一种可识别adp-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法
【专利摘要】本发明介绍了一种对ADP?核糖基化蛋白质具有分子识别功能的核?壳结构的分子印迹聚合物微球的制备方法。首先通过可逆加成—断裂链转移（RAFT）沉淀聚合反应制备出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核；然后将模板、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应溶剂中进行第二步聚合反应，从而使得微球表面形成一层较薄的分子印迹外壳层；最后使用洗脱剂将模板分子移除后，在微球表面的分子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴，得到可用于对ADP?核糖基化蛋白质的特异性识别与富集的分子印迹材料。
【专利说明】
一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于分子印迹功能材料技术领域，是一种基于分子印迹技术制备对ADP-核糖基化蛋白具有特异识别功能的聚合物材料，可用于ADP-核糖基化蛋白的专一性识别与分离。【背景技术】
[0002]二磷酸腺苷核糖基化(ADP-ribosylat1n)是一种蛋白质的翻译后修饰过程，gp通过腺苷二磷酸核糖基转移酶将二磷酸腺苷核糖基团从NAD+转移到翻译后的目标蛋白质。这种蛋白质翻译后修饰涉及到很多重要的细胞过程，包括DNA修复、转录、翻译、细胞信号传导以及细胞凋亡，研究发现此过程还与很多疾病的产生相关，例如癌症、糖尿病、神经退行性疾病和心脏衰竭。因此，ADP-核糖基化具有重要的临床治疗意义。为了理解ADP-核糖基化的机制，对于ADP-核糖基化蛋白质进行识别和富集就变得非常重要。
[0003]目前，已经开发出识别或富集ADP-核糖基化蛋白质的方法包括:使用NAD+及其衍生物[J.Zhang, S.H.Snyder，B1chemistry《生物化学》1993，32，2228-2233;J.Zhang, Methods Enzymol.《方法酶学》? 1997，280，255-265],重组大分子结构域[N.Dani, A.Stilla, A.Marchegiani, A.Tamburro, S.Till, A.G.Ladurner, D.Corda, M.Di Girolamo, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A?《美国科学院进展》.2009, 106, 4243-4248],抗ADP-核糖基抗体[T.Lischke, V.Schumacher, J.ffesolowski , R.Hurwitz , F.Haag, F.Koch-Nolte, H.ff.Mittriicker, Eur.J.1mmunol.《欧洲免疫学杂志》2013, 43，1828-1838]，以及对于ADP-核糖基化蛋白质具有高亲和力的物质(例如磷酸盐亲和材料和硼酸盐亲和材料)[H.0kayama, K.Ueda, 0.Hayaishi, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.《美国科学院进展》1978，75，1111-1115]。然而，由于这种蛋白质翻译后修饰的动态性、异构性和不稳定性，没有任何一种单一的方法可以适用于所有类型的ADP-核糖基化过程，因此就需要研究有效识别或富集ADP-核糖基化蛋白质的新方法和新材料。
[0004]分子印迹技术(Molecular Imprintitng Technique，MIT)[G.Wulff, A.Sarhan, Angew.Chern.1nt.Ed?《德国应用化学》1972，11，341_345;G.Vlatakis, L.1.Andersson, R.MUller, K.Mosbach, Nature《自然》1993，361，645-647]也叫分子模板技术，属于超分子化学研究范畴，是一种合成具有仿生识别功能的高分子聚合物的方法，即以某一特定的目标分子为模板，制备出对该分子有特异选择性的聚合物的过程，这种高分子聚合物被称为分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，MIP)。由于其具有较好的稳定性和较低的成本，分子印迹聚合物被认为是潜在的生物识别分子(例如抗体和受体)的替代材料，并且已被发现其可应用于分离、传感、催化和药物设计等多个方面[姜忠义，吴洪.《分子印迹技术》，北京:化学工业出版社，2003]。