0074] 本发明的某些实施方案提供了以下优点：沉淀方法可以基于沉淀剂的过饱和水 平，但是不基于这样的试剂的溶解度水平。例如，可溶性的尿囊素对病毒溶解度不具有实际 影响，而过饱和的尿囊素会共沉淀病毒。因而，随后通过简单地加入水来溶解带有结合的病 毒的以前过饱和的尿囊素，会从新溶解的尿囊素释放病毒。实验数据指示，酰脲（包括尿囊 素）的结合病毒、但是不结合蛋白的能力，将尺寸组分反映为它的选择性。这又指示，酰脲 修饰的表面会提供平行能力来净化其它种类的微生物，并潜在地灭活那些种类中的至少一 些。这样的种类可以包括细菌、支原体属和原生动物。
[0075] 在某些实施方案中，过饱和的尿囊素选择性地结合大生物靶标（诸如病毒）的明 显能力可以用于增强病毒的生物学功能的故意暂停，例如在目的在于灭活病毒使其丧失感 染其正常宿主的能力的情况下。这样的应用包括：通过低pH处理来灭活病毒（在包括尿囊 素的情况下），或通过用有机多价阳离子（诸如依沙吖啶、亚甲蓝、苯扎氯铵、氯己定）或有 机多价阴离子（诸如辛酸）处理来灭活病毒，或通过非离子型有机溶剂诸如三（正丁基） 磷酸盐（可能与非离子型表面活性剂组合），或通过独立于三（正丁基）磷酸盐的表面活性 剂，或前述物质的组合来灭活病毒。尿囊素的通过氢键合发生结合的明显能力意味着，它不 会干扰这些灭活处理，并且它本身不被这些灭活处理干扰。除了所述具体灭活方法以外且 独立于所述具体灭活方法，过饱和的尿囊素的结合病毒并由此从样品物理地除去所述病毒 的能力，应当理解为直接促进来自给定样品的感染性病毒的总体减少。
[0076] 在某些实施方案中，与表面结合的不溶性酰脲可以结合内毒素，但是奇怪地几乎 不表现出结合DNA的能力。这会扩展这样的实施方案从蛋白制品和/或含有DNA质粒的制 品除去内毒素和/或病毒的潜在效用。在DNA存在于与其它样品组分形成的稳定复合物中 的其它实施方案中，通过除去所述DNA所结合的复合物，尿囊素具有除去DNA的作用。
[0077] 在某些实施方案中，提供了试剂盒，其用于方便地实施本文中公开的任意方法。这 样的试剂盒可以包括试剂和一套关于实施所述方法的普通说明书。除了试剂盒以外，本领 域技术人员会认识到，本文中公开的方法可以定制成用在不同的应用中，诸如在抗病毒和/ 或抗微生物呼吸过滤器、面罩、水的紧急解毒系统等当中。
[0078] 应当理解，前述的一般描述和下述的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，并 且不限制要求保护的发明。 实施例
[0079] 下述实施例解释了这样的方法：通过所述方法，可以实施本发明的各方面，或可以 制备适合于实施本发明的某些实施方案的材料。
[0080] 实施例1.通过用尿囊素共沉淀来纯化病毒，即噬菌体M13。通过以7%的重量/ 体积比加入尿囊素，共沉淀噬菌体细胞培养物上清液。pH为约7.0。电导率为20mS。通过 将尿囊素溶解在50mM H印es、150mM NaCl(pH 7.0)中，回收病毒。噬菌体回收率为约70%。 与上清液一起消除了大于99%的蛋白和小分子污染物。
[0081] 实施例2.噬菌体M13的共沉淀。在5. 0、6.0的pH值和8.0%尿囊素，重复实施例 1。如从上清液的除去所判断的，在2个实施例的范围内的共沉淀效率与pH反相关。
[0082] 实施例3.噬菌体M13的共沉淀。在与40、60、80和100mS/cm的电导率值对应的 NaCl浓度，重复实施例1。这些盐浓度对应于约400、600、800和IOOOmM NaCl。如从样品除 去病毒所判断的，沉淀效率与电导率直接相关。最佳共沉淀发生在400mM NaCl。这被解释 为反映了病毒颗粒之间的相互静电排斥的抑制，具有支持酰脲表面上的颗粒的更高填装密 度的结果。
