专利名称：一种快速分析浓香型白酒窖池微生物群落结构的方法
技术领域：
本发明是关于白酒窖池微生物群落结构分析，尤其是关于浓香型白酒窖池微生物群落结构分析的一种免培养生物化学方法。
背景技术：
与本发明相关的发明、相关的技术有磷脂脂肪酸谱图技术，检索发现，有如专利申请号为200410062448. 2记载了用磷脂脂肪酸谱图技术分析土壤微生物群落的多样性，报道了一种用于分析土壤微生物群落多样性的生物化学方法，称取一定量的土壤材料；加入缓冲液和有机试剂，获得含有脂质的有机相；有机相经硅酸柱分离，收集含有极性脂的洗脱液；在碱性环境下进行甲酯化反应，得到脂肪酸甲酯；使用气相色谱-质谱联用仪定量分析脂肪酸甲酯，得到的样品中不同种类磷脂脂肪酸的含量；计算多样性指数，判断土壤微生物群落结构的多样性情况。对研究微生物群落多样性及相关研究，特别是对准确评价农田生态、并对将来的发展进行预测具有十分重要的实际意义，提供了准确快速的手段。有如专利申请号为200810031165. X记载了一种同时提取堆肥样品中PLFA和DNA的方法，提供了一种同一堆肥中同时提取和纯化磷脂脂肪酸PLFA和脱氧核糖核酸DNA的方法，该提取方法是以脂质提取方法为基础，在相分离后，脂质进入有机相，DNA留在水相及固相，最终实现 PLFA和DNA的同时提取；本发明的优点是简化了堆肥样品脂质和DNA提取的程序，保证了样品信息来源的同一性，能较好地减小堆肥取样对检测方法造成的误差，同时，在样品量很少的情况下显得更有意义。有如专利申请号为200610046016. 1记载了多环芳烃污染土壤中原为降解菌及生物修复能力鉴定方法，利用磷脂脂肪酸分析(PLFA)技术和稳定同位素比率质谱技术(IRMs)结合鉴定PAHAs污染土壤中原为高效降解菌的新方法，利用磷脂脂肪酸为生物标记物，结合稳定同位素示踪技术，根据土壤中提取磷脂脂肪酸的δ值的差异鉴定原位土壤中PAHs的降解菌或菌群，也可分析出已知菌株是否为污染土壤的土著降解菌。 该方法可有效的将微生物的群落结构和功能结合起来，提供一种可真实反应PAHs污染土壤中原位降解菌或菌群的方法，从而可以分析出所选菌株是否为污染土壤中的土著降解菌及其降解能力，方法精确度高，非常适用于PAHs污染土壤原位微生物修复研究和验证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、全貌分析浓香型白酒窖池微生物群落结构的免培养生物化学方法。为了实现上述目的，本发明是这样实现的称取一定量的窖泥和糟醅或量取一定体积的黄水，进行前处理；加入缓冲液和有机试剂，提取并得到含有脂质的有机相；经硅胶小柱分离和温和甲酯化后，通过有机试剂提取脂肪酸甲酯；使用气相色谱-质谱联用仪进行磷脂脂肪酸的定性与定量分析；分析样品的微生物群落结构。本发明的优点是为准确、全貌地分析浓香型白酒窖池微生物群落结构、跟踪分析微生物群落随不同生产阶段的演替规律，提供了准确、快速、全貌的分析手段；为微生物发酵过程的科学调控以及优质白酒的增产提供有利条件。
说明书附图中为采集自四川某知名浓香型白酒厂窖池的微生物群落结构组成的载荷图。
具体实施例方式(固态样品预处理)准确称取5.Og样品，加入30ml柠檬酸缓冲液(pH 4.0)，提取 30min, 4层纱布过滤，滤液2500r/min，离心15min，取上清液，10000r/min离心lOmin，倾去上清液，30ml柠檬酸缓冲液溶解，重复洗涤3次，收集菌团。(液态样品预处理)准确吸取20.Oml样品，10000r/min离心lOmin，倾去上清液， IOml柠檬酸缓冲液溶解，重复洗涤3次，收集菌团。取19ml提取液1(柠檬酸缓冲液甲醇氯仿为0. 8 2 1 ν/ν/ν)加至收集的菌团样品中，避光振荡萃取2h;再加入IOml提取液2(氯仿柠檬酸缓冲液为1 1 ν/ν)，避光静置萃取24h，去水相，收集有机相，40士 1°C恒温，N2吹干.加入适量氯仿溶解，转入经5ml氯仿浸润的硅胶层析小柱，分别用IOml氯仿、丙酮、甲醇逐次洗脱，收集甲醇相，40士 1°C恒温，N2吹干.随后加入Iml甲苯甲醇(1 1 ν/ν)，0. 