一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子荧光探针领域，涉及一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应 用，尤其是涉及一种基于吲哚半花菁结构的比率型pH荧光探针及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 化学反应的进行或完成与pH值密切相关，而组织、细胞或酶的许多生理过程如细 胞增殖或凋亡、离子运输、内吞作用、多药物耐药性或肌肉收缩等活动也与人体内的pH值紧 密相关，pH值的改变还会通过间隙连接和信号通路的变化影响到突触传递、神经元兴奋性 和细胞间耦合等神经系统活动。pH值异常会引发一些疾病，如癌症或阿氏综合征，有报道指 出细胞酸化是癌细胞凋亡的早期特征。在正常生理条件下，根据pH值不同可以把细胞划分 为两个部分:酸性细胞器(pH=4.5-6.0)及细胞质(pH=6.8-7.4)。因此，细胞内酸性或碱性 太强，都会引起细胞功能障碍。
[0003] 玻璃电极法是测定pH值的常用方法，但由于其存在电化学干扰或机械损伤等缺 陷，而不适合用于活体和极端pH值的测定。荧光探针检测法是基于光学信号变化的pH值测 定方法，是利用一些有机化合物的荧光特性来指示目标介质酸碱度的变化。用荧光探针测 定pH值是一种非侵入性的方法，既不会破坏样品，同时具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性 低、细胞膜透过性好及测试方法简单等特点。荧光探针检测法不仅可以用于荧光显微学研 究，还可以实时监测细胞内pH值的变化和动态分布。
[0004] 具有花菁染料结构的化合物具有优越的光谱性能，目前已经被广泛应用于生物标 记、荧光成像以及靶向治疗等诸多领域。由于该类分子的光谱性能对周围环境的变化异常 敏感，因而其也常被用于研究溶剂的极性性质。目前，基于这一特点，采用该结构并将其应 用于溶液pH值检测的工作，特别是利用比值型荧光探针检测pH的工作受到更多的关注。相 比于on-off型探针，比值型探针在检测时通过荧光光谱图两个峰变化对同一物质进行检 测，使其具备了内在的自校准功能，因而检测结果更为准确和可靠。
[0005] 1-(4-苄基苯甲酸)_2,3,3_甲基吲哚溴化物在游离状态下，其氮原子带正电荷，会 离域在整个吲哚环上。当α-碳上接入供电子基团时，离域在吲哚环上的正电荷被中和，吲哚 结构与供电子基团发生共辄，导致新分子的共辄程度增大，其电子轨道更稳定，所需的激发 光能量更低，同时伴随有光谱的红移，因此该类化合物是一类较好的ICT机理荧光骨架。
[0006] 申请公布号为CN 104086536 Α的中国发明专利公开了一种用于检测pH值的荧光 探针及其制备方法与专用检测试剂盒。该发明提供的用于检测pH值的荧光探针的结构如下 所示：
[0007]
[0008] 该发明同时提供了该化合物的制备方法，包括如下步骤：（1)二羟基苯甲醛和吗啉 经还原反应，得到取代吗啉甲基苯基二醇；（2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，取代吗啉甲 基苯基二醇与三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得上述化合物。该发明提供的用于检 测pH值的试剂盒，包括上述化合物和溶剂。上述专利公布的技术方案中，制得的荧光探针及 其专用检测试剂盒对溶液的pH值具有良好的响应性，能够实现对溶酶体的标记和细胞溶酶 体pH值的测定，但其pH值检测范围较窄，且仅限于细胞溶酶体pH值的检测，适用范围较小， 有很大的局限性。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种光稳定性好、选 择性高、合成方法简单且应用范围广的比率型pH荧光探针及其制备方法与应用。
[0010] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0011] -种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式I所示：
[0012]
[0013] 其中，R为-OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包彳
$或 _，_>的一种。
[0014] 当R为-OH时，该方法具体包括以下步骤：
[0015] (1)在酸性溶剂中加入式Π 所示化合物及式ΙΠ 所示化合物，于110-130 °C加热回流 4_6h，后经蒸馏，即得到式V所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
[0016]
?
[0017] (2)在有机溶剂A中加入式V所示化合物及式VI所示化合物，于70-90 °C加热回流 11-13h，后经蒸馏，即得到式W所示化合物，该过程化学反应式如下所示： i
[0018]
[0019] (3)在有机溶剂B中加入式W所示化合物及对羟基苯甲醛，于75-95°C加热回流22-26h，后经蒸馏、提纯，即得到式I所示化合物，即：
[0020]
[0021]需要说明的是，步骤(1)中，式π所示化合物及式m所示化合物反应先生成中间体 式IV所示化合物，然后式IV所示化合物进一步反应生成式V所示化合物，式IV所示化合物 的化学结构式如下：
[0022]
'Ν ?
[0023] 步骤(3)所述的提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混 合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为10-20:1。
[0024] 彳彳
；;及缩合剂一起加入到有机溶剂Β中，于室 .·'、、~-、 、..··-'.祕:.笑…- 温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为< > j 的pH荧光探针。
[0025] 所述&
、'缩合剂的摩尔比为1:1 .1-1.3: 1.4-1.8。 .?
