一种表层有机-无机杂化核壳型多糖手性固定相的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种表层有机-无机杂化核壳型多糖手性固定相的制备方法，具体的说是一种以区域含有三乙氧基硅的多糖衍生物与硅烷偶联剂为硅源，采用溶胶凝胶法及层层自组装技术制备了核壳型有机-无机杂化多糖手性固定相，应用于高效液相色谱对映体的手性拆分领域。
【背景技术】
[0002]药物研发是各国科学家研究热点，而现有手性色谱分离及制备技术的发展极大促进手性新药研发与推广。手性色谱分离技术的关键是手性固定相，多糖类衍生物固定相是常用的手性固定相之一，具有容易保存及分离范围广等特点。传统的手性填料是以硅胶为基质，对其处理后得到氨丙基硅胶，然后在氨丙基硅胶上涂覆或键合上多糖衍生物。当用氯仿、四氢呋喃等溶剂作为流动相时涂覆固定相容易发生溶胀。采用原位聚合或间隔臂法将多糖衍生物键合容易降低多糖衍生物高度有序性，从而降低固定相的手性拆分性能。
[0003]有机-无机杂化材料是一种有机组分和无机组分在分子水平上以共价键的方式结合的材料。有机官能团引入到材料中，不仅增强材料的耐碱性，而且大大增加有机的含量，进而提高手性固定相负载量，同时可以很好的解决溶胀问题。狄斌等在中国专利200910213018.9公开了一种常规杂化有序介孔硅胶色谱固定相填料及制备方法，将以氨丙基三乙氧基硅烷和1，2-二(三乙氧基硅基)乙烷作为硅源采用一步缩聚法制的。其固定相柱压低，对甲苯、苯及蒽具有较好的分离效果。任其龙等在中国专利2012100111495.9公开了一种基于纤维素衍生物的杂化手性固定相及其制备方法，是将纤维素衍生物溶解后与硅烷偶联剂进行反应，得到基于纤维素衍生物杂化固定相。但采用以上方法制备的此类固定相的有机含量过高，溶胀问题依然存在。小分子杂化手性固定相的合成较容易，但因手性分离的对映体有限，应用范围受限。
[0004]尽管有机-无机杂化材料具有高的机械性能及较强的耐酸碱性能，但难以合成分散性好、粒径均一(3-5 μ m)及合适比表面积的硅球，因而极大限制杂化材料在高效液相色谱中的应用。且多糖衍生物难溶于水及其醇，因而传统的水热合成法无法制备出多糖类的杂化球。其中，核壳型固定相多见于常规HPLC分离，化合物在核壳型柱中的扩散路径变短因而分离速度快、峰的对称性好、分离效率高。它是由中心的核和外部的壳层组装而成的，一般通过层层自组装、模板法和溶胶凝胶法等制备，制备方法已比较成熟。因此，将杂化介孔材料及核壳型材料结合，采用溶胶凝胶法和层层自组装法制备一种新型有机-无机杂化核壳结构的多糖手性固定相。目前表层有机-无机杂化核壳型的多糖类固定相国内尚未报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供了一种有机-无机杂化核壳结构的多糖手性固定相的制备方法，制备的手性固定相拥有良好的机械性能、抗溶胀能力和手性分离能力。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下实施方案:
本发明主要分为多糖衍生物的制备、硅球酸碱预处理、表面活性剂组装、杂化硅溶胶制备和溶胶组装五个步骤。多糖衍生物的制备是指在多糖的2_，3-和6-位分别衍生各种功能基团，制备一系列的多糖衍生物。硅球预处理是将硅球先后浸入到氨水和盐酸组成的混合液中进行酸碱处理，真空干燥硅球；再将酸碱处理的硅胶浸入到含有表面活性剂的水溶液中，在超声振荡器中进行表面活性剂组装。杂化硅溶胶制备过程是将含有三乙氧基硅的多糖衍生物与硅烷化试剂在酸性条件下通过溶胶凝胶法制备有机-无机杂化硅溶胶。溶胶组装过程是将表面活性剂组装的硅胶浸入杂化硅溶胶中，通过吸附作用将硅溶胶组装到硅球表面。经过多次表面活性剂和杂化硅溶胶的交替组装，制备得到本发明有机-无机杂化核壳结构的多糖手性固定相。
[0007]一种表层有机-无机杂化核壳型多糖手性固定相的制备方法，其特征在于步骤为:
O多糖衍生物的制备:将干燥的微晶纤维素溶于无水吡啶中，加入三苯基氯甲烷保护纤维素6-位羟基，80-900C反应，加入3，5- 二甲基苯基异氰酸酯，继续反应，将溶液倒入甲醇中，6-位三苯基甲烷保护的纤维素衍生物沉淀析出，布氏漏斗抽滤，甲醇洗涤；然后将该衍生物在含有少量盐酸的甲醇溶液里水解去保护，抽滤，甲醇洗涤，得到6-羟基-2，3- 二(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素；将6-羟基纤维素衍生物溶解于N，N' -二甲基乙酰胺(DMAC)、无水氯化锂和吡啶的混合液中，加入3-(三乙氧基硅)丙基异氰酸酯，80-90°C反应，再加入1.5倍纤维素摩尔量的3，5- 二甲基苯基异氰酸酯反应，倒入甲醇中，纤维素衍生物沉淀析出，抽滤，甲醇洗涤，60°C真空干燥，得到纤维素6-位含有不同含量的三乙氧基硅基丙基-2，3- 二(3，5- 二氯苯基氨基甲酸酯)纤维素衍生物；
