专利名称：HLA-B*1502基因的SYBR Green I检测方法及其专用引物与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中目的基因的分子生物学检测方法，特别是涉及 HLA-B^l502基因的STOR Green I检测方法及其专用引物与试剂盒。
背景技术：
药物不良反应(ADR)指正常剂量的药物用于预防、诊断、治疗疾病或调节生理机能时出现的有害的和与用药目的无关的反应。部分ADR较轻微，但有些ADR可导致延长住院期、终生残疾甚至死亡。抗癫痫药物是引起皮肤型不良反应的常见因素。皮肤型不良反应包括轻度的斑丘疹及危及生命的严重不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens Johnson syndrome, SJS)和中毒性表皮坏死溶解症(toxic印idermal necrolysis, TEN)等。卡马西平是一种临床上广泛使用的治疗癫痫、躁狂抑郁症及神经病理性疼痛(如牙疼、偏头痛、 带状疱疹等)的药物，也是临床上常见的引起严重皮肤不良反应的因素。2007年12月12 日，美国食品药品监督管理局(FDA)发布了关于卡马西平的安全性信息，信息称，服用卡马西平(carbamaz印ine)可引起严重的皮肤不良反应(即SJS和TEN，这两种病症是严重的皮肤和粘膜反应，可导致永久性残疾甚至致命)而这种过敏反应在含人白细胞抗原等位基因HLA-B*1502的患者中更容易发生。根据国内外研究结果及统计分析显示，HLA-B^l502 等位基因与卡马西平敏感引起的严重皮肤不良反应具有很强的关联性。服用卡马西平者， 如具有HLA-B*1502基因，其产生史蒂芬强森症候群毒性表皮溶解(SJS/TEN)的风险是无 HLA-B*1502基因患者的800倍以上。HLA_B*1502基因几乎仅见于亚裔血统中(包括南亚的印度人)。在中国、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾和台湾部分地区人群中，有10-15% 携带HLA-B*1502基因，而欧洲人群中，概率仅为_2%。因此，在服用卡马西平等抗癫痫药物的亚裔人群中，开展HLA-B*1502基因的检测，对预防可能发生的严重皮肤过敏反应具有十分重要的临床意义。人白细胞抗原等位基因HLA_B*1502位于人类第六条染色体上，属于人类白细胞抗原HLA中的一型。目前，检测HLA-B*1502基因的方法主要有流式细胞仪检测法和SSP法。 流式细胞仪检测法主要检测的是细胞表面抗原的表达，通过抗原表达的百分比，来确定是否具有该基因的表型。这种方法的缺陷在于结果的稳定性上。因为在进行流式细胞仪检测前，需对检测样本进行预处理。预处理的方法及预处理的时间上的不同，有时候会影响细胞表面抗原的表达，从而影响最终的结果判断，导致检测结果上的差异，容易造成漏检或其它情况。SSP法检测的是基因型，而不是看该基因的表达，所以从结果上来说，确定性和唯一性会比流式细胞检测的方法要好，即只要存在该基因，通过设计好的特异性引物，即可结合引物的扩增情况，判读最终结果。SSP方法的缺点主要在于结果检测起来不够简便，扩增后的产物需要进行电泳，费时费力，而且在需要检验人员在目的条带的判读上具有一定的经验。SSP方法的另一个缺点在于通常需要几管引物才能区分出HLA-B*1502的基因，引物的设计上也要多方面的考量，保证扩增片段的特异性。申请号为200810026919. 2的专利公开了一种检测HLA-B*1502的方法，该方法需要6管引物才能做一人份检测，该方法也可算作是通过SSP的方法检测基因型，但在引物设计上还有可改良的地方。总体而言，流式细胞仪的方法操作起来较为简便，但由于该方法是检测抗原的表达，所以结果有可能因为实验操作或其它因素导致偏差；而SSP法检测的是基因型，结果唯一准确，但通常需要多管引物， 并且需要电泳来检测结果，操作而且起来较烦琐，不太适用于临床检验。此外，由于B*1502 基因只有少数几个碱基位点存在特异性(与其它序列高度相似的罕见型基因如B*1505、 B*1588、B*1531和B*1555的区别碱基)，在设计特异性引物后再无其它特异位点用以另行设计探针，因而也就不能应用TaqMan探针的荧光法进行B*1502基因的检测。因次，市场上迫切需要一种特异性高、灵敏度高、省时省力的检测HLA_B*1502基因的方法及其试剂盒。SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。STOR Green I荧光PCR检测的基本过程是1、开始反应，当 SYBR Green I染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，STOR Green I染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，STOR Green I染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以在PCR结束后，还需要进行融解曲线的检测，以确保双链DNA产物的特异性。本发明提供了一种HLA-B* 1502基因的STOR Green I检测方法，以解决目前 HLA-B*1502基因检测方法特异性和灵敏度不高、费时费力的问题。
