M DTNB (I/100体积）。针对空白试剂测量412nm处吸光度的增加，并使用14150/M/cm的消光系数计 算浓度。使用源自Elman ' s测定的-SH浓度表示DMl储液浓度来计算缀合条件。
[0095] D.利用SMCC交联剂修饰西妥昔单抗
[0096]以20mg/ml抗体使用7.5倍摩尔过量的SMCC对抗体进行修饰。在室温搅拌条件下， 在含DMS0(5%v/v)的缓冲液A(95%v/v)中进行反应。
[0097] E .G25层析以去除过量的SMCC
[0098]利用缓冲液A平衡的1.5X4.9cm Sephadex G25树脂的预填充柱凝胶过滤西妥昔 单抗-SMCC反应混合物。加载和洗脱体积参照制造商的说明书(Amersham Biosciences)。使 用如上所述的消光系数通过分光光度法测定修饰抗体溶液的浓度。
[0099] F.西妥昔单抗-SMCC与DMl的缀合
[0100] 将修饰抗体与比接头(假定5个接头每抗体)1.7倍过量的DMl反应。在含DMA(6%v/ v)的缓冲液A中以10mg/ml抗体浓度(94 % v/v)进行反应。在添加 DMl后，反应在室温搅拌条 件下温育16.5小时。
[0101] G.通过G25层析的缀合纯化
[0102] 利用IX磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH 6.5(缓冲液B)平衡的1.5X4.9cm Sephadex G25树脂的预填充柱凝胶过滤缀合反应混合物。加载和洗脱体积参照制造商的说明书 (Amersham Biosciences)。通过在252nm和280nm测量洗脱材料的吸光度，确定每摩尔西妥 昔单抗连接的DMl分子数目。发现DMl/抗体比例是2和4。分析所获缀合物的结合和细胞毒 性。
[0103] H.西妥昔单抗-SMCC-DMl的检测
[0104] 用于这些研究的细胞系具有下列特征：
[0105] A431:人上皮外阴癌细胞系；获自ATCC;在DMEM-IO %FBS中按照4000细胞/孔，100μ 1/孔接种于96孔板。
[0106] Η226:肺鳞状细胞癌细胞系；获自ATCC;在RPMI-IO % FBS中按照4000细胞/孔，100μ 1/孔接种于96孔培养板。
[0107] MDA-MB-468:乳腺(mammary gland)/乳房(breast);来源于转移部位:胸膜积液； 获自ATCC;在添加胎牛血清至10%终浓度的ATCC配制的Leibovitz's L-15培养基(Catalog No. 30-2008)中按照4000细胞/孔，100μ1/孔接种于96孔板。
[0108] HaCaT:来自组织学正常皮肤的体外自发转化的角质形成细胞;获自武汉大学的中 国典型培养物保藏中心；在DMEM-10%FBS中按照2000细胞/孔，100μ1/孔接种于96孔培养 板。
[0109] HEKa:正常人原代表皮角质形成细胞，成人;获自PromoCell GmbH;在EpiLife培养 基中按照4000细胞/孔接种，100μ1/孔，EpiLife培养基撕EP1500CA，Invitrogen+HKGS人角 质形成细胞生长补充剂(#S-001-5)
[0110] 结合研究显示，抗体与DMl的缀合不影响KD;通过表面等离子体共振法（~0.3nM， 表1)，裸露西妥昔单抗抗体和西妥昔单抗-SMCC-DMl缀合物具有相同的对EGFR的结合亲和 力。样品体外细胞毒性的鉴定显示，与西妥昔单抗相比，西妥昔单抗-SMCC-DMl针对癌细胞 系的细胞毒性显者更尚（图3&4)，但出人意料的，西安昔单抗-SMCC -DMl和裸露西安昔单抗 具有相同的针对角质形成细胞的细胞毒活性(图5和6)。
[0111] 表1:与DMl的缀合对西妥昔单抗Kd的影响