虽然，已有报道利用分子印迹技术制备可特异识别目标蛋白的分子印迹聚合物[W.Zhang, W.Liu, P.Li, H.Xiao, H.Wang, B.Tang, Angew.Chem.1nt.Ed?《德国应用化学》2014，53，12489_ 12493; X.L.Zhao, D.Y.Li, X.ff.He, ff.Y.Li, Y.K.Zhang, J.Mater.Chem.B 《材料化学杂志》2014，2，7575-7582，S.Shinde, A.Bunschoten, J.A.W.Kruijtzer, R.M.J.Liskamp, B.Sellergren, Angew.Chem.1nt.Ed.《德国应用化学》2012， 51， 8326-8329; Z.Bie， Y.Chen, J.Ye, S.Wang and Z.Liu, Angew.Chem.1nt.Ed.《德国应用化学》2015，54，10211-5]，但是对于可识别ADP-核糖基化蛋白质的分子印迹聚合物尚未见报道。
【发明内容】
[0005]为了克服现有方法的不足，本发明提供了一种可特异识别ADP-核糖基化蛋白质的核壳型分子印迹聚合物微球的制备方法，它是利用分子印迹技术制备仿抗体分子识别性能的功能性材料。
[0006]为获得上述可特异识别ADP-核糖基化蛋白质的核壳型分子印迹聚合物微球，本发明的技术方案如下:首先通过可逆加成一断裂链转移(RAFT)沉淀聚合反应制备出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核;然后将模板、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应溶剂中进行第二步聚合反应，从而使得微球表面形成一层较薄的分子印迹外壳层； 最后使用洗脱剂将模板移除后，将会在微球表面的分子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴。
[0007]优选地，如上所述的可逆加成一断裂链转移(RAFT)沉淀聚合反应可以是光引发、 或者热引发。
[0008]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，聚苯乙烯微球内核的制备中加入聚合单体、交联剂的摩尔比为1:3?5，功能单体、交联剂在反应体系中的体积百分数1~5%;引发剂的量为聚合单体和交联剂总量的0.5?2%，引发剂与链转移剂的摩尔比1:3?9,链转移剂与引发剂的总量为聚合单体和交联剂总量的3? 10%〇
[0009]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，聚苯乙稀微球内核的制备条件:聚合反应前，反应体系通氩气或者氮气5?60min，除氧，然后在氩气或者氮气气氛下反应3~12小时、反应温度60?70° C。
[0010]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，分子印迹壳层的制备是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙烯微球内核的反应体系中，通过第二步聚合反应在聚苯乙烯微球形成一层较薄的分子印迹外壳层。其中功能单体、交联剂的摩尔比为1:3?5，功能单体、交联剂在反应体系中的体积百分数1?5%，引发剂的量为功能单体和交联剂总量的0.3?2%，模板分子与功能单体的摩尔比1:1 ?4、聚苯乙烯微球内核的用量50?200mg，所用模板为腺苷(A)，或者单磷酸腺苷(AMP)，或者双磷酸腺苷(ADP)，或者三磷酸腺苷(ATP)中的一种。
[0011]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，所用的功能单体为:丙烯酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶中的一种。
[0012]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，所用的交联剂为:二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、二甲基丙烯酸丁二醇酯(TDMA)、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯(了1?頂)4小’-亚甲基双丙烯酰胺或1『-乙烯基双丙烯酰胺中的一种。[〇〇13]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，所用引发剂为:偶氮类如AIBN或过氧化物类自由基引发剂。[〇〇14]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，所用链转移剂为:双硫酯如BDC或三硫酯。