发明内容
本发明的目的是提供用于对HLA_B*1502基因进行STOR Green I检测的引物。本发明所提供的引物，是根据HLA_B*1502基因的的第2和第3外显子区域设计的，用以定性检测待测样品中的HLA-B*1502基因。具体来讲，所述引物的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。本发明的第二个目的是提供一种特异性较高、灵敏度较高且省时省力的 HLA-B^l502基因的STOR Green I检测方法。本发明所提供检测方法，是以本发明的引物进行的STOR Green I检测方法，具体方法包括以下步骤1)提取受试者骨髓、外周血或组织的基因组DNA ；2)以步骤1)提取的受试者骨髓、外周血或组织的基因组DNA为模板，在所述引物的引导下进行STOR Green I PCR扩增，同时用序列表中SEQ ID NO :3所示的上游引物和 SEQ ID NO :4所示的下游引物对模板中的beta-actin内参基因进行SYBRGreen I PCR扩增；3)扩增结束后进行结果判读1.出现荧光扩增曲线，且当内参基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于35时，如果两者的CT差值小于等于7，那么结果为 HLA-B*1502阳性，若两者的CT差值大于7，则结果为阴性；2.当内参基因CT值小于或等于27时，目的基因CT值大于35或未出现荧光扩增曲线，那么结果为阴性；3.若内参基因的CT 值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA进行实验。在上述HLA-B*1502基因的SYBR Green I检测方法中，所述步骤2)中的25 μ IPCR 反应体系为2*PCR Mix 12. 5ul(购自欧比特公司)，目的基因检测mix(上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ul)或内参基因检测mix (上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ ul) 2. 5ul，样品 DNA 2ul (50_100ng)，DEPC 水 8ul。所述步骤2)中的PCR反应条件为先热启动95°C lOmin，1个循环；然后变性 95°C 15sec，退火 71°C lmin，共；35 个循环；最后熔解 95 °C 15s, 60 °C lmin，95°C 30s， 60 °C 15s。为方便检测，所述步骤幻中还包括用含有HLA_B*1502基因的阳性对照品和不含 HLA-B*1502基因的阴性对照品作为模板进行STOR Green I PCR扩增的步骤。本发明的第三个目的是提供一种用于对HLA_B*1502基因进行STOR Green I检测的试剂盒。具体来讲，本发明所提供的试剂盒包含2*PCR Mix,目的基因检测mix(包含引物)，beta-actin内参基因检测mix (包含引物)和DEPC水。所述试剂盒中还可添加含有HLA_B*1502基因的阳性对照品。本发明提供了一种HLA_B*1502基因的STOR Green I检测方法及其专用引物。 该方法是以待检样品中HLA-B*1502基因为检测对象，用本发明的引物可特异性的扩增出 HLA-B*1502基因的特异片段，该方法的特异性、准确度及稳定性均较好。本发明具有以下优点1、首次建立了 HLA_B*1502基因的SYBR Green I检测方法，利用此检测方法可以快速地在1个半小时内完成对待测样本中的HLA-B*1502基因的检测，利用STORGreen I荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的其它优点是无需另外设计荧光探针，降低了实验成本，且适用性广，对仪器的要求低，易于该方法的普遍推广。2、本检测方法通过特异性的引物设计，提高了扩增片段的特异性，可以把B*1502 基因与其它序列高度相似的罕见型分开，如B*1505、B*1588、B*1531和B*1555等。3、本检测方法与HLA_B*1502基因的其它常规检测方法，如流式细胞仪检测法、 SSP法和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合大面积推广和应用。4、本检测方法不仅能够评价人是否具有HLA_B*1502基因，同时也为SJS/TEN的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。综上所述，本发明能快速、准确地检测出HLA_B*1502基因，对保障人类健康和卡马西平类药物的用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于多种临床样本(骨髓、外周血或组织)中HLA-B*1502基因的核酸检测，结果准确唯一，无繁琐的检测步骤，判读结果简单明了，并且试剂成本相对低廉，适应市场推广的需要，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为STOR-I和STOR-2引物扩增效果及特异性检测结果的融解曲线
