[0037] 丟 1
[0038]
[0039] 将PCR产物和表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Κρη I和Spe I双酶切，回收后，将PCR产物和表达载体以（3~5): 1的比例用T4DNA连接酶在16 °C连接12h 构建重组表达载体PHY300-印sDEF(如图1)。
[0040] 实施例2:地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1的构建
[00411将PHY300-epsDEF过表达质粒经提取及浓缩后，电击转化地衣芽孢杆菌，37 °C复苏 5h后，涂布四环素抗性平板，再在37°C培养12h，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用PCR 及双酶切进行验证(如图2和3)。从而获得过表达糖基转移酶基因 epsDEF的地衣芽孢杆菌工 程菌 HN301-1。
[0042]电转化具体步骤如下：
[0043]地衣芽孢杆菌感受态的制备：
[0044] (1)在50mL LB培养基中接种一环B. licheniformis，37°C，200r min-1 过夜培养 12h；
[0045] (2)取过夜培养液lmL接入50mL生长培养基中，于37°C，200r/min培养至对数中后 期，直到细胞0D6QQ达到0.85~0.95;
[0046] (3)细胞冰浴30min，停止生长后，（取预先预冷的50mL干净离心管，加入40mL停止 生长的培养液)再于4°C以6000r/min离心收获细胞；
[0047] (4)用冰冷(0 °C冰水浴）的EP缓冲液40mL悬浮细胞四次(每次都在0 °C冰水浴中晃 动，使沉淀悬浮，可用枪轻轻吹吸），并最终将细胞悬浮于lmL EP缓冲液中，使细胞浓度达到 1 ~1.3X1010CFU mL-S
[0048] (5)将感受态细胞分装于1.5mL离心管(预冷过的）中，每管100yL，再直接进行下一 步实验或_70°C保存感受态；
[0049] 地衣芽孢杆菌的电转：
[0050] (1)将感受态细胞和1~5yg质粒混合物转移到冰冷的0.1cm间隙的电击池中；
[0051 ] (2)以 1800V、5ms 脉冲转化；
[0052] (3)迅速往电击池中加入lmL复苏培养基，将菌悬液回收到5mL离心管中，于37°C， 200r min-1 培养5h;
[0053] (4)将菌液涂布在抗性平板上，于37°C培养直到平板上出现菌落。
[0054] 实施例3:利用地衣芽孢杆菌及其基因工程菌发酵制备多糖絮凝剂
[0055] 将地衣芽孢杆菌CGMCC 2876出发菌株和实施例2所述基因工程菌接种于液体种子 培养基中，37°C，200r mirT1培养16h，制备种子培养液，以4 % (V/V)的接种量接种于多糖絮 凝剂发酵培养基中，37°C，200r mirT1培养，进行发酵产多糖絮凝剂实验。56h后分别测定发 酵液絮凝活性及多糖絮凝剂产量，并绘制生长曲线图（如图4和5) ^psDEF基因过表达重组 基因工程菌发酵液的最终絮凝活性为5332U/mL，比原菌株发酵液最终絮凝活性2806U/mL提 高90%;epsDEF基因过表达重组基因工程菌多糖絮凝剂的粗提产量为10.44g/L，较原菌株 粗提产量8.17g/L提高了 27.8 %。
[0056]生物絮凝剂的絮凝活性可采用以下方法测定：
[0057] 称取高岭土粉末0.2g与50mL刻度试管中，依次加入2.5mLCaCl2溶液（10g/L)和lmL 待测液，蒸馏水加至与刻度线平齐。充分混合后，迅速置于比色皿中，静置5min后，用紫外可 见分光光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水做空白测定。计算公式如下：
[0058] 絮凝活性(U/mL) = (B_A)/B X 100 XD
[0059] 式中，A:待测样品的OD55Q值，B:空白培养基的OD55Q值，D:发酵液稀释倍数。
[0060]生物絮凝剂的提取纯化方法：
[0061 ] (1)取10mL发酵液8000rpm离心5min，除菌体，收集上清液，重复操作两次。
[0062] (2)上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4°C条件下静置12h。
[0063] (3) 8000rpm离心1 Omin，弃上清液，加1 OmL去离子水溶解。上清液中加入3倍体积的 无水乙醇，4°C条件下静置12h后，离心弃上清液。
[0064] (4)冷冻真空干燥。
