靶向进化枝2.3的h5流感病毒上的中和表位的单克隆抗体的制作方法

靶向进化枝2.3的h5流感病毒上的中和表位的单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及靶向进化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠单克隆抗体C、F以及H和其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。本发明另外涉及利用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段和互补性鼠单克隆抗体或其活性片段提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。
【专利说明】靶向进化枝2.3的H5流感病毒上的中和表位的单克隆抗体
[0001]序列提交
[0002]本申请与电子形式序列表一起提交。序列表的标题为2577210PCTSequenceListing.txt，其创建于2012年I月10，大小为26kb。通过引用，将序列表的电子形式的信息全部并入本文。

【背景技术】
[0003]本发明涉及对进化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位具有特异性的鼠单克隆抗体C、F和H以及其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。此外，本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段以及互补性鼠单克隆抗体或其活性片段，提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。
[0004]用于说明本发明的背景或提供关于实践的其他详情的出版物和其他材料通过引用并入本文，并且出于便利，将其分别列于参考文献目录中。
[0005]最近，甲型流感病毒H5N1毒株的出现和其对人造成的高死亡率已引起人们对未来流感大流行的可能性的关注。为了预防另一流行病的爆发，在全球范围内对针对散布性(circulating)H5N1毒株的预防性措施和治疗性措施投入了极大的兴趣和努力。现在的疫苗策略已经受到流感毒株抗原变异的阻碍。现在的疫苗策略需要抗体的内源性合成，如果发生流行性疾病，无法提供针对H5N1感染的直接保护。目前，获得许可的抗病毒药物包括M2离子通道抑制剂(金刚乙胺和金刚胺)和神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)。已知H5N1病毒对M2离子通道抑制剂有抗性(Biegel et al.，2005)。正分离较新的H5N1病毒毒株，其对神经氨酸酶抑制剂即奥司他韦和扎那米韦也有抗性(Le et al., 2008 ；deJong et al.，2005)。神经氨酸酶抑制剂要求高剂量和长期治疗(de Jong and Hien, 2006),增加有害副作用的可能性。因此，用于治疗流感的替代策略是必要的。
[0006]作为治疗许多感染性疾病的可行选项，考虑过使用单克隆抗体的被动免疫治疗。目前，已经大量关注使用针对流感病毒HAl蛋白的中和抗体的治疗方法。因为该蛋白质位于病毒的表面，因此易于靶向，并且针对这种蛋白质的抗体能够有效中和病毒。因此，针对H5血凝素(HA)的中和表位的单克隆抗体(Mab)可能是人主动接种疫苗的有吸引力的备选方案，特别是对于流感感染风险高的个体，即不能很好地响应主动免疫的免疫功能不全的患者或老年人。重要的是，任何Mab产物都应当提供针对传播性H5N1流感毒株的广泛保护，并且应当防止体内的中和逃逸突变体选择。一种提高针对传播性H5N1流感毒株保护和防止逃逸突变体的技术是使用互补性Mab的联合疗法(Prabakaran et al., 2009)。
[0007]需要鉴定靶向进化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的单克隆抗体。还需要鉴定能够用于预防和治疗H5N1流感的单克隆抗体。进一步，需要鉴定能够用于提供通用的针对H5流感病毒的保护的单克隆抗体。还需要鉴定能够用于鉴定、表征和/或定量H5表达的单克隆抗体。
[0008]发明概述
[0009]本发明涉及靶向进化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠单克隆抗体C、F以及H和其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。本发明另外涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段以及互补性鼠单克隆抗体或其活性片段提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。
[0010]因此，在第一方面，本发明提供对H5流感血凝素的主要中和表位具有特异性的单克隆抗体和其活性片段即抗原结合片段(在本文中也称为抗体片段)。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala以及190Pro。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，该构象表位与鼠单克隆抗体C特异性结合。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤C产生的鼠单克隆抗体C。
