具有接枝聚合物的多糖基体、其生产方法及其用途的制作方法

专利名称：具有接枝聚合物的多糖基体、其生产方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖基体，在其表面上固着衍生自具有官能团的至少一种烯属单体化合物的接枝聚合物，其中所述多糖基体通过在具有至少一个羧酸基团和/或具有至少一个其中X = -0、-S或-N的酸性XH基团的有机酸以及过渡金属或镧系元素化合物存在下用所述至少一种烯属单体化合物接枝多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖起始基体来制备，并且本发明还涉及制备所述多糖基体的方法和这类多糖基体的用途。
背景技术：
生物分子诸如蛋白质、氨基酸、核酸、病毒或内毒素从液体介质中过滤、纯化和去
除对于生物医药工业具有极大的重要性。在液相中存在的被吸附物相对于基体容量来说浓度极低的这类工艺中，特别使用尤其以吸附膜形式的多孔非粒状多糖基体，因此，基于基体的单位面积，可加工大量液相直到容量耗尽。典型应用是使用带正电荷的膜吸附脱氧核糖核酸和核糖核酸(RNA和DNA)、病毒、宿主细胞蛋白质和内毒素，以便从含抗体的溶液中除去这些污染物。所述膜的开孔结构容许大被吸附物吸附在孔内部。对于常规凝胶来说，在这些情况下的吸附限于颗粒外表面。因此，特别在诸如DNA、RNA、凝血因子VIII (FVIII)和病毒的大型被吸附物的纯化中成功地使用了薄膜。然而，对于较小被吸附物的吸附来说，与色谱凝胶相比，膜的较小内表面和由此产生的较低容量是不利的。DE 3929648C1和EP 0490940B1公开了接枝到含氮聚合物、更特定地说聚酰胺上的方法。它们是基于由卤素、优选来自有机次卤酸盐、有机N-卤素化合物或四氯甲烷的氯原子置换聚合物的NH基团中的氢，且随后通过与还原剂反应实现氮自由基的形成。随后可使任何所需的烯属单体接枝到自由基氮位点。根据这些方法制备的这些膜已经被证明本身是有用的，所述膜的缺点在于它们具有比原料膜明显低的液压渗透性。EP 0527992B1因此提出通过用第二聚合物、优选N-氯化尼龙衍生物的溶液涂覆包含第一聚合物(例如水合纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)或水合纤维素)的膜且随后接枝这样用烯属单体涂覆的膜来解决液压渗透性降低的问题。该方法的缺点在于烯属不饱和单体不能直接接枝到第一聚合物上且因此接枝反应的结构前提是在可发生接枝之前用第二聚合物的溶液涂覆第一聚合物。该方法由于其大量的单独步骤而复杂且成本密集。从EP 0722360B1中了解到，基于含羟基的载体的离子交换剂(例如得自Merck的Fractogel TSK)在其表面上接枝了含环氧基的甲基丙烯酸衍生物。接枝的聚合物的环氧基随后可通过含NH-或OH-的试剂转化为邻二醇或1，2-氨基醇官能团。EP 0337144B1公开了含羟基的载体，其表面具有与其共价键合的可通过接枝聚合产生的聚合物，所述聚合物具有作为重复单元的单元[-CR’ ！T’-CRiYl，其中Y=-CO2R4, -CN、-CHO, -OH、-CH2NH2和_CH2NR2R3。所述载体用于使在人类血清中和在含单克隆抗体的鼠腹水中的免疫球蛋白分级。
EP 1163045B1公开了一种制备阳离子改性膜的方法，其中微孔原料膜，优选包含聚醚砜，提供有通过使包含具有环氧基和阳离子基团的二烯丙胺共聚物、聚亚烷基胺和具有阳离子基团的胺反应性化合物的组合物交联而制备的涂层。所述胺反应性化合物优选为具有铵基的缩水甘油基化合物。EP 1614459B1公开了一种制备阳离子改性膜的方法,其中微孔原料膜,优选包含(任选亲水性)聚醚砜，用二烯丙胺共聚物、二烯丙基二烷基卤化铵和具有季铵基团的丙烯酸单体的混合物处理，且通过热处理转化为阳离子改性膜。EP 0538315B I公开了一种由具有海绵状结构的多孔载体组成的多孔基体，所述载体在其内表面和外表面上具有带官能团的接枝聚合物层，其中所述聚合物层通过使液相与基体接触使得液相占据多孔载体的可调节比例的孔隙体积而可溶剂化。用于多孔载体的前体为含氮的聚合物，例如尼龙衍生物或涂覆有尼龙衍生物的水合纤维素，在其例如以甲基丙烯酸羟基乙酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的混合物形式的单体上，经作为反应性位点的
N-Cl基团接枝。Y. Chen 等在 “Polymer Composites”,第 28 卷,2007,第 47 56 页中公开了在硫酸铈(IV)铵作为接枝引发剂与柠檬酸的混合物存在下，由作为接枝单体的玉米淀粉和丙烯酰胺制备接枝共聚物。根据作者的红外光谱研究，为了有效接枝到玉米淀粉上，需要玉米淀粉的己糖链节的氧化开环，且随后，作为与Ce4+阳离子反应的结果，在淀粉的聚合物骨架中产生自由基碳原子以便与丙烯酰胺反应。EP 1386660B I公开了在2 10的pH范围中从免疫球蛋白混合物中分离免疫球蛋白的方法，所述用途由基体M-SPl-L构成，所述基体M-SPl-L在所有情况下都具有多个可变的官能团SP1-L。在此，M为分子量不超过500道尔顿的配位体L经间隔基SP I与其结合的色谱起始基体。配位体L优选选自单环或二环(杂)芳族化合物，其任选可以带有酸