[0015]优选地，如上所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，所用的溶剂为:乙腈、二甲亚砜、甲醇、或甲醇和水的混合物中的一种。
[0016]本发明与现有技术相比，具有如下的优点:1、本方法采用腺苷一 ADP-核糖基团的一部分，而不是整个修饰性蛋白作为印迹模板， 采用腺苷作为印迹模板具有三点优势:第一，作为ADP-核糖基的末端部分结构，腺苷是所有 ADP-核糖基化蛋白质的共同特征结构，并且选择腺苷而不是整个ADP-核糖基化蛋白质作为识别目标可以降低识别的复杂性;第二，与蛋白质大分子相比较，腺苷作为一种小分子，更容易进行分子印迹;第三，腺苷还是一种容易获取且价格低廉的模板分子。
[0017]2、这种具有核壳结构的腺苷分子印迹聚合物微球不仅对于腺苷能进行特异性识另IJ，而且对于ADP-核糖基化的蛋白质也表现出良好的选择识别性，它可以从细胞提取物的样品中识别并富集ADP-核糖基化蛋白质。【附图说明】图1为核壳型腺苷分子印迹聚合物微球的合成路线及其对ADP-核糖基化蛋白质的识别的示意图。[〇〇18]图2为实验所获得的聚苯乙烯微球核(a)、腺苷分子印迹微球(b)和非印迹微球(c) 的扫描电镜(SEM)图。
[0019]图3为实验所获得的核壳型腺苷分子印迹微球(MIP)和非印迹微球(NIP)的透射电镜(TEM)图。
[0020]图4为MIP/NIP微球对模板分子腺苷的吸附动力学图。[0021 ]图5为MIP/NIP微球对模板分子腺苷的饱和吸附性能图。
[0022]图6为MIP/NIP微球对模板分子腺苷的等温吸附图。
[0023]图7为MIP/NIP微球对模板分子腺苷及其结构类似物的选择性吸附图，其中 A，G，C和U分别表示腺苷及其类似物鸟苷、胞苷和尿苷。[〇〇24]图8为纯化蛋白样品被MIP/NIP微球吸附前后的SDS-PAGE，其中gapA表示的是ADP-核糖基化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，ck表示的是控制组(未进行ADP-核糖基化的 GAF>DH)，BSA表示的是牛血清蛋白。第1泳道为蛋白1^461~，2-4号泳道显示的是纯化的8&口八样品及其分别被MIP和NIP微球吸附之后的蛋白条带，5-7号泳道显示的是纯化的ck样品及其分别被MIP和NIP微球吸附之后的蛋白条带，8-10号泳道显示的是纯化的BSA样品及其分别被MIP和NIP微球吸附之后的蛋白条带。[〇〇25]图9为混合蛋白样品被MIP微球吸附前后的SDS-PAGE，其中gapA表示的是ADP-核糖基化的GAPDH，ck表示的是控制组(未进行ADP-核糖基化的GAPDH)，BSA表示的是牛血清蛋白。第1泳道为蛋白Marker，2-3号泳道显示的是BSA与gapA的混合样品及其分别被MIP微球吸附之后的蛋白条带，4-5号泳道显示的是BSA与ck的混合样品及其分别被MIP微球吸附之后的蛋白条带。图1 〇为细胞提取物样品被MIP/NIP微球吸附前后的SDS-PAGE。其中gapA表示的是ADP-核糖基化的GAPDH，BSA表示的是牛血清蛋白。其中，第1泳道为蛋白Marker，2-4号泳道显示的是细胞提取物样品及其分别被MIP和NIP微球吸附之后的蛋白条带，5号泳道显示的是纯化的BSA样品的蛋白条带，6号泳道显示的是纯化的gapA样品的蛋白条带。[〇〇26]具体实施方法以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明所用方法为常规技术，所用试剂均为采购试剂。[〇〇27]实施例1:聚苯乙烯微球的制备(1)将反应所需用量的聚合单体苯乙烯、交联剂EGDMA、链转移剂BDC、以及引发剂AIBN 用适量乙腈溶剂溶解后，放置在30mL玻璃小瓶中混合均匀，然后将聚合反应液转移至100mL 三口圆底烧瓶中并将溶剂乙腈补充至50mL，室温下磁力搅拌lOmin后上端加装三通玻璃管， 持续抽真空和通入氮气，依次往复40min，以除去氧气。[〇〇28](2)将装有反应液的密闭容器放置在磁力搅拌器上，调节适当转速持续搅拌，70 °C下油浴加热，反应至所需时间后将其取出，聚合单体发生聚合从而制备聚苯乙烯微球(CP)， 反应过程中利用三通管的气球装置始终保持密闭容器的氮气气氛。[〇〇29](3)使用0.45M1有机相滤膜真空抽滤制备好的CP，从而除去乙腈溶剂，然后将滤膜上的白色固体转移至装有50mL甲醇的锥形瓶中，磁力搅拌洗脱30?60min，依次重复洗脱四次，以除去微球表面的单体残留，最后收集滤膜上已干燥的白色粉末。