[0011]在其他实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，该构象表位与鼠单克隆抗体F特异性结合。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤F产生的鼠单克隆抗体F。
[0012]在另外的实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141Ρι.ο和152Lys。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，该构象表位与鼠单克隆抗体H特异性结合。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤H产生的鼠单克隆抗体H。
[0013]在另一实施方案中，本发明提供编码本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。在一实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体C或其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体F或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体H或其抗原结合片段。在一实施方案中，本发明提供包含所述核酸的载体。在另一实施方案中，本发明提供包含并表达所述载体的细胞。
[0014]在第二方面，本发明提供使用本文所述的鼠单克隆抗体或其片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。在一实施方案中，本发明提供包含本文所述的单克隆抗体和药学上可接受的稀释剂或运载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含本文所述的单克隆抗体的抗原结合片段和药学上可接受的稀释剂或运载体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段是鼠单克隆抗体C的抗原结合片段。在其他实施方案中，所述抗原结合片段是鼠单克隆抗体F的抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述抗原结合片段是单克隆抗体H的抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含载体和药学上可接受的稀释剂或运载体，所述载体包含所述核酸。在另一实施方案中，所述药物组合物包含表达所述载体的细胞和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另一实施方案中，所述药物组合物包含载体和药学上可接受的稀释剂或运载体，所述载体包含所述核酸。在另一实施方案中，所述药物组合物包含表达所述载体的细胞和药学上可接受的稀释剂或运载体。
[0015]在一实施方案中，本发明提供减少个体的H5N1流感病毒感染或降低个体中H5N1流感病毒感染风险，抑制个体被进化枝2.3的一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株感染，或预防进化枝2.3的一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法。在该实施方案中，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的本文所述的单克隆抗体其抗原结合片段、包含编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子、包含所述多核苷酸的载体或表达所述载体的细胞。在一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。在另一实施方案中，施用提供了治疗效果。在另外的实施方案中，治疗效果包括抑制流感病毒效价的增加，降低流感病毒效价，抑制流感病毒复制的增加，降低流感病毒复制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率。在一实施方案中，症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。在另一实施方案中，所述治疗效果包括加速个体由H5N1流感病毒感染康复。在另外的实施方案中，给所述个体施用的药剂在个体感染H5N1流感病毒之前、基本上同时或之后施用。
[0016]在一实施方案中，在预防和治疗H5N1流感的方法和组合物中，本文所述的鼠单克隆抗体或其片段与至少一种互补性单克隆抗体或其抗体片段结合使用。根据该实施方案，互补性Mab的使用提高了针对H5N1流感病毒传播毒株的保护并防止逃逸突变。在一些实施方案中，在所述方法和组合物中，本文所述的第一鼠单克隆抗体或其活性片段与第二互补性鼠单克隆抗体或其活性片段使用结合。在一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体H。在一实施方案中，所述第二互补性鼠单克隆抗体是鼠单克隆抗体2D9。除了所述方法和组合物使用互补性单克隆抗体或其片段之外，如本文所述的组合物和方法是关于单个单克隆抗体或其片段的。