性基团。EP 0921855B I也公开了在2 10的pH范围中从免疫球蛋白混合物中分离免疫球蛋白的方法，所述用途由基体M构成，官能团SPl-L与所述基体M结合。配位体L借助于间隔基SPl与基体M结合，其选自苯并咪唑、苯并噻唑和苯并噁唑。所述配位体L任选在其二环杂芳族部分上可以带有酸性基团，诸如磺酸和羧酸取代基。EP 1718668B1公开了一种使抗体与在溶液中的至少一种污染物分离的方法，所述用途由其上仅固着多模式配位体的色谱树脂构成。在此，多模式配位体为可以与待分离组分产生至少两种不同的结合相互作用(即，潜离子相互作用和疏水性相互作用)的配位体。所述配位体具有用于这两种结合相互作用的阳离子交换基团和至少一种(杂)芳族环系统。

发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖基体，在其表面上固着接枝的聚合物且其具有高蛋白结合容量，和提供用于制备所述多糖基体的成本有效且高效的方法。另外，还提出了所述多糖基体用于材料分离的用途。该目的由根据权利要求I所述的多糖基体、根据权利要求13和14所述的其制备方法和根据权利要求18所述的膜用于材料分离的用途来实现。
具体地说，提供了一种多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖基体，在其表面上固着衍生自至少一种具有官能团的烯属单体化合物的接枝聚合物，所述基体通过在具有至少一个羧酸基团和/或具有其中X = -0、-S或-N的至少一个酸性XH基团的有机酸以及过渡金属或镧系元素化合物存在下，用所述至少一种具有官能团的烯属单体化合物接枝多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖起始基体以产生接枝到所述多糖起始基体上的具有官能团的聚合物来制备。
具体实施例方式在本发明的情形中，要理解多孔、非粒状、多糖基体是指在所有情况下都包含多糖的开孔泡沫体或微孔膜。优选具有海绵型结构的微孔膜，其由孔的连贯空间系统组成且因此具有与其流动阻力成比例的高比表面积。可用作多糖基体的微孔膜的典型层厚度在50 500iim、优选100 300 的范围内。平均孔径优选在0. 01 20 范围内、特别优选在0. I 15 iim范围内且最优选在0.4 IOiim范围内，其中平均孔径使用“毛细流孔隙度仪(Capillary Flow Porometer) 6. 0” Coulter 孔隙度仪，CAPWIN 软件系统，Porous
Materials Inc.测定。这类膜可为平面和圆筒形的。圆筒形膜被称为膜空心纤维、膜毛细管或膜管。在本发明的情形中优选平面膜，尤其优选整合在螺旋缠绕或堆叠模块中的吸附膜。在本发明的情形中，要理解可对流渗透的多糖基体是指其中使用液压差的作用来实现与含被吸附物的介质的对流渗透的多糖基体，由此，代替被吸附物在向基体内部的浓度梯度方向中的纯粹扩散性运输，实现了对流传输，如果流速高，其比扩散性运输快很多。由此，可以避免粒状基体(例如色谱凝胶)所固有的且被称为扩散限制的缺点。该缺点在于，随着基体粒度增加和被吸附物的摩尔质量增加，实现吸附平衡所需的时间显著增加，且这导致动力学恶化。在一个优选的实施方案中，所述多糖起始基体由多糖组成，而在另一实施方案中，其为具有多糖涂层的多孔载体。在这两个实施方案中，所述多糖选自纤维素酯、纤维素醚、水合纤维素、琼脂糖、几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖或其组合。任选上述多糖可以是交联的。尤其优选的多糖为纤维素酯，更尤其是单乙酸纤维素酯、二乙酸纤维素酯、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素、乙酰丁酸纤维素或硝酸纤维素；纤维素醚，更尤其是甲基纤维素或乙基纤维素以及其混合物，其中最优选乙酸纤维素，更尤其是二乙酸纤维素。在具有多糖涂层的多孔载体的上述实施方案中，所述多孔载体优选为微孔的且由聚合物构成，所述聚合物选自聚酰胺、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、它们的共聚物或其混合物。在根据本发明的多孔多糖基体的表面上，固着衍生自至少一种具有官能团的烯属单体化合物的接枝聚合物，其中所述多孔基体的表面被理解为是指多孔基体的内表面、即孔隙内壁区域，和外表面、即外部区域。优选接枝到多糖起始基体上的聚合物由至少一种烯属单体化合物形成,所述烯属单体化合物为(甲基)丙烯酸衍生物且其官能团为潜离子或可转变成潜离子的基团、疏水基团和/或环氧基团。