[0030] 实施例2:分子印迹和非分子印迹壳层的制备(1)将反应所需用量的模板分子腺苷、功能单体丙烯酰胺、交联剂EGDMA以及引发剂 AIBN用适量DMS0溶剂溶解后，称取0.15g CP微球并一起放置在30mL玻璃小瓶中混合均匀， 然后将聚合反应液转移至100mL三口圆底烧瓶中并将溶剂DMS0补充至50mL，室温下磁力搅拌lOmin后上端加装三通玻璃管，持续抽真空和通入氮气，依次往复40min，以除去氧气。 [〇〇31](2)将装有反应液的密闭容器放置在磁力搅拌器上，调节适当转速持续搅拌，70 °C下油浴加热，反应至所需时间后将其取出，反应液发生聚合从而制备腺苷分子印迹聚合物 (MIP)，反应过程中利用三通管的气球装置始终保持密闭容器的氮气气氛。[〇〇32](3)使用0.45M1有机相滤膜真空抽滤制备好的MIP，从而除去二甲亚砜溶剂，然后将滤膜上的白色固体转移至装有50mL甲醇/乙酸(9/1，v/v)混合液的1 OOmL锥形瓶中，磁力搅拌洗脱30min，依次重复洗脱五次，从而移除模板分子，最后再用甲醇洗脱一次，然后收集滤膜上已干燥的白色固体。
[0033]使用同样的方法制备非分子印迹聚合物(NIP)而其中不加入腺苷模板分子。[〇〇34]实施例3:模板分子重吸附实验(1)称取2mg腺苷固体样品，溶解于2mL去离子纯水中，超声混勾，配制成lmg/mL的腺苷水溶液，然后，用移液枪从中吸取1 〇〇此，加入19.9mL去离子纯水中，超声混匀，配制成5yg/ mL的腺苷水溶液。[〇〇35](2)取2mL离心管并标记序号，然后分别称取20mg制备好的微球固体放置其中。[〇〇36](3)向每个离心管中加入lmL浓度为5yg/mL的腺苷水溶液，超声混匀后，微球浓度为20mg/mL，将其放置在恒温摇床上25°C温育16h。[〇〇37](4)离心后取上清液，0.45_水相滤膜过滤后，用US-Vis分光光度计测定其260nm处的吸光度。[〇〇38]实施例4:吸附动力学实验(1)称取2mg腺苷固体样品，溶解于2mL去离子纯水中，超声混勾，配制成lmg/mL的腺苷水溶液，然后，用移液枪从中吸取1 〇〇此，加入19.9mL去离子纯水中，超声混匀，配制成5yg/ mL的腺苷水溶液。[〇〇39](2)取16个2mL离心管并标记序号，然后分别称取20mg制备好的MIP微球和NIP微球固体放置其中，两种微球各8管。
[0040](3)向每个离心管中加入lmL浓度为5yg/mL的腺苷水溶液，超声混匀后，微球浓度为20mg/mL，将其放置在恒温摇床上25 °C下进行温育。[〇〇41 ](4)按照标号每种微球依次温育吸附0.5、1、2、4、8、12、16、20h。[〇〇42](5)离心后取上清液，0.45_水相滤膜过滤后，用US-Vis分光光度计测定其260nm处的吸光度，结果见图4。[〇〇43]实施例5:吸附容量实验(1)称取2mg腺苷固体样品，溶解于2mL去离子纯水中，超声混勾，配制成lmg/mL的腺苷水溶液，然后，用移液枪从中吸取1 〇〇此，加入19.9mL去离子纯水中，超声混匀，配制成5yg/ mL的腺苷水溶液。[〇〇44](2)取8个2mL离心管并标记序号，然后分别称取8、12、16、20mg制备好的微球固体放置其中，MIP微球和NIP微球各4管。[〇〇45](3)向每个离心管中加入lmL浓度为5yg/mL的腺苷水溶液，超声混匀后，每种微球浓度依次为8、12、16、20mg/mL，然后将其放置在恒温摇床上25 °C下温育16h。[〇〇46](4)离心后取上清液，0.45_水相滤膜过滤后，用US-Vis分光光度计测定其260nm处的吸光度，结果见图5。[〇〇47]实施例6:等温吸附实验(1)称取2mg腺苷固体样品，溶解于2mL去离子纯水中，超声混勾，配制成lmg/mL的腺苷水溶液，然后，用移液枪从中吸取200yL，加入19.8mL去离子纯水中，超声混匀，配制成10yg/ mL的腺苷水溶液。[0〇48](2 )取8个4mL离心管并标记序号，配制成浓度分别为lyg/mL、2yg/mL、3yg/mL、4yg/mL、5yg/mL、6yg/mL、7yg/mL、8yg/mL 的腺苷水溶液。[〇〇49](3)然后分别称取20mg制备好的MIP微球和NIP微球固体放置其中，两种微球各8管。