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图2A为0. 3um和0. 5um引物浓度下HLA-B^l502基因的SYBR Green I扩增曲线图2B为0. 3um引物浓度下HLA_B*1502基因的STOR Green I检测的熔解曲线图2C为0. 5um引物浓度下HLA_B*1502基因的STOR Green I检测的熔解曲线图2D为Ium引物浓度下HLA_B*1502基因的STOR Green I检测的熔解曲线图 3 为 100ng、50ng、25ng、5ng 模板浓度下的 HLA-B^l502 基因的 SYBR GreenI 检测的扩增曲线图4A和图4B为用本发明HLA_B*1502基因的STOR Green I法检测10份临床样本的结果图5为本发明HLA_B*1502基因的STOR Green I检测试剂盒及检测方法的特异性检测结果
具体实施例方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook J.等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物由上海英杰有限公司合成，所有序列测定工作均由上海英杰有限公司完成。实施例1、用于对HLA_B*1502基因进行STOR Green I检测的引物的设计及筛选参照GenBank收录的HLA_B*1502基因全序列，选择HLA_B*1502基因的第2和第 3外显子设计合成引物。引物设计中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。在引物的筛选过程中均需选择在目的保守区中PCR扩增效率和STOR Green I染料结合效率较高的引物(所用PCR引物由上海英杰公司合成，引物要求PAGE纯化。到货时为引物干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量测定，引物至0. 4um/ul贮存液后备用)。针对HLA-B*1502基因，共设计了 2组上、下游引物(STOR-1和STOR-2)，同时还设计了用于检测beta-actin内参基因的上、下游引物，序列如下SYBR-I上游弓丨物(SYBR-F' ) :5，_tggcaccgggagacacagatctccaa_3，；下游弓丨物(SYBR-R' ) :5，-gcagccgtacatgctctggag-3，。SYBR-2上游引物(STOR-F) 5，-accggaacacagatc tccaagaccaa-3，(序列表中 SEQ ID NO 1)；下游引物(SYBR-R):5，-tgccgtcgtaggcggactggtca-3，(序列表中 SEQ ID NO: 2)。beta-actin上游引物(beta-F):5，-ctgggacgacatggagaaaa-3‘(序列表中 SEQ ID NO:3)；下游引物(beta-R):5，-aaggaaggctggaagagtgc-3，(序列表中 SEQ ID NO :4)。SYBR-F'由洸个碱基组成，为HLA-B*1502基因自5，端第250-275位碱基，STOR-R， 由21个碱基组成，为HLA-B*1502基因自5，端第356-376位碱基，扩增片段长度为368bp ； SYBR-F由沈个碱基组成，为HLA-B*1502基因自5，端第256-281位碱基，SYBR-R由23个碱基组成，为HLA-B*1502基因自5，端第411-433位碱基，扩增片段长度为420bp ；beta-F由20个碱基组成，为beta-actin基因自5，端第305-3M位碱基，beta-R由20个碱基组成，为beta-actin基因自5，端第868-849位碱基，扩增片段长度为564bp。使用购自hvitrogen公司的基因组DNA提取试剂盒分别对不携带HLA_B*1502基因的3人(编号1、2、3)以及携带HLA-B*1502基因的3人(编号4、5、6)的外周血(骨髓或组织亦可)进行基因组DNA提取，同时将核酸模板分装后于-70°C保存。然后，以提取的受试者骨髓的基因组DNA为模板，分别在引物STOR-I和STOR-2的引导下进行STOR Green I PCR扩增，同时以beta-actin为内参。25 μ 1 PCR筛选体系为2*PCR Mix(购自欧比特公司)12. 5ul，目的基因检测mix(上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ul)或内参基因检测 mix (上、下游引物混合液，各 1. 25ul，0. 4um/ul) 2. 5ul，样品 DNA 2ul (25-100ng)，用 DEPC水补充反应体系至25 μ 1。PCR程序为先热启动95°C lOmin，1个循环；然后变性95°C 15sec, 退火 71°C lmin，共；35 个循环；最后熔解 95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s，60°C 15s。扩增结束后，根据扩增后的荧光信号强度及融解曲线来判断引物的扩增效果及特异性。