对于本发明的目的，特别优选选自下面的烯属单体化合物苯乙烯、a-甲基苯乙烯、4-乙氧基苯乙烯、3，4-二甲氧基苯乙烯、4-苄氧基-3-甲氧基苯乙烯、氟苯乙烯、氯甲基苯乙烯、4-叔丁基苯乙烯、乙烯基苯甲醚、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基苄氯、乙烯基苯胺、N，N-二甲基乙稀基节胺、乙稀基节基二甲基氣化按、4_乙稀基联苯、2_乙稀基蔡、N_(异丁氧基甲基)丙烯酰胺、N-(丁氧基甲基)丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、2-丙基丙烯酸苄酯、乙二醇苯基醚丙烯酸酯、丙烯酸己酯、丙烯酸异辛酯、丙烯酸四氢糠酯、丙烯酸2，2，3，3，4，4，5，5，6，6，7，7_十二氟庚酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸3-氯-2-羟基丙酯、甲基丙烯酸环己酯、乙二醇苯基醚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸2-(甲硫基)乙酯、甲基丙烯酸苯酯、聚(丙二醇)甲基丙烯酸酯、烯丙基苄醚、乙烯基吡啶、乙酸乙烯酯、聚(乙二醇)(n)单甲基丙烯酸酯或其组合。这些上述单体具有作为官能团的疏水基团，所述疏水基团也是接枝到多糖基体上的聚合物所具有的。在根据本发明的膜的另一优选实施方案中，其制备利用至少一种烯属单体化合物，所述烯属单体化合物包含作为官能团的潜离子基团或可转化为离子的基团，优选酸性基团。特别优选丙烯酸、甲基丙烯酸、2-丙烯酰胺基乙醇酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基-I-丙
烷磺酸、(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-(3-二甲基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵、二烯丙基二甲基氯化铵、丙烯酸2-羧乙酯、丙烯酸2-( 二甲基)乙酯、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酸2-( 二乙氨基)乙酯、[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵、[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化铵、[3_(丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化铵、[2-甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵、1-(3-磺丙基)-2-乙烯基氢氧化吡啶鎗、(甲基)丙烯酸磺乙酯、(甲基)丙烯酸磺丙酯、乙烯基磺酸衍生物、苯乙烯磺酸衍生物或其组合。在另一实施方案中，根据本发明的膜使用至少一种烯属单体化合物制备，所述烯属单体化合物包含作为官能团的极性非潜离子基团，更尤其是(甲基)丙烯酸羟基丙酯、3_(甲基)丙烯酰氨基-I-丙醇、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯、丙烯酸2-羟基-3-苯氧基丙酯、(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯、甘油单甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇或其组
入
口 o用于本发明的目的的另一优选的烯属单体化合物包含作为官能团的环氧基，所述环氧基随后可以与亲核试剂反应。尤其优选丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯。在本发明的另一实施方案中，本发明的膜由至少一种烯属单体化合物制备，所述烯属单体化合物包含作为官能团的能够交联的基团，在所述烯属单体接枝到起始基体上之后所述基团能够使接枝的聚合物发生交联，所述烯属单体化合物例如为乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油二甲基丙烯酸酯、1，4_ 丁二醇二丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚(乙二醇)(n) 二丙烯酸酯、聚(乙二醇)(n) 二甲基丙烯酸酯、1，3_ 二丙烯基苯、双酚A 二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸3-(丙烯酰氧基)-2-羟基丙酯、1，3- 丁二醇二丙烯酸酯、1，4- 丁二醇二丙烯酸酯、1，4- 丁二醇二甲基丙烯酸酯、N，N'-亚甲基双丙稀酸胺、1，3, 5- 二丙稀酸基六氧-I, 3, 5- 二嚷、I, I, I- 二轻甲基丙烧二丙烯酸酯、聚(乙二醇)双酚A二缩水甘油基醚加合物或其组合。具有能够交联的基团的这些单体可以单独使用或与上述单体化合物中的至少一种组合使用，以制备本发明的膜。
另外，在所有情况下所有上述类型的单体化合物都可以单独或与至少另一类、其可以是任何种类的上述单体化合物组合，接枝到多糖起始基体上。在一个尤其优选的实施方案中，本发明的多糖基体通过使丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯的混合物与甲基丙烯酸苄酯接枝来制备。在过渡金属或镧系元素化合物存在下，特别有利地实现了上述至少一种烯属单体化合物接枝到多糖起始基体上，所述过渡金属或镧系元素化合物在起始基体上产生自由基位点，所述至少一种烯属单体化合物以自由基接枝到多糖起始基体上。优选，本发明的膜通过在来自铈、锰、铁、镍、钴、钒化合物或其组合的过渡金属或镧系元素化合物存在下进行接枝来制备。尤其优选使用Ce (IV)盐。意外地发现，当使所述至少一种烯属单体化合物接枝到多糖起始基体上是在具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X = -0、_s或-N的酸性XH基团的有机酸存在下进行时，本发明的多糖基体具有显著增加的蛋白结合容量。相对于除了使用上述这种有机酸以外所有制备参数都相同的比较性多糖基体来说，对于牛血清蛋白(BSA)的静态结合容量
