10 μ L 10 XBugbuster master mix使细菌裂解。取新的96孔板，各加入100 μ L含有 201111半缩醛、2001111氢氰酸和0.002%溴甲酚紫的水溶液。451：反应301^11，紫色变化最快 的即为活力最高的菌落。挑取对应的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序，用NCBI的 ORF Finder分析其开放读码框（0RF)，得到GDH基因编码序列（SEQ ID Νο:2)和相应的氨 基酸序列（SEQ ID Νο:1)。
[0054] 实施例2⑶Η的表达
[0055] 将实施例1中所得的葡萄糖脱氢基因 DNA片段在37°C用限制性内切酶Ndel和 Xhol双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将 目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经Ndel和Xhol酶切后的质粒pET21a在16°C 下连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布于含1〇〇 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养 基，筛选阳性克隆即得到重组表达质粒PET21-GDH。
[0056] 将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌（E. coli)BL21 (DE3)感受态细胞中，转化条 件为42°C，热击90秒，在含有100 μ g/mL氨苄青霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选， 挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆（见图2)。培养重组菌，即获得阳性重组转化体E. coli BL21(DE3)/pET21-GDH。
[0057] 实施例3⑶Η和DERA的共表达
[0058] 将实施例1中所得的葡萄糖脱氢酶基因 DNA片段在37°C用限制性内切酶Ndel和 Xhol双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将 目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经Ndel和Xhol酶切后的质粒载体pACYC-Duet 在16°C下连接过夜，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，涂布于含有30 μ g/mL氯霉素的LB固 体平板，筛选阳性克隆即得到重组表达质粒pACYC-GDH。将中国专利申请CN201310381492 中的野生型大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA)基因（核苷酸序列为SEQ ID N〇:3)用限制性内切酶Ncol和Hindlll双酶切4小时，经过琼脂糖凝胶电泳纯化，利 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段用T4 DNA连接酶连接到经同样 Ncol和Hindlll双酶切的pACYC-GDH质粒，在16°C下连接过夜，转化大肠杆菌DH5 a感受 态，涂布于含有30 μ g/mL氯霉素的LB固体平板，筛选阳性克隆即得到重组共表达表达质粒 pACYC-GDH-DERA〇
[0059] 将上述重组表达质粒转化到E. coliBL21 (DE3)感受态细胞中，转化条件为42°C， 热击90秒，在含有30 μ g/mL氯霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌 落PCR验证阳性克隆（见图4)。培养重组菌，即获得阳性重组转化体E. coli BL21(DE3)/ pACYC-GDH-DERA〇
[0060] 实施例4⑶Η和DERA的共转化
[0061] 将实施例1中所得的葡萄糖脱氢酶基因 DNA片段用Ndel和Xhol酶切并连接到 pET28a的相同位点，在含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培养皿上筛选阳性菌株，得到⑶Η表达 质粒PET28-GDH。将该质粒转化到E. coliBL21 (DE3)得到含有⑶Η表达质粒的大肠杆菌菌 株，以它作为宿主制备感受态细胞，将含有DERA基因（核苷酸序列为SEQ ID No: 3)的质粒 PET21-DERA (参见中国专利申请CN201310381492)转化到上述菌株中，在LB培养皿上得到 同时具有卡那霉素和氨苄西林抗性的阳性菌落。
[0062] 实施例5 NADH氧化酶
[0063] NADH氧化酶基因（NCBI登录号AF014458.2，SEQIDNo:5，编码的氨基酸序列为 SEQ ID No:4)通过DNA合成得到，在5' -端和3_'端分别引入Ndel和Xhol位点，通过T4 DNA连接酶连接到同样用Ndel和Xhol双酶切的pET28a载体中，连接产物16°C反应过夜， 转化到E. coli ToplO,得到NADH氧化酶表达质粒pET28-NADH-〇x。后者经过测序验证后， 转化到E. coli BL21 (DE3)中，在含有30 μ g/mL卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落， 即为 NADH 氧化酶表达菌株 E. coli BL21 (DE3) /pET28-NADH-〇x (见图 5)。
[0064] 实施例6⑶Η单表达菌株的高密度发酵
[0065] 将按照实施例2获得的重组大肠杆菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET21-GDH接种于含有 10(^8/11^氨苄西林的20011^1^培养基中，于371：，180~220印111培养10~1611。将上述 培养好的种子按10% (v/V)的比例接种于3L上罐发酵培养基（M9培养基，含葡萄糖4g/L， 磷酸氢二钠12. 8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵lg/L，硫酸钠0. 5g/L，氯化钙0. 0152g/L，六 水氯化镁〇. 41g/L)中，在25~35°C，300~800rpm，空气流量2~6L/min的条件下培养。 培养6~10h后，以5~20mL/h的速率流加含60%甘油的补料培养基，持续至发酵结束。 流加补料培养基数小时至〇D 6。。达到20~40时，添加0. 1~ImM IPTG开始诱导。诱导5~ 15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
[0066] 实施例7⑶Η与DERA共表达菌株的高密度发酵
[0067] 将按照实施例3或4获得的重组大肠杆菌接种于含有30 μ g/mL氯霉素（实施例 3)或同时含有50 μ g/mL卡那霉素和100 μ g/mL氨苄西林（实施例4)的200mLLB培养基 中，于37°C，180~220rpm培养10~16h。将上述培养好的种子按10% (v/v)的比例接种 于3L上罐发酵培养基（M9培养基）中，在25~35 °C，300~800rpm，空气流量2~6L/min 的条件下培养。培养6~10h后，以5~20mL/h的速率流加含60%甘油的补料培养基，持 续至发酵结束。流加补料培养基数小时至〇D_达到20~40时，添加0. 1~ImM IPTG开 始诱导。诱导5~15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
[0068] 实施例8 NADH氧化酶的高密度发酵
[0069] 将按照实施例5获得的E. coli BL21 (DE3)/pET28-NADH-〇x重组大肠杆菌接种于 含有30μ g/mL氯霉素的200mL LB培养基中，于37°C，180~220rpm培养10~16h。将上 述培养好的种子按10% (v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基（M9培养基）中，在25~ 35°C，300~800rpm，空气流量2~6L/min的条件下培养。培养6~10h后，以5~20mL/ h的速率流加含60%甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至0D6。。 达到20~40时，添加0. 1~ImM IPTG开始诱导。诱导5~15h后，放罐，5000rpm离心收 集菌体。
[0070] 实施例9⑶Η转化半缩醛到内酯
[0071 ] ⑶Η粗酶液的制备：取实施例4收集的⑶Η单表达大肠杆菌菌体2L，加入1~3倍 体积的〇. 〇5MNaHC03缓冲液（pH 7. 2)。超声破碎30min，lOOOOrpm离心取上清作为⑶Η粗 酶液，用于酶催化反应。
[0072] DERA的催化：在2L的催化反应体系中，氯乙醛的浓度为3Μ，乙醛的浓度为6. 5Μ溶 于有机溶剂中，加入氯乙醛质量5%的DERA酶。反应温度：10~30°C，催化时间：4~8h。
[0073] GDH的催化：DERA催化反应结束后用5倍体积乙酸乙酯萃取得到半缩