[0017]在第三方面，本发明提供使用本文所述的单克隆抗体或其片段，表征和/或定量样品中H5表达的方法和组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，H5表达涉及H5N1流感病毒HA的表达。在一实施方案中，所述组合物包含本文所述的单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述方法包括检测H5与本文所述的单克隆抗体或其片段的结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，本发明涉及涉及免疫荧光测定(IFA)、免疫组织化学测定和利用这类结合蛋白的其他方法，包括ELISA、血细胞凝集抑制(HI)测定和病毒中和(VN)测定。
[0018]在第四方面，本发明提供用于检测生物学标本中甲型流感病毒的试剂盒和方法。在一实施方案中，所述检测涉及H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述检测涉及进化枝2家族H5N1流感病毒的检测。在另外的实施方案中，所述检测涉及进化枝2.3的H5N1流感病毒的检测。在一实施方案中，所述方法包括使标本与第一抗体接触，所述第一抗体是本文所述的单克隆抗体或其抗体片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述方法还包括使所述标本与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒H5血凝素的表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可检测元件或与之缀合。在一些实施方案中，所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。在其他实施方案中，将第一抗体固定化于固相表面。
[0019]在一实施方案中，所述试剂盒包含第一抗体和用于进行检测甲型流感病毒的测定的说明书，所述第一抗体是本文所述单克隆抗体或其抗体片段。在一实施方案中，所述试剂盒涉及H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述试剂盒涉及进化枝2家族的H5N1流感病毒的检测。在另外的实施方案中，所述试剂盒涉及进化枝2.3的H5N1流感病毒的检测。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述试剂盒还包括与甲型流感病毒H5血凝素的表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可检测元件或与之缀合。在一些实施方案中，所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。在其他实施方案中，将所述第一抗体固定化于固相表面。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1显示在安徽H5感染的MDCK细胞中，mAb C、F或H针对H5毒株的反应性，所述反应性用IFA测定。用Mab或PBS，和二抗对感染并固定的细胞进行，所述二抗是抗小鼠FITC0
[0021]发明详述
[0022]本发明涉及靶向进化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠单克隆抗体C、F以及H和其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。本发明另外涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段以及鼠单克隆抗体2D9或其活性片段，提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。
[0023]“分离的”表示生物分子不含至少一些天然状态下与其一起存在的组分。
[0024]本文所用的术语“抗体(antibody) ”或“抗体(antibodies) ”是本领域公认的术语，并且理解为指与已知抗原结合的分子或分子的活性片段，特别是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合的结合位点的分子。免疫球蛋白是包含一条或多条多妝的蛋白质，所述多妝基本上由免疫球蛋白K和λ、α、y、δ、ε以及μ恒定区基因以及各种各样的免疫球蛋白可变区基因编码。轻链分为K或λ。重链分为Y、μ、α、δ或ε，其依次分别限定免疫球蛋白的类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人IgG重链可以是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类中的任意一个。本发明的免疫球蛋白可以是任何类别(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA以及IgY)或亚类(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl以及IgA2)的免疫球蛋白分子。
[0025]提到抗体时，本文所用的“特异性结合”表示抗体与靶抗原结合的亲和性比其与不同结构的抗原结合的亲和性更大。
[0026]已知典型的免疫球蛋白结构单元包含四聚体。每一四聚体由两对相同的多肽链构成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每一条链的N末端约100-110或更多个主要负责抗原识别的氨基酸定义为可变区。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别指这些轻链和重链。