尤其可以增加高达8. 4倍。静态结合容量在此被理解为是指根据本发明的多糖基体、尤其优选作为膜的单位面积，被吸附物(例如BSA)处于平衡状态时所结合的质量，以mg/cm2计。具有与上述比较性基体相比增加I. 5 8. 4倍的静态蛋白结合容量的本发明多糖基体可以通过在具有至少一个羧酸基团和/或至少一个酸性XH基团的有机酸存在下进行的上述接枝来制备，其中所述有机酸选自由柠檬酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、马来酸、丁二酸、乙二酸、丙二酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、乳酸或其组合且其中X = -O。在本发明的一个实施方案中，接枝到多糖起始基体上的聚合物的官能团本身能够与流体中存在的被吸附物相互作用。在本发明的另一优选的实施方案中，可以在接枝之后使接枝到多糖起始基体上的聚合物的官能团与能够与流体中存在的被吸附物相互作用的至少一种配位体反应。尤其优选所述配位体具有阳离子基团、阴离子基团和/或疏水基团。上述配位体与接枝的聚合物的单体单元的官能团反应，由此各单体单元可转变成接枝的聚合物中被所述至少一种配位体官能化的重复单元(配位体的“类聚合物反应”)。在本发明的情形中，具有阳离子基团的优选配位体为具有一个氮原子的伯胺，其尤其选自丁胺、己胺、环丙胺、环己胺、苯胺、氯苯胺、苄胺、苯基乙胺、苯基丙胺、苯基己胺、2,3,4,5,6-五氟苯胺、4-( 二氟甲基)苯胺、甲苯胺、I-(4-甲基苯基)乙胺、I-萘胺、I-甲基-3-苯基丙胺或其组合；具有一个氮原子的仲胺，例如二甲胺、N-乙基甲胺、二异丙胺、N-甲基苯胺、N-甲基环己胺、4-三氟甲基-N-甲基苯胺、N-苄基甲胺、N-乙基苯胺、N-甲基乙醇胺、4-甲氧基-N-甲基苯胺、N-乙基环己胺、N-乙基苄胺、2-甲氧基-N-甲基苄胺、二苯胺、N-环己基苯胺、二苄胺或其组合；和具有一个氮原子的叔胺，其选自三甲胺、N，N-二甲基乙胺、N，N-二乙基甲胺、N，N-二甲基丁胺、N，N-二甲基己胺、N-甲基二丙胺、6_( 二甲氨基)富烯、N，N-二甲基苯胺、N，N-二甲基环己胺、N，N-二甲基苄胺、N，N-二甲基-I-萘胺、N-己基苯胺、二环己胺、N-苄基苯胺、N，N- 二环己基甲胺、N-苄基-N-乙基苯胺、N-苄基-N-羟乙基-N-甲胺或其组合。在本发明的情形中优选的具有多于一个阳离子基团的另一组配位体为具有多于一个氮原子的胺，在下文中称为多胺。通过使接枝到多糖起始基体上的聚合物的官能团与上述多胺反应，可以使接枝的聚合物交联且通过使氮原子季铵化而增加带正电载体的密度。尤其优选的多胺选自乙二胺、I，4-二氨基丁烧、1,6-二氨基己烧、1,8-二氨基辛烧、N, N- 二甲基乙二胺、3_( 二甲氨基)-1-丙胺、二乙烯二胺、N, N' - 二甲基-1,3-丙二胺、N，N，N'-三甲基乙二胺、2-(氨甲基)-2-甲基-1，3-丙二胺、1，4_苯二胺、六亚甲基四胺、N，N-二乙基乙二胺、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、二乙基二甲基丙二胺、N，N，N'-三甲基-I，3-丙二胺、二乙烯四胺、二(2-氨乙基)胺、4-氨基节胺、N, N, N' ,N'-四甲基-I,
3-丙二胺、3, 3' - 二氨基-N-甲基二丙胺、二(二甲氨基)甲烧、4-(2-氨乙基)苯胺、N,N-二甲基对苯二胺、N-苯基乙二胺、N，N' - 二甲基-1，6-己二胺、双[2-(N，N-二甲氨基)乙基]醚、四乙烯五胺、分子量在500至500000g/mol之间变化的聚乙烯亚胺、N-苄基乙二胺、N-环己基-I, 3_丙二胺、N, N, N' , N" , N" _五甲基二乙稀二胺、N, N, N' ,N' _四甲基对苯二胺、1,4-双(3-氨基丙氧基)丁烧、4,4'-氧基二苯胺、2_[2_( 二甲基氨基乙基)甲基氨基]乙醇、哌嗪、N-甲基哌嗪、N，N-二甲基哌嗪、氨基乙基哌嗪、I，4-双(3-氨基丙
基)哌嗪、1-(2-羟乙基)哌嗪、二氮杂双环辛烷、胍丁胺、S-三嗪或其组合。当使用具有一个或多于一个氮原子的上述配位体时，本发明的多糖基体优选通过接枝具有作为官能团的环氧基的至少一种烯属单体化合物来制备，所述环氧基通过与配位体的氮原子反应产生开环反应。在该实施方案中特别优选作为烯属单体化合物的是丙烯酸缩水甘油酯和/或甲基丙烯酸缩水甘油酯。在配位体具有多于一个氮原子的情况下，可以通过由所述氮原子中的两个或多个使环氧基进行开环反应，从而使本发明的多糖基体的接枝聚合物交联，其中所述交联可以用两个不同接枝聚合物链的环氧基在分子间进行或用同一接枝聚合物链的环氧基在分子内进行。在使用具有多于一个氮原子、尤其优选两个氮原子的多胺作为配位体的本发明的另一变体中，环氧基的开环反应通过所述氮原子中的仅一个进行，而开环反应中未涉及的剩余氮原子有助于增加在本发明的多糖基体上的离子交换基团的密度。