[0050](4)按照标号依次向各离心管中加入lmL浓度为l-8yg/mL的腺苷水溶液，超声混匀后，微球浓度为20mg/mL，将其放置在恒温摇床上25°C下温育16h。[〇〇511(5)离心后取上清液，0.45_水相滤膜过滤后，用US-Vis分光光度计测定其260nm处的吸光度，结果见图6。[〇〇52]实施例7:选择性吸附实验(1)分别称取腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷的固体样品各2mg，溶解于2mL去离子纯水中，超声混勾，配制成lmg/mL的腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷水溶液，然后用移液枪从中分别吸取lOOliL，加入19.9mL去离子纯水中，超声混匀，将其分别配制成5yg/mL的腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷水溶液。[〇〇53](2)取8个2mL离心管并标记序号，然后分别称取20mg制备好的MIP微球和NIP微球固体放置其中，两种微球各4管。[0054 ](3 )按照标号向每组离心管中分别加入1 mL浓度为5yg/mL的腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷水溶液，超声混匀后，微球浓度为20mg/mL，然后将其放置在恒温摇床上25 °C下温育16h。
[0055](4)离心后取上清液，0.45M1水相滤膜过滤后，用US-Vis分光光度计分别测定腺苷 260nm、鸟苷252nm、胞苷270nm、尿苷261nm处的吸光度，结果见图7〇
[0056]实施例8:纯化目标蛋白的吸附性实验 (1)称取0.60558作&固体溶解于8〇1^去离子纯水中，然后滴加11(:1调节?11至7.5，最后量筒定容至100mL，配制成pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液。[〇〇57] 用50mM Tris-HCl缓冲溶液分别配制浓度为0.3mg/mL的gapA、ck、BSA三种蛋白各 2mL〇[〇〇58](2)取6个2mL离心管并标记序号，然后分别称取12mg制备好的微球固体放置其中，MIP和NIP微球各三管。[〇〇59](3)向装有MIP和NIP微球的离心管中分别加入600yL浓度为0.3mg/mL的三种蛋白溶液，充分混匀后，微球浓度为20mg/mL，然后将其放置在恒温摇床上25 °C温育16h。
[0060](4 )离心后取上清液，蛋白制样后进行SDS-PAGE电泳以判断蛋白的浓度，结果见图 8〇
[0061]实施例9:混合蛋白液中目标蛋白的吸附性实验 (1)称取0.60558作&固体溶解于8〇1^去离子纯水中，然后滴加11(:1调节?11至7.5，最后量筒定容至100mL，配制成pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液。[〇〇62](2)用50mM Tris-HCl缓冲溶液分别配制两种混合蛋白液(0.5mg/mL BSA +0.2mg/mL gapA)以及(0.5mg/mL BSA + 0.2mg/mL ck)各2mL。[〇〇63](3)取两个2mL离心管并标记序号，然后分别称取lOmg制备好的MIP微球固体放置其中。[0〇64](4)向两个装有MIP微球固体的离心管中分别加入两种混合蛋白液(0.5mg/mL BSA+ 0.2mg/mL gapA)以及(0.5mg/mL BSA + 0.2mg/mL ck)各500此，充分混勾后，微球浓度为 20mg/mL，然后将其放置在恒温摇床上25°C温育16h。[〇〇65](5 )离心后取上清液，蛋白制样后进行SD S-PAGE电泳以判断蛋白的浓度，结果见图9〇
[0066]实施例10:细胞破碎液中目标蛋白的吸附性实验(1)称取0.60558作&固体溶解于8〇1^去离子纯水中，然后滴加11(:1调节?11至7.5，最后量筒定容至100mL，配制成pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液。[〇〇67](2)用50mM Tris-HCl缓冲溶液将表达含有ADP-核糖基化的GAPDH的细胞破碎液提取物稀释3倍，配制成2mL溶液。[〇〇68](3)取两个2mL离心管并标记序号，然后分别称取lOmg制备好的MIP和NIP微球固体放置其中。[〇〇69](4)向装有MIP和NIP微球的离心管中分别加入上述配制好的细胞提取物的稀释液，充分混匀后，微球浓度为20mg/mL，然后将其放置在恒温摇床上25 °C温育16h。
[0070](5 )离心后取上清液，蛋白制样后进行SDS-PAGE电泳以判断蛋白的浓度，结果见图10。
【主权项】