[0065] 本发明所述高产多糖絮凝剂的基因工程菌HN301是在产胞外多糖的地衣芽孢杆菌 中过表达epsDEF基因的基因工程菌，其中所述epsDEF基因为糖基转移酶基因 epsD、epsE、 epsF三个串联在一起的基因簇，其核苷酸序列如序列表中所述。本发明构建的高产多糖絮 凝剂的基因工程菌经发酵56h后絮凝活性可达到5332U ml/1，比出发菌株的絮凝活性(2806U ml/1)提高了 1.9倍，多糖絮凝剂粗产量提高了 27.8%。可望用于多糖絮凝剂的工业化生产， 提高产量降低成本。
【主权项】
1. 高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1，其特征在于是在产胞外多糖 的地衣芽孢杆菌(Bacillus lichen if ormi s)中过表达epsDEF基因的基因工程菌； 所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。 2. epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No: 1所示。3. 如权利要求1所述高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌的制备方法，其特征 在于其具体步骤如下： 将epsDEF基因克隆到表达载体上获得重组表达载体，将所得重组表达载体通过电转化 的方法导入到产胞外多糖的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中即获得高产多糖 絮凝剂的基因工程菌Bacillus licheniformis HN301-1。4. 多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下： 将高产多糖絮凝剂的基因工程菌Bacillus licheniformis HN301-1发酵培养，收集发 酵液，提纯，即得多糖絮凝剂。5. 如权利要求4所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养的温度为30~ 40°C，发酵培养的时间为48~60h。6. 如权利要求5所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养的温度为35~ 40°C，发酵培养的时间为50~60h。7. 如权利要求6所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养的温度为37°C， 发酵培养的时间为56h。8. 如权利要求4所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述提纯的方法为:采用乙醇 提取，离心速度为6000~8000rpm，离心时间为10~15min，离心温度为4°C;所述乙醇的用量 按体积比可为发酵液的3倍。9. 重组表达载体的构建方法，其特征在于将所述epsDEF基因的核酸分子与表达载体 PHY300PLK-PamyL-TTamyL质粒分别用限制性内切酶Κρη I和Spe I双酶切，形成互补的粘性 末端，分别纯化后经T4DNA连接酶，形成本发明所述重组表达载体，将所得的重组表达载体 命名为PHY300-印sDEF。10. 如权利要求4所述方法制备的多糖絮凝剂在污水处理和食品工程中应用。
【专利摘要】高产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，属于基因工程及微生物发酵技术领域。基因工程菌是在地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)中过表达epsDEF基因的基因工程菌。epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？No？1。基因工程菌制备：将epsDEF基因克隆到表达载体上获得重组表达载体，将重组表达载体通过电转化方法导入产胞外多糖的地衣芽孢杆菌中即得高产多糖絮凝剂的基因工程菌。多糖絮凝剂的制备：将基因工程菌发酵培养，收集发酵液，提纯，即得多糖絮凝剂。基因工程菌在发酵过程中发酵液絮凝活性显著提高，多糖絮凝剂产量显著提高。多糖絮凝剂在污水处理和食品工程中应用。CGMCC No. 287620090114
【IPC分类】C12P19/04, C12N15/75, C12N15/66, C12N1/21, C12N15/54, C12R1/10
【公开号】CN105624080
【申请号】CN201610028296
【发明人】何宁, 陈震, 余文成, 王远鹏, 李清彪, 沈亮
【申请人】厦门大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月15日