尤其优选作为配位体使用的多胺为式(I)的对称或不对称的多胺R1R2N-B-NR3R4(I),其中可以通过桥B的长度和结构控制只有基团R1R2N还是基团NR3R4进入与接枝聚合物的环氧基的开环反应。在对称多胺的情况下，基团R1R2N和NR3R4是相同的，且桥B具有对称结构，即，桥B具有垂直于穿过式(I)的环状或非环分子链的假想轴的镜面。这两个氨基的反应性相同，由此增加了由R1R2N和基团NR3R4进行环氧基的双开环反应的概率。经由这两种氨基中的仅一种的反应可以受桥B的长度和所述二胺在所用反应液中的浓度影响。桥B越短且所述二胺在所述液体中的浓度越高，通过基团R1R2N或NR3R4中的仅一种进行开环反应的概率越大。或者，这些氨基中的一种可以由合适的保护基保护以免与接枝聚合物的官能团反应。本领域的技术人员已知向胺中引入保护基的方法(“Protective Groups in OrganicSynthesis”,第 3 版，Theodora ff. Greene, Peter G. M. Wuts, 1999)。对于本发明的目的优选的对称多胺的实例为例如N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、N, N, N' ,N' _四甲基_1，3_丙二胺、四乙稀五胺、五乙稀六胺、N, N, N' , N" , N" _五甲基二乙烯三胺、双[2-(N，N-二甲氨基)乙基]醚、四甲基-1，6-己二胺、N，N' -二甲基哌嗪、1，2_ 二氨基环己烷、邻和/或对二甲苯二胺、N，N，N'，N'-四甲基-1，4-丁二胺或1，4-二氮杂双环[2. 2. 2]辛烷。在不对称多胺的情况下，取代基R1R2N和NR3R4基团是不同的。这导致两个氨基的反应性不同。因此，优选发生仅一个氨基R1R2N或NR3R4与接枝聚合物反应。不对称二胺的实例为例如3-( 二甲氨基)-1_丙胺、N，N，N'-三甲基_1，3_丙二胺、2-氛基-5-二乙基氛基戍烧、N, N-二乙基-N' ,N' _ 二甲基_1，3_丙二胺、N, N-二乙基-N' ,N' - 二甲基-1，2_丙二胺、2_{[2_( 二甲氨基)乙基]甲氨基}乙醇、1-(2-轻乙基)哌嗪或其组合。在本发明的另一实施方案中，使用具有至少一个阴离子基团的配位体。尤其优选具有磺酸基团的配体。这些磺酸配位体可以例如通过SO32-阴离子或其衍生物与接枝聚合物的单体单元的官能团的反应引入本发明的膜中，由此一些或所有单体单元可以转变成接
枝的聚合物的由磺酸基团(SO3H基团)官能化的重复单元。在这种情况下，接枝的单体单元的官能团优选为环氧基。尤其优选所述烯属单体化合物为甲基丙烯酸缩水甘油酯。根据另一优选的变体，可以在接枝之后使接枝到多糖起始基体上的聚合物的官能团与两种不同的配位体反应，其中第一配位体具有阴离子基团且第二配位体具有疏水基团。在这种情况下，接枝的聚合物的官能团优选为在开环反应中与这两种不同的配位体反应的环氧基。尤其优选地，在该实施方案中，接枝的聚合物由甲基丙烯酸缩水甘油酯形成。尤其优选地，第一配位体为磺酸基团-SO3H，其可以从SO广离子或其衍生物开始引入如上所述的膜中，且第二配位体为具有疏水性芳基部分的苯胺或对氨基苯磺酸(4-氨基苯磺酸)。最优选第一配位体为磺酸基团且第二配位体为对氨基苯磺酸。在具有磺酸与对氨基苯磺酸基团的该上述配位体组合的本发明膜的情况下，意外地发现，它们即使在高达300mM NaCl的盐浓度下也具有高蛋白结合容量，而在其它条件都相同、只是仅具有对氨基苯磺酸作为唯一配位体而制备的比较性膜在150 300mM NaCl的盐浓度下几乎没有蛋白结合容量。具有磺酸和对氨基苯磺酸配位体的本发明膜的该实施方案因此尤其适合作为用于污染物去除和生物分子浓缩的阳离子交换剂使用，阳离子交换剂由于高盐敏感性迄今仍不适用于这些工艺。在本发明的情形中，所述至少一种配位体能够与其相互作用的被吸附物要理解为是指生物技术工艺的一种或多种目标物质和/或污染物。所述被吸附物可以是单个的分子、缔合物或粒子，在这样情况下，它们优选为蛋白质、核酸、病毒、单克隆抗体或生物来源的其它物质。被吸附物与本发明的多糖基体结合的配位体的相互作用可以是可逆的或不可逆的，不论是哪种情况，其都能够使被吸附物从流体中除去，所述流体优选为水性液体。目标物质为将以浓缩形式或纯态从流体中回收的有价值的物质。污染物为出于技术、规章或其它原因必需或希望从流体中除去的物质。对于污染物的去除，其被称为“负吸附”，所述吸附能够(可以)在仅使用多糖基体一次时不可逆地进行。在吸附目标物质的情况下，工艺必须可逆地进行。可以进行单纯的富集或分离成两种或更多种目标物质，且在后一情况下，可以选择性地进行吸附、脱附或两者。本发明的多糖基体优选根据两种供选的方法制备，所述方法包括的共同特征是在过渡金属或镧系元素化合物存在下且在有机酸存在下所述至少一种烯属单体化合物的接枝。用于制备本发明的多糖基体的第一方法包括以下步骤A)提供用具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X = -0、_S或-N的酸性XH基团的有机酸处理的多孔的多糖起始基体，和B)使在步骤A)中提供的基体用包含过渡金属或镧系元素化合物和具有官能团的至少一种烯属单体化合物的混合物接枝，以产生接枝到多糖起始基体上的具有官能团的聚合物。