[0026] 作为优选的技术方案，所述￡ 缩合剂的摩 > 尔比为 1:1.1:1.5。
[0027] 彳
泛缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室 ·>：?：?： 温下搅拌8_12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为j 的?!1荧光探针。
[0028] 所述的
5;;缩合剂的摩尔比为1:1.1-1. 3: HOOC 1.4-1.8。
[0029] 作为优选的技术方案，所述%缩合剂的摩 > 尔比为 1:1.1:1.5。
[0030] 所述的缩合剂为DCC(中文名称为二环己基碳二亚胺)/DMAP(中文名称为4-二甲氨 基吡啶）、DIC(中文名称为N，N-二异丙基碳二亚胺)/DMAP、EDC(中文名称为1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/H0Bt(中文名称为1-羟基苯并三唑)/NMM(中文名称为N-甲 基吗啉）或HATU(中文名称为2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯）/ NMM中的一种。
[0031] 步骤（1)所述的式Π 所示化合物、式m所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8_ 10,优选1:1:10。
[0032] 步骤(2)所述的式V所示化合物、式VI所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2: 8-10,优选1:1.2:10;
[0033] 步骤(3)所述的式W所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8-10,优选1:1.1:10。
[0034] 所述的酸性溶剂为冰醋酸，所述的有机溶剂A为乙腈，所述的有机溶剂B为N，N_二 甲基甲酰胺。
[0035] 所述的荧光探针用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。
[0036]在实际应用时，可提前将本发明荧光探针存放于检测试剂盒中，当实验人员需要 测定pH值时，直接取出使用，摆脱了繁重的试剂配制及优化过程，简化了操作。
[0037]本发明基于1-(4-苄基苯甲酸)_2,3,3_甲基吲哚溴化物，在其4号位上引入了苄基 苯甲酸，苄基的引入使其光稳定性增强，可用于连续、长时间动态跟踪的荧光检测；而苯甲 酸的位点可以非常方便地偶联各类亚细胞器定位基团如定位溶酶体的吗啉基团和定位线 粒体的三苯基膦基团。此外，以对羟基苯甲醛作为pH响应基团，提高了该荧光探针的灵敏 性，拓宽了pH的检测范围。本发明荧光探针为pH值的检测、相关化学反应的实时监测与机理 研究以及各类化学生物学研究的后续测试平台的建立提供了一种高效、准确的方法。
[0038]在实际应用时，pH值检测范围为3.0-11.0，先通过测定不同pH值的探针水溶液得 到相应pH值对应的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，测试采用荧光仪中常用的Scan模 块进行，所得到的数据用Origin处理。利用荧光探针最大吸收波长535nm处的吸收强度对pH 值作图得到的曲线，再代入公式进行计算可以得出该探针的pKa的值。利用荧光探针最大发 射波长(559nm和522nm)强度的比值对pH值作图即可以看出pH值对该比值的影响过程。生物 活细胞内pH环境成像测试以贴壁的HeLa细胞为考察对象，所用仪器为莱卡(Leica)激光共 聚焦显微镜优化荧光成像的合适条件和相关参数(包括激发波长、时间和光强），即可实现 细胞内不同pH值的荧光成像。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0040] 1)光稳定性好，在该3H-吲哚菁染料的N原子上引入苄基，大大提高了荧光探针的 光稳定性；
[0041 ] 2)pH值检测范围广且灵敏度高，从强酸性(pH=3)到强碱性(pH= 11)，荧光变化明 显，背景荧光弱，信噪比好；
[0042] 3)选择性高，与其他常见的干扰离子和氨基酸作用基本没有荧光变化；
[0043] 4)合成方法简单，合成步骤少，操作简便；
[0044] 5)应用范围广，探针所在的水溶液颜色变化迅速，既可用于即时测定荧光化学体 系的酸碱度，又可方便地进入活细胞，以检测生物活细胞内的pH值或对亚细胞器进行定位。
【附图说明】
[0045] 图1为实施例1制得的探针Cy2在pH=3_ll时的紫外-可见吸收光谱图；
[0046] 图2为不同pH值的探针Cy2溶液在535nm处的紫外吸收强度变化图；
[0047] 图3为实施例1制得的探针Cy2在pH=3_ll时的荧光发射光谱图；
[0048]图4为不同pH值的探针Cy2溶液在559/522nm处的荧光强度比值变化图；
[0049]图5为不同pH值的探针Cy2溶液光稳定性测试图；
[0050]图6为实施例1制得的探针Cy2溶液对不同pH值的可逆性测试图；
[00511图7为pH=6.8时探针Cy2溶液的选择性和抗干扰能力测试图；
[0052]图8为pH=8.0时探针Cy2溶液的选择性和抗干扰能力测试图；
[0053]图9为实施例1制得的探针Cy2溶液的细胞毒性测试图。
【具体实施方式】
[0054]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0055]实施例1-7中所使用的化学试剂和溶剂都购自商业途径，不需要进一步纯化即可 使用。在硅胶板上进行薄层层析(TLC)，使用300-400目的硅胶(Hailang，青岛）进行柱层析。 用以ppm表示化学位移的Bruker AV-400光谱仪(在氖代二甲基亚楓中，用Me4Si作为内标） 上记录1H和13C NMR。
[0056] 实施例