[0113] 在ImmunoGen's公开的US专利申请2012/0156217中显示DMl缀合对不同EGFR MAbs (huML66和huEGFR-7R)的影响，本文的图1和2是该申请中附图的复制。更具体的，如图1所 示，抗EGFR抗体huML66-SMCC-DMl和huEGFR-7R与美登素类的缀合产生huML66-SMCC-DMl和 huEGFR-7R-SMCC-DMl免疫缀合物，增加针对正常角质形成细胞的细胞毒活性。类似地，与预 期一致，抗EGFR抗体huML66和huEGFR-7R与美登素类的缀合产生huML66-SMCC-DMl和 huEGFR-7R-SMCC-DMl免疫缀合物，显著增强所述抗体针对H226癌细胞系的细胞毒活性（图 2)〇
[0114] 如图3和4所示，抗EGFR抗体西妥昔单抗(HC-LC)的DMl缀合产生西妥昔单抗-SMCC-DMl免疫缀合物(HC-LC/DM1 )，显著增强所述抗体针对癌细胞的细胞毒活性，与预期一致，并 显示于图3。如图4所示，并且与预期一致，抗EGFR抗体西妥昔单抗(HC-LC)与美登素类的缀 合产生西妥昔单抗-SMCC-DMl免疫缀合物(HC-LC/DM1 )，显著增强所述抗体针对癌细胞的细 胞毒活性。
[0115] 但是，相当出人意料的，如图5和6所示，抗EGFR抗体西妥昔单抗(HC-LC)与美登素 类的缀合产生西妥昔单抗-SMCC-DMl免疫缀合物(HC-LC/DM1)，不增加 针对角质形成细胞的 细胞毒性，反映在这些物质基本上相同的IC5q值(缀合物的IC5q为0.8269vs.裸露抗体的IC 50 为0.4324;图5,HaCaT-正常人角质形成细胞系&缀合物的IC5q为2.210vs.裸露抗体的1(： 50为 0.9348,图6;HEKa-原代人角质形成细胞）。如本文使用的，IC5q是指杀伤50%细胞所需的药 物浓度。
[0116] 利用阿尔玛蓝细胞生存力测定(每次实验在96孔板中重复3次），通过比较IC5q值测 定细胞毒性是否增加。在一个log数级范围内的差异被认为是不显著的，被看作不显示细胞 毒性的变化，而大于一个log数级范围的差异显示细胞毒性的显著变化。
[0117] 实施例2:灵长类动物中的评估
[0118]猕猴属先前已被证明是鉴定抗EGFR抗体毒性，包括皮肤副作用的有价值和高度预 测性的模型。关于EGFR祀向抗体的猕猴和人毒性数据之间高水平的相关性部分归因于猴和 人EGFR受体之间的高度同源性，导致针对抗体的非常类似的Kd值：
[0119]表1:西妥昔单抗和帕尼单抗对人和猕猴EGFR的结合亲和力是跨种属一致的。表观 抗体亲和力被定义为，在利用人EGFR(huEGFR)和猕猴EGFR(cyEGFR)的重组胞外结构域的 ELISA中实现最大结合的一半需要的抗体浓度（皮摩尔，pM)。改编自Koefoed et al, MABs.201INov-Dec;3(6):584-595。
[0121]尤其在灵长类动物中检验西妥昔单抗-SMCC-DMl免疫缀合物通过缀合毒素对正常 细胞的任意显著增强的抗体副作用。具体来说，对于皮肤副作用给与密切关注，其是相对于 裸露完全拮抗物抗EGFR抗体的预期，性质不同和/或显著加重。
[0122] 研究最初利用2只猕猴恒河猴，均为雄性，用氯胺酮镇静并用异氟烷麻醉，以便静 脉内施用抗体-药物缀合物，按照l〇mg/kg施用。然后观察动物5天，随后处死以检查全身急 性毒性症状，并做进一步检查。
[0123] 除了利用裸露西妥昔单抗治疗预期的那些副作用以外，详细的组织病理学分析未 显示严重的皮肤毒性或其他严重的和性质上新的皮肤副作用。此外，在这些动物中没有观 察到其他严重的对靶标的毒性，证明本发明ADC的安全性和没有裸露抗体毒性的显著加重。