根据本发明，用有机酸处理的多糖起始基体在步骤A)中通过已经选择性地加到用于制备起始基体的流延溶液中的有机酸或通过在多孔起始基体制备之后使其基本上整个表面与有机酸接触来提供。优选所述接触通过用有机酸在合适溶剂、尤其优选水或水与有机溶剂的混合物中的溶液浸泡、喷雾或浸溃起始基体来进行。基于所述多糖起始基体计算，所述有机酸的浓度为0. 03 300mmol酸/kg起始基体、优选0. I IOOmmol酸/kg起始基体、且最优选0. 2 20mmol酸/kg起始基体。步骤B)中的随后接枝优选用包含所述过渡金属或镧系元素化合物、所述至少一种烯属单体化合物和水或至少一种有机溶剂或乳化剂或其混合物的接枝液进行。所述接枝液可以是溶液或乳液形式。所述过渡金属或镧系元素化合物在所述接枝液中的浓度为
0.I 100mmol/l、优选0. 5 50mmol/l、且尤其优选2 30mmol/l。所述至少一种烯属单体化合物在所述接枝液中的浓度低于50重量％、优选低于20重量％且最优选低于5重量％。根据用于制备本发明的多糖基体的所述第一方法的一种变体，在步骤A)中提供用所述有机酸处理的多孔的多糖起始基体，且随后用包含所述单体化合物、所述过渡金属或镧系元素化合物、还有所述有机酸的接枝液进行步骤B)。基于所述多糖起始基体计算，所述有机酸的浓度为0. 01 300mmol酸/kg起始基体、优选0. 2 IOOmmol酸/kg起始基体、且最优选0. 3 20mmol酸/kg起始基体,而所述有机酸在所述接枝液中的浓度为0. 01 100mmol/l,优选为 0. 05 30mmol/l 且最优选为 0. I 3mmol/l。在该变体中，所述过渡金属或镧系元素化合物在所述接枝液中的浓度为0. I 100mmol/l、优选为0. 5 SOmmoI / I且尤其优选为2 30mmol/l。用于制备本发明的多糖基体的第二方法包括以下步骤A)提供用过渡金属或镧系元素化合物处理的多孔的多糖起始基体，和B)使在步骤A)中提供的基体用包含具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X = -0、_s或-N的酸性XH基团的有机酸和具有官能团的至少一种烯属单体化合物的混合物进行接枝，以产生接枝到所述多糖起始基体上的具有官能团的聚合物。根据本发明，用所述过渡金属或镧系元素化合物处理的多糖起始基体在步骤A)中通过使所述多孔起始基体的基本整个表面与所述过渡或镧系元素化合物接触来提供。优选所述接触通过用所述过渡或镧系元素化合物在合适的溶剂、尤其优选水或水与有机溶剂的混合物中的溶液浸泡、喷雾或浸溃起始基体来实现。基于所述多糖起始基体计算，所述过渡金属或镧系元素化合物的浓度为0. 2 500mmol/kg起始基体、优选为I 200mmol/kg起始基体且最优选为2 100mmol/kg起始基体。步骤B)中的随后接枝优选用包含所述有机酸、所述至少一种烯属单体化合物和水或至少一种有机溶剂或其混合物的接枝液进行。所述接枝液可以是溶液或乳液形式。所述有机酸在所述接枝液中的浓度为0. 01 100mmol/l，优选为0. 05 30mmol/l且尤其优选为 0. I 3mmol/l。所述至少一种烯属单体化合物在所述接枝液中的浓度低于50重量％、优选低于20重量％且最优选低于5%重量。在用于制备本发明的多糖基体的两种上述方法中，在步骤B)中的接枝之后，可以使接枝到多糖起始基体上的聚合物的官能团在随后步骤C)中与能够与流体中存在的被吸附物相互作用的至少一种配位体反应。所述配位体优选具有如上所述的阳离子基团、阴离
子基团和/或疏水基团且可以与在步骤B)中接枝的聚合物的单体单元的官能团发生“类聚合物反应”，因此所述单体单元转化为接枝的聚合物的由至少一种配位体官能化的重复单元。或者，可以使用两种不同的配位体，其中第一配位体具有阴离子基团且第二配位体具有疏水基团。在本发明的两种方法中，所述多糖起始基体优选选自纤维素酯、水合纤维素、纤维素醚、琼脂糖、几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖或其组合。用于制备本发明多糖基体的本发明两种方法的其它变体，在所述变体中将纤维素酯用作起始基体，包括用碱性介质处理所述多糖基体以便水解所述多糖基体的酯基的附加步骤。在一个变体中，其中接枝步骤B)接着是在另一步骤C)中使至少一种配位体与聚合物的官能团反应，在步骤C)期间或步骤C)之后用碱性介质处理多糖基体。在另一变体中，其中省略在步骤C)中与配位体的反应，在步骤B)中的接枝之后进行用碱性介质处理湿润或干燥的多糖基体。用碱性介质处理优选用包含碱性化合物、尤其优选碱金属氢氧化物的水性介质进行。尤其优选氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液。也可以使用碱金属氢氧化物与其它碱性化合物诸如碱金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钾或碳酸铯)、磷酸三钠和/或磷酸三钾的混合物。优选选择所述多糖基体的碱性处理条件，使得接枝的聚合物的任何环氧基不被水解或仅略微水解。可以广泛改变并优化所述碱性化合物在所述碱性介质中的浓度，使得优先发生所述基体的环氧基的保留、酯基的水解反应或类聚合物反应。