【具体实施方式】
[0024] 以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的【具体实施方式】。
[0025] 实施例：
[0026] (1)人骨髓间充质干细胞体外培养与增殖，细胞生长融合至80%_90%，去除原有 DMEM培养基，磷酸盐缓冲液冲洗2-3次，加入胰蛋白酶进行细胞消化1-1.5min，显微镜观察 大部分细胞变成圆点浮起，加入3mL新培养基(含10 %胎牛血清)终止胰酶消化，收获细胞； [0027] (2)人骨髓间充质干细胞接种与体外暴露，在步骤（1)获得细胞经离心，弃上清，加 入培养基，轻轻地混匀细胞，细胞计数并调节细胞密度至2X105个/mL，接种于12孔板中，每 孔加入lmL细胞悬液;24h后，分别用甲磺酸甲酯(暴露浓度6.75-27yg/mL)和烯啶虫胺(暴露 浓度250-1250yg/mL)进行48h暴露处理；
[0028] (3)人骨髓间充质干细胞总RNA提取，收获经步骤(2)处理的细胞，使用RNA快速提 取试剂盒对细胞进行裂解、离心、清洗、再离心、再清洗、空转离心、洗脱RNA、离心提纯，获得 总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA浓度，RNA浓度计算公式为：
[0029] RNA 浓度=0D260 X 稀释倍数 X 0 · 04yg/yL
[0030] RNA 纯度：0D260/0D280 = 1 · 8-2 · 1;
[0031] (4)人骨髓间充质干细胞总RNA反转成cDNA，：获得的总RNA可立即反转成cDNA或总 RNA可在-80°C保存1周内再进行反转录，根据反转录试剂盒反转录体系加样如表1，用PCR仪 进行反转录条件为42°C孵育15min，85°C加热5s，获得cDNA;
[0032]表1反转录反应体系
[0033]
[0034] (5)人骨髓间充质干细胞实时定量聚合酶链式反应(RealTime-qPCR)检测，以步骤 (4)得到的cDNA作为模板用RT-qPCR试剂盒检测DNA损伤通路上p53等基因表达变化情况， PCR反应体系如表2，引物序列参考如表3。采用SYBR实时荧光PCR方法扩增，PCR程序为，1个 循环:94°C，30s;94°C，5s;60°C，15s;72°C，10s，40个循环。每个样品的内参基因和目的基因 相同条件扩增，PCR反应结束后进行融解曲线分析，以排除非特异性PCR产物的污染。
[0035]表2实时定量反应体系
[0036]
[0037] 表3内参基因及目的基因引物序列及长度
[0038]
[0039] (6)RT_PCR数据采用ΤΛΛετ法进行分析，目的基因的CT值首先减去对应内参基因 GATOH的CT值，即（Δ CT = CT目的基因-CT内参基因）；之后，暴露处理组目的基因的Δ CT值再 减去对照组目的基因的Δ CT值，即（Δ Δ CT= Δ CT处理组-Δ CT对照组）。目的基因在暴露染 毒组相对于对照组的表达水平为2^ACT。
[0040]结果说明：图1是内参基因 GAPDH和遗传毒性标志基因的熔解曲线，说明被扩增的 目的基因特异性良好，不存在其他非特异性基因的干扰；图2是遗传毒性模式化学物-甲磺 酸甲酯对人骨髓间充质干细胞标志基因表达水平的影响，在甲磺酸甲酯浓度为6.75yg/mL 时ATM和ATR基因表达显著升高，甲磺酸甲酯浓度为13.5yg/mL时，p53、p21和Bax基因表达显 著升高，甲磺酸甲酯浓度为27yg/mL时，Gadd45a和H2AX基因表达显著下调。没有检测结果说 明，在典型遗传毒物甲磺酸甲酯的作用下，人骨髓间充质干细胞中所述标志基因发生差异 表达，并具有剂量-效应关系，能够准确、有效的对遗传毒性效应进行预测。图3是烯啶虫胺 对人骨髓间充质干细胞标志基因表达水平的影响，在烯啶虫胺浓度为250yg/mL时，p53基因 表达显著上调，在烯啶虫胺浓度为625yg/mL时，Bax基因表达显著上调，ATR基因和H2AX基 因随剂量的增加表达有上调的趋势，说明烯啶虫胺暴露剂量大于250yg/mL对人骨髓间充质 干细胞造成潜在遗传毒性。综上，人骨髓间充质干细胞ATM、ATR、p53等基因作为标准物用于 检测化学品以及环境样品潜在遗传毒性检测具有快速、灵敏、早期预测性的特点。
【主权项】
1. 一种用人骨髓间充质干细胞预测遗传毒性的方法，其特征在于，步骤如下： (1) 人骨髓间充质干细胞体外培养与增殖，培养至人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底 部50 %以上，冲洗培养基，加入胰蛋白酶进行消化，收获人骨髓间充质干细胞； (2) 人骨髓间充质干细胞接种与体外暴露：调节步骤（1)获得人骨髓间充质干细胞密度 至0.1 X 106-1 X 106个/mL，接种于孔板中，培养24h，待人骨髓间充质干细胞适应培养环境， 对其进行体外化学品暴露处理； (3) 人骨髓间充质干细胞RNA提取，收获经步骤(2)处理的细胞，提取总RNA; (4) 采用实时定量PCR进行所述生物标志基因的mRNA表达的检测。
【专利摘要】本发明提供了一种利用人骨髓间充质干细胞预测化学品和环境样品潜在遗传毒性的快速的、具有早期预测性的、基于生物标记物的筛选方法，通过本发明提供的ATM、ATR、p53、p21、H2AX、Gadd45a、Bax基因标志物中的一种或多种预测受试物的遗传毒性。通过化学品或环境样品与hBMSCs进行接触暴露，通过实时定量聚合酶链式反应法作为检测基础，定量检测所述基因标志物的表达量的变化程度，来判断受试物潜在遗传毒性。本发明成功解决遗传毒性评价中动物实验和体外实验存在的实验周期长、遗传毒性检测终点滞后、实验结果外推到人体存在种属差异等问题，为化学品和环境样品遗传毒性检测提供了一种高效、灵敏、准确的评价方法。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/02
【公开号】CN105567829
【申请号】CN201610053920
【发明人】刘薇, 崔晓宇, 秦会
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月26日