合
[0140] 将修饰抗体与比接头(假定5个接头每抗体)1.7倍过量的DMl反应。在含DMA(6%v/ V)的缓冲液A的10mg/ml抗体浓度(94 % v/v)进行反应。在添加 DMl后，反应在室温搅拌条件 下温育16.5小时。
[0141] G.通过G25层析的缀合纯化
[0142] 利用IX磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH 6.5(缓冲液B)平衡的1.5X4.9cm Sephadex G25树脂的预填充柱凝胶过滤缀合反应混合物。加载和洗脱体积参照制造商的说明书 (Amersham Biosciences)。通过在252nm和280nm测量洗脱材料的吸光度，确定每摩尔帕尼 单抗连接的DMl分子数目。发现DMl/抗体比例是2和4。分析所获缀合物的结合和细胞毒性。
[0143] H.帕尼单抗-SMCC-DMl的检测
[0144] 用于这些研究的细胞系具有下列特征：
[0145] MDA-MB-468:乳腺(mammary gland)/乳房(breast);来源于转移部位:胸膜积液； 获自ATCC;在添加胎牛血清至10%终浓度的ATCC配制的Leibovitz's L-15培养基(Catalog No. 30-2008)中按照4000细胞/孔，100μΙ/孔接种于96孔板。
[0146] HaCaT:来自组织学正常皮肤的体外自发转化的角质形成细胞;获自武汉大学的中 国典型培养物保藏中心；在DMEM-10%FBS中按照2000细胞/孔，100μΙ/孔接种于96孔培养 板。
[0147] 利用角质形成细胞的体外试验显示，帕尼单抗与抗微管毒素通过不可切割接头的 缀合不增强抗体的毒性。获得的ADC具有与裸露帕尼单抗以及基于完全拮抗性抗体西妥昔 单抗的另一个ADC类似的对角质形成细胞的安全性模式。作为抗体与抗微管毒素通过不可 切割接头缀合的结果，观察到帕尼单抗显著增强的针对MDA-MB-468癌细胞的抗癌活性。与 毒性观察类似，基于帕尼单抗的ADC与基于西妥昔单抗的ADC活性类似。
[0148] 实施例4:部分拮抗性EGFR Mab缀合物的结果
[0149] 选择不同于本文那些推荐的免疫缀合物组分的效果在附图中显示。图9显示当缀 合DM-I时，部分拮抗性EGFR抗体(称为J2989A)具有增强的对正常角质形成细胞的活性。类 似地，图10显示，当缀合DM-I时，另一个部分拮抗物抗体(称为6-LC(西妥昔单抗的取代变 体，具有更低的对EGFR的相对亲和力））也具有增强的对正常角质形成细胞的活性。图11显 示，当缀合DMl时，帕尼单抗对角质形成细胞的作用不增强，而缀合物的抗癌作用显著增强 (图12)。并且，图13显示，西妥昔单抗通过可切割接头（缬氨酸-瓜氨酸）与MMAE的缀合增强 其针对正常细胞和MDA-MB-468癌细胞的毒性，而通过不可切割接头(SMCC)的缀合增强抗癌 活性。
[0150] 因此，在这些研究中，只有通过不可切割接头的负载缀合的完全拮抗性抗EGFR抗 体不对正常细胞增强，而通过缀合，部分拮抗物EGFR抗体针对正常细胞的毒性增强。此外， 我们随后检测了可切割vs.不可切割接头对该活性模式的影响，并维持负载的作用机制相 同（即抗微管物质）。将抗体通过可切割接头缀合到抗微管负载，如Doronina等人描述的 MMAE(Nature Biotechnology Nov 7,2003，V〇1 21:pp 778-784)。可切割接头数据显不，当 完全拮抗性抗体通过可切割接头缀合它们的负载时，它们针对正常细胞的毒性被增强。因 此，安全的抗EGFR ADC应当包括通过不可切割接头连接抗微管负载的强拮抗性抗EGFR抗 体。
[0151] 权利要求的范围不应受到实施例所述的优选实施方案的限制，但应当给出作为整 体符合说明书的最宽泛的解释。
[0152] 参照序列
[0153] SEQ ID No.描述
[0154] 1西妥昔单抗重链⑶Rl
[0155] NYGVH
[0156] 2西妥昔单抗重链⑶R2
[0157] VIffSGGNTDYNTPFTS
[0158] 3西妥昔单抗重链⑶R3
[0159] ALTYYDYEFAY
[0160] 4西妥昔单抗轻链⑶Rl
[0161] RASQSIGTNIH
[0162] 5西妥昔单抗轻链⑶R2
[0163] ASESIS
[0164] 6西妥昔单抗轻链⑶R3
[0165] QQNNNWPTT
[0166] 7西妥昔单抗重链可变区(Vh)
[0167] QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
[0168] 8西妥昔单抗轻链可变区(Vl)
[0169] DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINS VESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK
[0170] 9西妥昔单抗完整重链
[0171] QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQ VFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0172] 10西妥昔单抗完整轻链
[0173] DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINS VESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
【主权项】
1. 一种用于增强EGFR抗体或其EGFR结合片段对EGFR+疾病细胞的细胞毒性但不增强其 对正常EGFR+细胞的细胞毒性的方法，所述方法包括： (i)选择用于缀合的EGFR抗体，或所述抗体的EGFR结合片段，所述抗体是完全EGFR拮抗 物并与西妥昔单抗竞争结合EGFR; (ii)选择通过EGFR抗体或其片段递送的抗微管毒素； (iii)选择用于偶联所选EGFR抗体和抗微管毒素的接头;和 产生一种免疫缀合物，其在抗体和毒素之间掺入接头，从而提供具有细胞毒性的免疫 缀合物，所述细胞毒性针对EGFR+疾病细胞增强，但针对EGFR+角质形成细胞基本上不增强。2. 权利要求1的方法，其中所选完全拮抗物EGFR抗体是西妥昔单抗或帕尼单抗。3. 权利要求1或2的方法，其中所选抗微管毒素是美登素类。4. 权利要求1、2或3的方法，其中所选接头是不可切割的接头，优选SMCC。5. -种免疫缀合物，包括（i)与西妥昔单抗结合的EGFR表位结合的完全拮抗物EGFR抗 体，或所述抗体的EGFR结合片段或基于所述抗体的单链多肽，和（ii)与其缀合的抗微管毒 素，所述免疫缀合物相对于所述抗体的裸露形式具有细胞毒性作用，所述细胞毒性作用（1) 针对EGFR+癌细胞增强，和(2)针对EGFR+角质形成细胞基本上不改变，其中抗体和毒素通过 接头缀合。6. 权利要求5的免疫缀合物，其中所述抗体是西妥昔单抗或在恒定区中包括1个、2个或 更多个良性取代的西妥昔单抗变体。7. 权利要求5的免疫缀合物，其中所述抗体是帕尼单抗。8. 权利要求5、6或7的免疫缀合物，其中所述抗微管毒素是美登素类。9. 权利要求8的免疫缀合物，其中所述抗微管毒素是DM-1。10. 权利要求5-9的免疫缀合物，其中所述接头是不可切割的接头，优选琥珀酰亚胺基 4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。11. 权利要求5的免疫缀合物，其是西妥昔单抗-SMCC-DM1。12. 权利要求5的免疫缀合物，其是帕尼单抗-SMCC-DM1。13. -种药物组合物，包括对EGFR+疾病细胞具有细胞毒性量的权利要求5-12的免疫缀 合物，以及药学上可接受的载体。14. 一种用于产生抗癌组合物的方法，包括将药学上可接受的载体与缀合于抗微管毒 素以形成免疫缀合物的EGFR抗体组合的步骤，所述免疫缀合物相对于裸露抗体对癌细胞和 角质形成细胞的作用来说，具有对癌细胞增强的作用和对角质形成细胞基本上未增强的作 用。15. 权利要求13的药物组合物的用途，用于治疗EGFR+疾病细胞。16. -种治疗具有EGFR+疾病细胞的受试者的方法，包括给受试者施用对EGFR+疾病细 胞具有细胞毒性量的权利要求5-12的免疫缀合物。17. 权利要求16的方法，其中所述EGFR+疾病细胞是EGFR+癌细胞，诸如头颈癌细胞或结 肠直肠癌细胞。18. -种用于增强完全拮抗物EGFR抗体对EGFR+疾病细胞的作用但不增强其对正常 EGFR+细胞的作用的方法，包括将抗体与抗微管毒素通过不可切割的接头进行连接。19. 在一种用于治疗受试者的方法中，所述受试者存在对完全拮抗物EGFR抗体的治疗 应答的肿瘤，其中所述治疗引发EGFR抗体介导的角质形成细胞的有害应答，改进包括利用 与抗微管毒素缀合形式的完全拮抗物EGFR抗体治疗所述受试者，由此相对于利用单独的裸 露抗体的治疗，对利用缀合抗体的治疗的肿瘤应答被实质增强但不增强对治疗的角质形成 细胞有害应答。
【专利摘要】将美登素类通过不可切割的接头与作为完全EGFR拮抗物的EGFR抗体，诸如西妥昔单抗或帕尼单抗共价连接。结果获得具有在癌细胞中增强但在正常细胞中不增强的细胞毒性的抗癌剂。在作为部分拮抗物的EGFR抗体中或未被溶酶体加工的毒素中没有观察到这种益处。
【IPC分类】C07K16/28, A61K47/48, A61P35/00
【公开号】CN105473616
【申请号】CN201480038307
【发明人】I·A·蒂霍米罗夫
【申请人】形成生物产品有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年7月4日
【公告号】CA2915897A1, EP3016980A1, WO2015000062A1