根据本发明的一个尤其优选的实施方案，使用包含水和氢氧化钠的碱性介质，其中所述氢氧化钠在所述溶液中浓度在0. I 10重量％范围内，尤其优选在0.4 4重量％范围内。所述碱性介质可以包含一种或多种添加剂。合适的添加剂特别为盐，诸如氯化钠、硫酸钠和乙酸钠，或有机溶剂。所述有机溶剂优选选自醇、酮或醚。尤其优选乙醇、甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油、丙酮、二噁烷、N-甲基吡咯烷酮、二甘醇二甲醚或其混合物。本发明的多糖基体用于材料分离以从液体介质中除去粒状、胶状和溶解的组分。待去除的组分优选为不想要的生物污染物。尤其优选待去除的组分包含来自细胞培养溶液的污染物，例如细胞、细胞碎片、细胞蛋白质、DNA、病毒、内毒素。所述去除包括来自所述液体介质的不想要生物污染物中的至少一种，而同样存在于液体介质中的目标产物作为洗脱物分离纯化。对于本发明的目的，目标产物要理解为是指生物分子。尤其优选目标产物要理解为是指蛋白质、寡肽、多肽或激素。液体介质要理解为是指能够实现待去除的成分与本发明的多糖基体的接触的所有介质。本发明的一个优势在于适当选择所述至少一种烯属单体化合物和所述至少一种配位体，使得提供具有高蛋白结合容量的多糖基体用于所需的特定材料分离应用成为可倉泛。实施例下文通过实施例更详细地解释本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明。在实施例中对CA膜的任何提及都是指一类乙酸纤维素膜，其用聚酯非织物强化且具有约3 u m的孔径(使用“毛细流孔隙度仪6. 0” Coulter孔隙度仪，CAPffIN软件系统，
Porous Materials Inc.测量)和600 700ml/(min*bar*cm2)的水通量。对于本发明的膜和比较膜来说，所有通量值都是针对pH = 7.3的20mM三(羟基甲基)氨基甲烷/HCl (TRIS/HCl)缓冲溶液以ml/(min*bar*cm2)报告。所有静态结合容量值都以mg/cm2报告。以mg/ml计的动态结合容量定义为被吸附物穿过(作为溶液)本发明的多糖基体直到所述被吸附物在多糖基体的出流中的浓度为被吸附物在入流中的浓度的规定分数时的被吸附物的量。出于实践原因，报告10%的入流浓度。除非另有规定，否则百分数都是重量百分数。实施例I :使甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝到用有机酸处理的CA膜上，变化在于在接枝液中没有交联剂、镧系元素化合物将具有240cm2的总面积的8个圆形CA膜片用反渗透(RO)水润湿，用RO水漂洗10分钟，且随后在IOOOg的表I中所列的有机酸的0. Immol水溶液中浸泡10分钟。然后，将所述膜在80°C下在循环空气干燥箱中干燥15分钟。将用有机酸处理的240cm2的CA膜固定在调节到22°C温度的反应容器的气腔中。最初将14. 6g甲基丙烯酸缩水甘油酯和
0.45g Arlatone G(Atlas)装入反应容器中且连同所述膜一起充氮气30分钟。将包含I. 5g硫酸铈(IV)、5. Og 20%强度的硫酸和478g RO水的溶液充氮气30分钟且在氮气下转移到反应容器中。将混合物搅拌5分钟。然后，将来自反应容器的气腔的膜浸泡到所述溶液中，且在约5秒之后，从溶液移回到所述气腔中。再过20分钟之后，将所述膜首先用0. 2%强度的水性硫酸漂洗5分钟且随后用流动的RO水漂洗10分钟。然后，将膜在0. 5M NaOH中振荡30分钟且用流动的RO水漂洗10分钟。比较例I :表I的比较膜根据实施例I制备，但在进行接枝之前，没有进行用表I的有机酸之一对CA膜的处理。表I含有根据实施例I接枝且根据实施例5与季铵基团反应的膜与未用有机酸处理但在其它方面首先根据实施例I且随后根据实施例5以同样方式反应的圆形CA膜片(“比较膜”)的关于通量和对于牛血清蛋白的容量的数据。通过使用用有机酸处理的膜，与比较膜相比较，当所用的有机酸为柠檬酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、马来酸、丁二酸、乙二酸、丙二酸、抗坏血酸、D-葡糖醛酸或乳酸时，可以使对于BSA的静态结合容量增加I. 5 8. 4 倍。
表 I :
权利要求
1.多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖基体，在其表面上固着衍生自至少一种具有官能团的烯属单体化合物的接枝聚合物， 所述多糖基体如下制备 -在具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X = -0、-S或-N的酸性XH基团的有机酸，和 -过渡金属或镧系元素化合物 存在下， -用所述至少一种具有官能团的烯属单体化合物接枝 -多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖起始基体， 以产生接枝到所述多糖起始基体上的具有官能团的聚合物。
2.根据权利要求I所述的多糖基体,其中所述多糖起始基体由多糖组成。
3.根据权利要求I所述的多糖基体，其中所述多糖起始基体为具有多糖涂层的多孔载体。