[0124] 在成功完成急性灵长类动物研究后，已经在其他动物中开始重复-剂量的安全性 研究。按照l〇mg/kg剂量，每三周施用一次ADC，共4个周期。这种剂量和方案的选择是基于灵 长类动物和人类中利用其他ADC经常使用的给药方案（Poon KA et al ,Preclinical safety profile of trastuzumabemtansine(T-DM1):mechanism of action of its cytotoxic component retained with improved tolerability.Toxicol Appl Pharmacol.2013 Dec I；273(2):298-313；FDA Package Insert for Kadcyla?,accessed February 24,2014:http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/ 1254271bl.pdf)。
[0125] 除了可逆的肝酶升高(其是ADCs的预期副作用类型)外，在目前进行的研究中没有 观察到利用裸露西妥昔单抗治疗已经预期的那些副作用之外的其他严重的和/或性质上新 的皮肤或其他对靶标的副作用（西妥昔单抗猕猴数据获自：h t t p : / / www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/bla/2004/125084_ERBITUX_PHARMR_ P3.PDF)。在本研究中没有观察到先前报道的利用抗CD44v6 ADC的严重的皮肤毒性和毒性 表皮坏死溶解（其也利用SMCC-DMl负载技术，并靶向正常角质形成细胞表达的抗原） (Ti jink et al ·，Cl in Cancer Res，2006，12:6064)。这些安全性数据进一步证实体外结 果，完全拮抗物裸露抗EGFR抗体对靶标的毒性不因为缀合细胞毒性负载而显著增强。
[0126] 实施例3:帕尼单抗-SMCC-DMl缀合物的制备(A-H)
[0127] 基本上按照如上关于西妥昔单抗对应物的描述制备缀合DM-I的帕尼单抗。更具体 的，
[0128] A.帕尼单抗抗体的制备和测量
[0129] 帕尼单抗获自开放市场，或按照US 6,235,883或US 7,807,798所述产生，用于利 用不可切割异型双功能交联剂SMCC来缀合DMl。
[0130] 然后将帕尼单抗抗体缓冲液置换为50mM磷酸钾，50mM氯化钠，2mMEDTA;pH6.5缓 冲液(缓冲液A)。使用生色鲎属阿米巴细胞溶解产物(LAL)方法(Cambrex)来验证本实验的 所有缓冲液不含内毒素。使用280nm的1.45mL/mg/cm消光系数和145，781g的分子量测量抗 体浓度。
[0131] B. SMCC储液的制备和测量
[0132] 在DMSO中制备20mM SMCC(6·69mg/mL)(Concortis Biosystems Corp·)溶液。该溶 液用测定缓冲液进行1/40稀释，测量样品在302nm的吸光度。使用602/M/cm的摩尔消光系数 计算储液浓度。
[0133] C. DMl储液的制备和测量
[0134] 在DMA(7.37mg/mL)中制备IOmM DMl(游离疏基形式；Concortis Biosystems Corp.)溶液。在280nm测量储液在乙醇中的稀释液的吸光度。使用280nm处5700/M/cm的摩尔 消光系数计算储液DMl的浓度。使用Elman ' s试剂(DTNB)测量储液DMl制品中游离-SH的浓 度。在测定缓冲液中制备储液的稀释液到3 % (v/v)DMA，然后添加溶于DMSO的IOOmM DTNB (I/100体积）。针对空白试剂测量412nm处吸光度的增加，并使用14150/M/cm的消光系数计 算浓度。使用源自Elman ' s测定的-SH浓度表示DMl储液浓度来计算缀合条件。
[0135] D.利用SMCC交联剂修饰帕尼单抗
[0136] 以20mg/ml抗体使用7.5倍摩尔过量的SMCC对抗体进行