2mol/l氢氧化钾_甲醇，37士 1°C水浴中保温15min后，lmol/1乙酸溶液将pH调至6. 0，加氯仿和超纯水各2ml，漩涡震荡5min，将有机相移入洁净样品瓶中，加入定量标准品(19 0).经配备 TR-5MS (30. OmX 320 μ mX0. 25 μ m)的 Trace GC Ultra DSQ II 检测 FAME 样品.操作条件如下所述进样口温度250°C，进样量:0. 5μ 1，分流比10 1 ；载气(He)流速:lml/min ； 起始柱温50°C，保持2min ；再以5°C /min升至220°C，保持15min ；质谱(EI)的电子强度 70eV ；离子源温度200°C ；扫描范围35 400amu.待测样品各组分质谱图与NIST 05标准谱库比对以及保留时间与37种FAME标准品的保留时间比较确定其PLFA组分；以19 O为内标，采用内标法计算各组分的含量。据此经主成分分析(PCA)得到窖池微生物群落结构组成的载荷图。
权利要求
1.一种快速分析浓香型白酒窖池微生物群落结构的方法，其特征包括以下步骤1)称(量)取适量窖池样品，经前处理后加入9ml柠檬酸缓冲液、IOml甲醇、IOml氯仿，提取样品中的脂质；2)将步骤1)中获得的有机相经硅胶层析小柱分离，分别用IOml氯仿、IOml丙酮和 IOml甲醇，收集含有极性脂的甲醇相；3)将步骤2)得到的含有极性脂的有机相加入Iml甲苯甲醇((1 1) v/v), Iml 0. 2mol/l氢氧化钾-甲醇，37°C水浴15min，进行碱性条件下温和甲酯化；4)将步骤3)得到的脂肪酸甲酯通过2ml氯仿萃取；5)向步骤4)得到的脂肪酸甲酯中加入正十九酸甲酯(19 0)定量标准品，进行GC-MS 分析；6)将步骤5)得到的样品磷脂脂肪酸分布数据，基于主成分分析法进行窖池微生物群落结构的分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中的实验材料可以为不同窖龄浓香型白酒窖池中不同类型的样品；该方法尤其适合于对窖泥、糟醅和黄水的分析。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中前处理方法为(窖泥和糟醅)加入30ml柠檬酸缓冲液(pH 4.0)，提取30min，4层纱布过滤，滤液 2500r/min,离心15min，取上清液，10000r/min离心lOmin，倾去上清液，30ml柠檬酸缓冲液溶解，重复洗涤3次，收集菌团；(黄水)lOOOOr/min离心lOmin，倾去上清液，IOml柠檬酸缓冲液溶解，重复洗涤3次， 收集菌团。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤5)中气相色谱-质谱仪采用的是Thermo Trace G⑶ltra DSQ II气质联用仪，检测中使用的升温程序如下进样口温度250°C；进样 fi:0. 5μ1 ；分流比10 1 ；载气(He)流速:lml/min ；起始柱温50°C，保持2min ；以5°C / min升至220°C，保持15min。质谱条件电子强度70eV ；离子源温度200°C ；扫描范围 35 400amu。
全文摘要
本发明涉及一种快速分析白酒窖池微生物群落结构的免培养生物化学方法，特别是应用于浓香型白酒窖池微生物群落结构的分析。具体方法如下a)称取一定量的窖泥和糟醅或量取一定体积的黄水，进行前处理；b)加入缓冲液和有机试剂，提取得到脂质组分；c)经硅胶小柱分离和温和甲酯化后，通过有机试剂提取脂肪酸甲酯；d)使用气相色谱-质谱联用仪进行磷脂脂肪酸的定性与定量分析；e)分析样品的微生物群落结构。本发明对白酒窖池微生物群落结构的相关研究，特别是分析浓香型白酒窖池微生物群落结构、微生物群落随不同生产阶段的演替规律，提供了准确、快速、全貌的分析手段，为微生物发酵过程的科学调控以及优质白酒的增产提供有利条件。
文档编号G01N30/72GK102455331SQ20101050999
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者周荣清, 秦臻, 郑佳, 黄钧 申请人:四川大学