4.根据权利要求3所述的多糖基体，其中所述多孔载体由聚合物组成，所述聚合物选自聚酰胺、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、它们的共聚物或其混合物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多糖基体，其中所述多糖选自纤维素酯、纤维素醚、水合纤维素、琼脂糖、几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖或其组合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多糖基体，其中所述至少一种烯属单体化合物为(甲基)丙烯酸衍生物且所述烯属单体化合物的所述官能团为潜离子基团、疏水基团和/或环氧基团。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多糖基体，其中所述过渡金属或镧系元素化合物选自铺、猛、铁、镍、钴、钥;化合物或其组合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多糖基体，其中所述具有至少一个羧酸基团和/或至少一个酸性XH基团的有机酸选自柠檬酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、马来酸、丁二酸、乙二酸、丙二酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、乳酸或其组合，且其中X = -O。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多糖基体，其中，在接枝之后，接枝到所述多糖起始基体上的所述聚合物的官能团与能够同流体中存在的被吸附物相互作用的至少一种配位体反应。
10.根据权利要求9所述的多糖基体，其中所述配位体包含阳离子基团、阴离子基团和/或疏水基团。
11.根据权利要求10所述的多糖基体，其中，在接枝之后，接枝到所述多糖起始基体上的所述聚合物的官能团与两种不同的配位体反应，其中第一配位体包含阴离子基团且第二配位体包含疏水基团。
12.根据权利要求11所述的多糖基体，其中所述第一配位体包含磺酸基团或能转变成磺酸基团的基团且其中所述第二配位体为苯胺或4-氨基苯磺酸。
13.制备根据前述权利要求I 8中任一项所述的多糖基体的方法，其包括以下步骤 A)提供用具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X = -O、-S或-N的酸性XH基团的有机酸处理的多孔的多糖起始基体，和B)使用包含过渡金属或镧系元素化合物和至少一种具有官能团的烯属单体化合物的混合物接枝在步骤A)中提供的所述基体，以产生接枝到所述多糖起始基体上的具有官能团的聚合物。
14.制备根据前述权利要求I 8中任一项所述的多糖基体的方法，其包括以下步骤 A)提供用过渡金属或镧系元素化合物处理的多孔的多糖起始基体，和 B)使用包含具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X= -O、-S或-N的酸性XH基团的有机酸和至少一种具有官能团的烯属单体化合物的混合物接枝在步骤A)中提供的所述基体，以产生接枝到所述多糖起始基体上的具有官能团的聚合物。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，在步骤B)中的接枝之后，接枝到所述多糖起始基体上的所述聚合物的官能团在随后的步骤C)中与能够同流体中存在的被吸附物相互作用的至少一种配位体反应。
16.根据权利要求13 15中任一项所述的方法，其中所述多糖选自纤维素酯、水合纤维素、纤维素醚、琼脂糖、几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖和/或其组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多糖为纤维素酯且在步骤B)之后、在步骤C)期间或在步骤C)之后所述基体用碱性介质进行附加处理。
18.根据权利要求I 12中任一项所述的多糖基体在材料分离中的用途。
19.根据权利要求18所述的多糖基体的用途，其中根据权利要求12所述的多糖基体用作用于纯化生物分子的阳离子交换剂。
全文摘要
本发明涉及一种多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖基体，在其表面上固着衍生自至少一种具有官能团的烯属单体化合物的接枝聚合物，其中所述多糖基体通过在具有至少一个羧酸基团和/或至少一个其中X＝-O、-S或-N的酸性XH基团的有机酸和过渡金属或镧系元素化合物存在下，所述至少一种烯属单体化合物接枝多孔的、非粒状、可对流渗透的多糖起始基体来制备。本发明的多糖基体具有高蛋白结合容量。本发明进一步涉及用于制备所述多糖基体的方法及所述多糖基体在材料分离中的用途。
文档编号B01J20/285GK102802781SQ201080026238
公开日2012年11月28日 申请日期2010年4月23日 优先权日2009年6月13日
发明者汉斯-海因里希·霍尔, 沃尔夫冈·德莫尔, 勒内·法贝尔, 克里斯蒂安·布拉姆 申请人:赛多利斯司特蒂姆生物工艺公司