1.一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于:该 方法包括如下步骤:(1)聚苯乙烯微球的制备:通过聚合单体的可逆加成一断裂链转移沉淀聚合反应制备 出表面带有链转移基团的聚苯乙烯微球内核，所述的聚合单体是苯乙烯、丙烯酰胺、乙烯吡 啶中的一种；(2)分子印迹壳层的制备:将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂加入到含有聚苯乙 烯微球内核的反应溶剂中进行聚合反应，使得微球表面形成一层分子印迹外壳层，所述的 模板分子是ADP-核糖基化蛋白质的核糖基部分，是腺苷(A)，或者单磷酸腺苷(AMP)，或者双 磷酸腺苷(ADP)，或者三磷酸腺苷(ATP)中的一种；(3)模板分子移除:使用洗脱剂将步骤(2)的壳层中的模板分子移除，在微球表面的分 子印迹薄层中留下模板分子的印迹空穴。2.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方 法，其特征在于:步骤(1)的聚苯乙烯微球的制备方法为:(1)聚合单体、交联剂、链转移剂以及引发剂溶解后、混合均匀制成反应体系，在室温下 磁力搅拌lOmin后，持续抽真空和通入氮气或氩气5-60min;(2)将步骤(1)的反应体系继续放置在磁力搅拌器上持续搅拌，60-70 °C下反应3?12h， 制备聚苯乙烯微球；(3)使用有机相滤膜真空抽滤步骤(2)的聚苯乙烯微球，除去溶剂，然后将滤膜上的白 色固体转移至装有甲醇的容器中，磁力搅拌洗脱30?60min，重复洗脱四次，最后收集滤膜 上已干燥的白色粉末。3.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方 法，其特征在于:步骤(2)的分子印迹壳层的制备方法为:(1)模板分子、功能单体、交联剂、引发剂溶解后，与聚苯乙烯微球混合均匀制成反应体 系，在室温下磁力搅拌lOmin后，持续抽真空和通入氮气或氩气5-60min;(2)将步骤(1)的反应体系继续放置在磁力搅拌器上持续搅拌，60-70 °C下反应3?12h， 制备腺苷分子印迹聚合物。4.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方 法，其特征在于:步骤(3)的模板分子移除的方法为:使用有机相滤膜真空抽滤制备好的腺 苷分子印迹聚合物，除去溶剂，然后将滤膜上的白色固体转移至装有甲醇和乙酸混合物的 容器中，磁力搅拌洗脱30min，重复洗脱5次，移除模板分子，最后再用甲醇洗脱一次，然后收 集滤膜上已干燥的白色固体，所述甲醇、乙酸混合物中甲醇、乙酸的体积比为9:1。5.如权利要求2所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方 法，其特征在于:聚苯乙烯微球内核的制备加入的功能单体、交联剂摩尔比为1:3?5，功能 单体、交联剂在反应体系中的体积百分数1?5% ;引发剂的量为聚合单体和交联剂总量的 0.5?2%，引发剂与链转移剂的摩尔比1:3?9,链转移剂与引发剂的总量为聚合单体和交 联剂总量的3?10%。6.如权利要求3所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方 法，其特征在于:功能单体、交联剂的摩尔比为1:3?5，功能单体、交联剂在反应体系中的体 积百分数1?5%，引发剂的量为功能单体和交联剂总量的0.3?2%，模板分子与功能单体的摩尔比1:1?4、聚苯乙烯微球内核的用量50?200mg。7.如权利要求1所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球的制备方 法，其特征在于:所述的功能单体是丙烯酰胺及其衍生物，丙烯酸及其衍生物中的任一种；所述的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸丁二醇酯、三甲基丙烯酸三羟 甲基丙酯、N，N’_亚甲基双丙烯酰胺或N，N’_乙烯基双丙烯酰胺中的任一种；所述的引发剂为偶氮类或过氧化物类自由基引发剂；所述的链转移剂为双硫酯或者三硫酯；所述的溶剂为:乙腈、二甲亚砜、甲醇、或甲醇与水混合物中的任一种。8.如权利要求1-7所制备的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球，其 特征在于:聚合物微球粒径分布l〇〇nm-5iim。9.如权利要求8所述的一种可识别ADP-核糖基化蛋白的分子印迹聚合物微球，其特征 在于:该聚合物微球在分离、富集ADP-核糖基化蛋白、ADP-核糖基化蛋白组学、代谢助学、疾 病诊断、结核杆菌耐药性研究方面的应用。
【文档编号】B01J20/30GK105944692SQ201610316526
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】谢卫红, 唐彪, 刘静静
【申请人】湖北工业大学