2)硅球预处理:将硅球用蒸馏水清洗后，先后浸入由蒸馏水、氨水、过氧化氢组成的混合液和由蒸馏水、浓盐酸、过氧化氢组成的混合液，静置浸泡，用无水乙醇和蒸馏水洗涤硅球，直至洗涤液为中性，60°C真空干燥；
3)表面活性剂组装:将已经酸碱处理过的干燥硅小球浸入到十六烷基溴化铵(CTAB)表面活性剂溶液中，进行超声处理，乙醇洗涤硅球，60°C真空干燥；
4)杂化硅溶胶制备:将步骤I)制备纤维素衍生物溶于N，N'- 二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入硅烷试剂、乙醇、表面活性剂和酸催化剂，室温反应，制备得到有机-无机杂化硅溶胶；
5)溶胶组装:步骤2)所处理的硅球加入到有机-无机杂化硅溶胶中，组装0.5-3h，静置0.5-lh，乙醇离心洗涤，60°C真空干燥；
6)重复步骤3)至5)过程，交替组装数次，将硅球加入乙醇中，搅拌，过滤，60°C真空干燥，制备得到有机-无机杂化核壳结构的纤维素手性固定相。
[0008]本发明步骤I)所述的多糖衍生物包括微晶纤维素、直链淀粉、支链淀粉、纳米纤维素、纳米直链淀粉和纳米支链淀粉；多糖衍生物6位羟基保护反应所用试剂的比例关系为，多糖衍生物:吡啶:三苯基氯甲烷:苯基异氰酸酯衍生物:甲醇=lg:50mL:3.5g:5mL:400mL ；多糖衍生物6位去保护反应所用试剂的比例关系为，多糖衍生物:盐酸:甲醇=Ig:3mL:400mL ;多糖6-位羟基衍生反应所用试剂的比例关系为，多糖衍生物:DMAC:氯化锂:吡啶:甲醇=Ig: 20mL: 1.5g:60mL: 400mL，加入多糖衍生物6位羟基摩尔量2-99.9%的3-(三乙氧硅的基)丙基异氰酸酯，对多糖的6-位进行区域选择性衍生反应，多糖6-位上3-(三乙氧硅基)丙基的取代度为2-99.9%，然后再对多糖6-位剩余羟基与苯基异氰酸酯衍生物反应。
[0009]本发明步骤I)所述的所用苯基异氰酸酯衍生物包括3，5- 二甲基苯基异氰酸酯、3，5- 二氟苯基异氰酸酯和3，5- 二氯苯基异氰酸酯。
[0010]本发明步骤2)所述的硅球粒径在5-20微米，孔径为100-1000埃；蒸馏水和过氧化氢混合液的体积比为15mL: lmL，碱性混合液由氨水调节pH=7_8 ;酸性混合液由浓盐酸调节pH=2-4 ;硅球质量与混合液的体积比为lg: 15-20mL。
[0011]本发明步骤3)和4)所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基氯化铵；步骤3)所用表面活性剂的浓度为0.025mol/L，硅球质量与表面活性剂的体积比为lg: 20mL。
[0012]本发明步骤4)所述的溶解多糖衍生物所用溶剂可选用四氢呋喃、吡唆、DMF、丙酮、DMAC或二甲亚砜。所用的硅烷试剂为正硅酸乙酯、1，2-双(三乙氧基硅)乙烷、双三硅氧基甲基硅烷或(三乙氧基硅基)环己烷；所用的酸催化剂为盐酸、硫酸、磷酸、或硝酸的一种或两种；所用试剂的比例关系为，多糖衍生物:溶解多糖衍生物溶剂:硅烷试剂:水:乙醇:表面活性剂:酸催化剂=0.05-0.40 g: 25-45 mL: 1-10 mL: 2 mL: 0.1 g: 0.25mL。
[0013]本发明步骤5)所述的硅球质量与有机-无机杂化硅溶胶的体积比为lg: 10_20mL。
[0014]本发明步骤6)所述的组装次数为2-8次，加入硅球的质量与乙醇的体积比为Ig:150mLo
[0015]本发明具有以下优点:
本发明利用层层自组装技术及溶胶凝胶法，制备了表层有机-无机杂化核壳型的多糖手性固定相。本发明制备的核壳手性固定相具有制备过程简单、多糖衍生物的负载量可控以及机械强度好等特点，并且还具有良好的手性化合物拆分性能。正相条件可以采用含有氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃等溶剂作为流动相添加剂改善色谱柱手性分离性能。在反相条件下也可以使用乙腈、氯仿、甲醇、四氢呋喃等极性溶剂进行对映体的拆分。使用极性溶剂做流动相，增强了手性固定相的溶剂使用范围，并且仍然保持较好的耐溶胀性能。
[0016]本发明所制备核壳手性固定相可广泛应用于制药、天然药物化学、化学合成、生物及生化等领域产品中手性化合物的分离分析以及工业制备。
【附图