[0083] 实施例4.噬菌体M13的共沉淀。用3%、5%和10%尿囊素，重复实施例1。如从 上清液的除去所判断的，共沉淀效率与尿囊素浓度直接相关。回收率分别从约31 %增加至 57%、至 91%。
[0084] 实施例5.噬菌体M13的共沉淀。用在400mM NaCl (pH 6. 0)中的7%尿囊素沉淀 噬菌体细胞培养物上清液。大多数蛋白和小分子污染物与上清液一起消除。估测的回收率 超过90%。通过将尿囊素溶解在50mM Hepes (pH 7.0)中，然后通过超滤进行浓缩，回收病 毒。通过分析型阴离子交换色谱法估测得自组合方法的纯度超过90% ;回收率为约80%。
[0085] 实施例6.减毒的登革热病毒的共沉淀。将减毒的登革热病毒与在600mM NaCl (pH 6.0)中的7%尿囊素组合。除去上清液。通过将尿囊素溶解在50mM !fepes(pH 7.0)中，回 收病毒。通过免疫测定估测的回收率为70-80%。宿主蛋白污染减少了 99. 3%。
[0086] 实施例7.通过加入10%的量的尿囊素，在生理条件下共沉淀含有IOltl个颗粒/mL 的鼠细小病毒的病毒培养物。上清液的感染试验记录了 99. 9%的病毒除去。
[0087] 实施例8.通过加入10 %的量的尿囊素，在生理条件下共沉淀含有101°个颗粒/mL 的鼠白血病病毒的病毒培养物。上清液的感染试验记录了 99. 9%的病毒除去。
[0088] 实施例9.通过用尿囊素共沉淀从蛋白制品除去病毒。通过以5%的重量/体积比 加入尿囊素，共沉淀噬菌体M13细胞培养物上清液。pH为约7.0。电导率为约15mS。在沉 淀物中消除了约60%的病毒。大多数蛋白保留在上清液中。
[0089] 实施例10.减少蛋白溶液中的内毒素。将被约50EU/mL内毒素污染的、卵白蛋白 在50mM磷酸盐、IOOmM NaCl (pH 7. 2)中的样品用3%尿囊素饱和，温育15分钟，此后通过 膜过滤除去沉淀物。上清液的内毒素含量减少了超过95%，达到小于2EU/mL。用10%尿囊 素重复实验。内毒素减少了超过99. 5%，达到小于lEU/mL。
[0090] 实施例11.使用在固体表面上的酰脲从IgG-内毒素混合物回收抗体和减少内 毒素。将内毒素加入到lmg/mL的在5mM HEPES IOOmM NaCl (pH 7.0)中的人IgG中至 22,000EU/ml。将2% (w/v)尿囊素加入到该混合物的等分试样中，并将其在室温混合15分 钟。通过离心使混悬液澄清。测量蛋白和内毒素浓度以计算抗体回收率和内毒素除去。2% (w/v)尿囊素使内毒素减少了 2倍。抗体回收率未受尿囊素的量影响。在后续系列实验中， 将尿囊素的量逐渐增加至高达10%。抗体回收率逐渐降低至在10%尿囊素时的约93%，而 内毒素除去效率增加至约99%。这些实验说明，过量的尿囊素的使用可以导致一些蛋白的 损失。在这样的情况下，本领域技术人员可以做出关于内毒素除去相对于蛋白回收率的最 多产平衡的有见识的决定，并相应地调节固相酰脲的有效性。使用在约12kDa至IMDa的尺 寸范围内的蛋白的额外实验指示这样的确定趋势：蛋白的损失随着蛋白尺寸增加而增加。
[0091] 实施例12.尿囊素和尿酸作为用于除去内毒素的基底的对比。将内毒素加入在 5mM H印es、100mM NaCl (pH 7. 0)中的 6. 7mg/mL 人 IgG 溶液至 13, 000EU/ml 的终浓度。将 1、2和4% (w/v)的尿囊素或尿酸加入该混合物的等分试样中，并将其在室温混合15分钟。 作为对照，将等量的马铃薯淀粉加入各个系列中。最后，通过离心将反应混合物澄清。测量 蛋白和内毒素浓度以计算抗体回收率和内毒素除去。在加入淀粉的情况下，没有内毒素减 少。所有浓度的尿酸产生了 4倍减少。尿囊素在实验之间使内毒素减少了 5-10倍（低至 高）。抗体回收率总是大于90%。除了尿酸的较差性能以外，结果不随尿酸的量而变化的 事实是令人迷惑的，并且凸显了尿囊素是优选的开始酰脲。