结果如图1所示(A为STOR-I引物组合的融解曲线，B为STOR-2引物组合的融解曲线；横坐标为温度，纵坐标为荧光值)，显示第一组引物(STOR-I)的融解曲线存在着杂峰，表明引物的特异性不高，第二组引物(STOR-幻的融解曲线没有杂峰，表明引物的特异性高。两组引物的荧光信号差别不大。六分样本获得了与预期一致的结果。因此，将STOR-2 作为对HLA-B*1502基因进行STOR Green I检测的引物。实施例2、对HLA-B*1502基因进行STOR Green I检测的反应体系的优化一、引物用量的优化引物浓度是影响PCR反应的关键因素。若引物浓度低，会导致反应不完全。若引物太多，则发生错配及产生非特异性产物的可能性就增大。上、下游的引物量选择一致。引物浓度的范围在0. I-Ium0实验中分别以0. 3um、0. 5um、Ium三个不同的引物浓度，针对同一模板(携带HLA-B*1502基因的患者的外周血基因组DNA)进行STOR Green I检测，除引物外反应体系及反应条件与实施例1相同。结果如图2A-图2D所示(图2A为0. 3um和0. 5um引物浓度下的STOR Green I 扩增曲线(曲线1为0. 5um,曲线2为0. 3um，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值)；图2B为 0. 3um引物浓度下的熔解曲线图，图2C为0. 5um引物浓度下的熔解曲线，图2D为Ium引物浓度下的熔解曲线图，横坐标为温度，纵坐标为荧光值)，当引物达到Ium时，熔解曲线会出现小的杂峰，而0. 3um与0. 5um的熔解曲线都很好，但0. 5um的CT值更低些，说明模板的扩增效率更高。所以采用0. 5um作为对HLA-B*1502基因进行STOR Green I检测的引物的终浓度。二、HLA_B*1502基因的STOR Green I检测中PCR反应体积和模板用量的选择考虑到不同荧光PCR仪器之间的通用性能，本发明选择25μ 1反应体系，已在 Roche, ABI, Bio-Rad系列等仪器上经过测试。DNA模板上样量的选择选择一系列的稀释梯度模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度。一般来说，反应的CT值在15-30个循环内是比较合适的。选择了模板 (携带HLA-B*1502基因的患者的外周血基因组DNA)的四个梯度浓度(100ng、50ng、25ng、 5ng)进行STOR Green I检测，除模板外反应体系及反应条件与实施例1相同。
结果如图3所示(曲线1为IOOng模板用量的扩增曲线，曲线2为50ng模板用量的扩增曲线，曲线4为25ng模板用量的扩增曲线，曲线4为5ng模板用量的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值)，在模板浓度为IOOng的时候，CT值接近18 ；在模板浓度低至25ng的时候，CT值已经接近30个循环，而5ng的时候已经超出了，表明模板浓度在 25ng-100ng进行检测是较为适宜的。所以本发明HLA-B*1502基因的STOR Green I检测中 PCR反应体系中的DNA总量定为25-100ng/反应。实施例3、HLA-B^l502 基因的 STOR Green I 检测一、构建携带HLA_B*1502基因的重组质粒p-HLA_B*1502由上海英杰公司合成HLA_B*1502基因序列，并克隆至pGEM-T fesy载体(购自Promega公司)载体多克隆位点的NoT I和Eco RI酶切位点之间，得到重组载体 p-HLA-B*1502。二、用HLA_B*1502基因的STOR Green I法检测10份临床样本将5份确诊的携带HLA_B*1502基因患者的外周血基因组DNA及5份不携带 HLA-B^l502基因患者的外周血基因组DNA作为模板(以p-HLA_B*1502作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照)，用实施例1中的STOR-2引物和beta-actin内参基因引物进行 HLA-B*1502基因的STOR Green I法检测。每份样本重复平行检测3次。临床样本检测体系为25μ1，依次加入下列成分2*PCR Mix(购自欧比特公司)12. 5ul，目的基因检测mix(上、下游引物混合液，各1.25ul，0.4um/ul)或内参基因检测 mix (上、下游引物混合液，各 1. 25ul，0. 4um/ul) 2. 5ul，样品 DNA2ul (25-100ng)，DEPC 水 8μ I。临床样本检测反应条件为先热启动95°C IOmin, 1个循环；然后变性95°C 15sec, 退火 71°C lmin，共；35 个循环；最后熔解 95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s，60°C 15s。结果如图4A(5份阴性样本，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值)和图4B(5份阳性样本，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值)所示，结果显示以5份确诊的携带HLA-B*1502 基因患者的外周血基因组DNA和阳性对照质粒为模板时出现了目的荧光扩增曲线，以其余样本的DNA为模板时，均无该目的荧光扩增曲线，再根据CT值对结果做进一步的判读，方法为1.出现荧光扩增曲线，且当内参基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于 35时，如果两者的CT差值小于等于7，那么结果为HLA-B*1502阳性，若两者的CT差值大于 7，则结果为阴性；2.当内参基因CT值小于或等于27时，目的基因CT值大于35或未出现荧光扩增曲线，那么结果为阴性；3.若内参基因的CT值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA进行检测。首先看是否出现目的荧光扩增曲线，这是一个直观的判读，其次还需看CT值，因为当CT值大于35后，检测结果就不准确了，即使出现扩增曲线也无法判读为阳性。CT值是与所检测样本的模板量是成反比的，CT值越高，则代表着模板量越低。CT值检测结果如表1所示，与荧光扩增的检测结果一致，表明用本发明的方法可用于HLA-B*1502基因检测。表1用本发明HLA-B*1502基因的STOR Green I法检测10份临床样本的CT值
权利要求
1.用于对HLA-B*1502基因进行STORGreen I检测的引物，是根据HLA_B*1502基因的第2和第3外显子区域设计的，用以定性检测待测样品中的HLA-B*1502基因。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.一种用权利要求1或2所述引物对HLA-B*1502基因进行的STOR Green I检测方法，具体方法包括以下步骤1)提取受试者骨髓、外周血或组织的基因组DNA;2)以步骤1)提取的受试者骨髓、外周血或组织的基因组DNA为模板，在所述引物的引导下进行STOR Green I PCR扩增，同时用序列表中SEQ ID NO :3所示的上游引物和SEQ ID NO 4所示的下游引物对模板中的beta-actin内参基因进行STORGreen I PCR扩增；3)扩增结束后进行结果判读1.出现荧光扩增曲线，且当内参基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于35时，如果两者的CT差值小于等于7，那么结果为 HLA-B*1502阳性，若两者的CT差值大于7，则结果为阴性；2.当内参基因CT值小于或等于 27时，目的基因CT值大于35或未出现荧光扩增曲线，那么结果为阴性；3.若内参基因的CT 值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA进行检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述步骤2)中的25μ 1 PCR反应体系为2*PCR Mix 12. 5ul，目的基因检测mix或内参基因检测mix 2.5ul，样品DNA 2ul (25-100ng)，DEPC 7jC 8 μ 1。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述步骤2)中的PCR反应条件为 先热启动95°C 10min，l个循环；然后变性95°C 15sec，退火71°C lmin，共35个循环；最后熔解 95°C 15s,60°C lmin,95°C 30s, 60°C 15s。
6.根据权利要求3或4或5所述的检测方法，其特征在于所述步骤2~)中还包括用含有HLA-B*1502基因的阳性对照品和不含HLA_B*1502基因的阴性对照品作为模板进行STOR Green I PCR扩增的步骤。
7.一种包括权利要求1或2所述引物的HLA-B*1502基因的STOR Green I检测试剂品.ο
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含2*PCRMix、目的基因检测mix、内参基因检测mix和DEPC水。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括含有 HLA-B* 1502基因的阳性对照品。
全文摘要
本发明提供了一种检测HLA-B*1502基因的SYBR Green I检测方法及其专用引物与试剂盒。该引物是根据HLA-B*1502基因的第2和第3外显子区域设计的，用以定性检测待测样品中的HLA-B*1502基因。所述引物的上游引物具有序列表中SEQID NO1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列。本发明能快速、准确地检测出HLA-B*1502基因，对保障人类健康和卡马西平类药物的用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于多种临床样本(骨髓、外周血或组织)中HLA-B*1502基因的核酸检测，应用前景广阔。
文档编号G01N21/64GK102296109SQ201110183320
公开日2011年12月28日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者吴赓, 徐玉现, 毛吉扬 申请人:北京思尔成生物技术有限公司