[0092] 实施例13.通过加入尿囊素加速澄清哺乳动物细胞收获物。将尿囊素加入5L含 有细胞的细胞培养物收获物（其含有IgM单克隆抗体以及常见范围的污染物）中至1%的 终浓度。将容器轻轻涡旋以混合组分。尿囊素和未知细胞培养组分之间的相互作用造成该 量的尿囊素完全溶解，所以加入另外的1 %，使得总加入量达到2% (w/v)。再次将容器涡旋 以混合组分。尽管已经观察到微粒材料在加入尿囊素之前非常缓慢地沉降且在有1 %尿囊 素存在下仅稍微更快，但是2%尿囊素明显地加快沉降速率，并且使细胞培养物上清液光学 上澄清地闪烁。1%和2%尿囊素之间的差异被解释为以下指示：由于一些溶解物质在样品 中的存在，1%尿囊素几乎完全被样品溶解。随后轻轻倒出上清液。这会非故意地再悬浮沉 淀物的一部分，随后将其离心以沉淀剩余的固体。除了它的病毒和内毒素除去能力以外，这 凸显了本发明的提高细胞收获物澄清质量的能力。它也凸显了用至少2%的尿囊素浓度进 行初步试验的实用性。它进一步凸显了以下重点：尿囊素的溶解度可能受样品组分影响，结 果是最终通过实验确定尿囊素的过饱和浓度，尽管它的已知的在水中的溶解度可能提供有 用的初步指导。
[0093] 实施例14.通过加入尿囊素澄清大肠杆菌裂解物。用微流化仪在16, OOOx g，将 20克大肠杆菌糊状物在250mL 50mM Hepes (pH 7.0)中匀浆化。然后将匀浆物在15, OOOx g离心1小时，以除去最大的微粒物质。这产生褐色浑浊上清液。将干燥的尿囊素直接加入 上清液中至5% w/v的终浓度。将混合物涡旋约1分钟，然后使其沉降。不溶物在几分钟 内沉降，剩下光学上闪烁的澄清上清液，其含有超过90%的存在于原始匀浆物中的蛋白产 物。将上清液容易地穿过0. 22微米膜滤器，其中在尿囊素处理之前的上清液实际上在接触 后堵塞滤器。本实施例凸显了尿囊素的显著改善经处理的样品的过滤性的能力。
[0094] 实施例15.有机添加剂对尿囊素亲和步骤的影响。通过尿囊素亲和，用与0.01% 依沙吖啶组合的1%尿囊素处理含有细胞的哺乳动物细胞培养物收获物（其含有单克隆 IgG)。使样品（在约7. 2的pH和约13. 5mS的电导率，这些条件对应于所谓的生理条件） 穿过用色谱介质填充的柱，所述色谱介质包括等量的金属亲和配体TREN(BioWorks TREN hi-sub)和疏水配体（Macroprep T-butyl)。在前一步骤以后的抗体回收率是99%。DNA 减少了 3. 51og，病毒减少了 4-51og。另外，经处理的样品是闪烁澄清的，具有约2. ONTU的 浊度，从而指示微粒的接近完全除去。
[0095] 实施例16.遵循实施例15的形式，但是在一系列实验进程中增加尿囊素的量，包 括2%、4%和8%。抗体回收率以大致线性方式与尿囊素的量成反比地下降。尽管在1% (实施例15)的回收率为99%，但是在8%的回收率为约87%。
[0096] 实施例17.通过尺寸排阻色谱法，分析了如在实施例15和16中所述处理的IgG。 结果表明，聚集体含量随着尿囊素增加而大致线性下降，但是聚集体含量的下降大于在实 施例16中注意到的抗体损失。在遵循实施例15的聚集体含量为约5%的情况下，它下降至 在8%尿囊素时的约1. 3%。膜澄清的缺乏尿囊素的细胞收获物的聚集体含量为约19%。 还观察到，递增量的尿囊素优先减少较高分子量的聚集体。本实施例凸显了本发明的以下 功能特征：过饱和的尿囊素优先结合较高分子量的生物靶标。它也凸显了以下重要启发观 点：可以调节用于处理特定生物靶标的尿囊素的实际量，以有利于聚集体除去或抗体回收 率。
[0097] 实施例18.将尿囊素和依沙吖啶加入补充了 5%血清的单克隆IgM上清液中，至分 别为1% (过饱和）和0.02%的终浓度。通过离心使上清液澄清，然后流过填充的色谱床 (20mL上清液/mL填充