[0027]抗体作为全长完整抗体或作为用各种肽酶或化学制品消化而产生的若干充分表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在铰链区二硫键下方消化抗体，从而产生F (ab’) 2，其是Fab 二聚体，所述Fab自身是通过二硫键与Vh-CH1连接的轻链。F(ab’)2可以在温和条件被还原，破坏铰链区的二硫键，从而将F(ab’)2 二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体实质上是具有部分铰链区的Fab片段(有关其他抗体片段的更详细描述，参见FundamentalImmunology, ff.E.Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993))。尽管根据完整抗体的消化，定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员会理解可以通过化学方法或利用重组DNA方法重新合成各种抗体片段中的任何片段。因此，本文所用的术语抗体还包括通过全抗体的修饰所产生的或重新合成的抗体片段或使用重组DNA方法获得的抗体和片段。
[0028]在本发明的范围内“抗体”是要包括嵌合或人源化单克隆抗体以及其活性片段。与已知抗原结合的分子的活性片段的实例包括分开的轻链和重链，Fab、Fab/c、Fv、Fab’以及F(ab’)2片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物和上述任何抗体和片段的表位结合片段。
[0029]可以通过许多技术由本发明的抗体衍生这些活性片段。例如，可以利用酶如胃蛋白酶裂解单克隆抗体，并进行HPLC凝胶过滤。接着可以收集含有Fab片段的合适流分并通过膜过滤等进行浓缩。用于分离抗体活性片段的通用技术的进一步描述，参见例如Khaw etal.(1982) ；Rousseaux et al.(1986)。
[0030]重组制备的抗体可以是常规的全长抗体、已知的来自蛋白水解消化的活性抗体片段、独特的候选抗体片段如Fv或单链Fv (scFv)、结构域删除的抗体等。Fv抗体的大小约为50Kd，包含轻链和重链的可变区。单链Fv( “scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其可以由核酸表达，所述核酸包括直接连接的或通过编码肽的接头连接的VH和VL编码序列。参见Huston et al. (1988)。用于将抗体V区的天然聚集的但是在化学上分离的轻多肽链和重多肽链转化为scFv分子的许多结构，会折叠成基本上与抗原结合位点结构相似的三维结构。参见例如美国专利第5，091，513号、第5，132，405号和第4，956，778号
[0031]结合部位(combining site)指抗体分子的参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。抗体可变区包括三个称为“高变区”或“互补决定区(CDR) ”高度不同的段，它们插入更保守的称为“框架区”(FR)的侧翼段之间。在抗体分子中，轻链的三个高变区(IXDR1、IXDR2以及IXDR3)和重链的三个高变区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)在三维空间中彼此相关排列，形成抗原结合表面或口袋(pocket)。因此抗体的结合部位代表构成抗体的CDR的氨基酸和构成结合位点口袋的任何框架残基。
[0032]具体抗体中构成结合部位的氨基酸残基的相同性，可以使用本领域熟知的方法测定。参见例如美国专利申请公开第2010/0080800号。具体抗体中的氨基酸残基的相同性，可以使用本领域熟知的方法如分子建模和X射线晶体学测定，所述氨基酸残基位于CDR外，但是具有作为结合部位内层(lining)的一部分的侧链,从而构成所述结合部位的一部分(即其对于通过结合部位连接是可行的)。参见例如Riechmann et al.(1988)。
[0033]嵌合抗体是这样的抗体，其中抗体的一个或多个区域来自一个动物物种且抗体的一个或多个区域来自不同的动物物种。优选的嵌合抗体是包括灵长类免疫球蛋白的区域的抗体。用于人临床用途的嵌合抗体，通常理解为具有来自非人动物如啮齿类的可变区和来自人的恒定区。相比之下，人源化抗体使用来自非人抗体的CDR，而其大部分或所有可变框架区和所有恒定区来自人免疫球蛋白。人嵌合抗体通常理解为具有来自啮齿类的可变区。典型的人嵌合抗体具有人肿瘤恒定区和人轻链恒定区，重链和轻链的可变区来自啮齿类抗体。嵌合抗体可以包括人恒定区天然氨基酸序列和天然啮齿类可变区序列的某些变化。嵌合抗体和人源化抗体可以通过本领域熟知的方法制备，包括CDR移植方法(参见例如美国专利第 5,843，708 号、第 6，180，370 号、第 5,693, 762 号、第 5，585,089 号、第 5，530，101号)、链替换策略(参见例如美国专利第5，565，332号；Rader et al.(1998))、分子建模策略(美国专利第5，639，641号)等。
[0034]在双链抗体的情况下，本文所用的“人源化抗体”是至少一条链人源化的抗体。人源化抗体链具有其中一个或多个框架区是人框架区的可变区。单链人源化抗体是链中具有可变区的抗体，所述可变区的一个或多个框架区是人框架区。人源化抗体链或其片段的可变区的非人部分源自非人来源，特别是非人抗体，通常是啮齿类来源。人源化抗体的非人部分通常是至少一个散布于源自一个(或多个)人免疫球蛋白的框架区之间的CDR区。另外，可以改变框架支持残基，以维持结合亲和性。
[0035]人源化抗体还可以包含恒定区(例如，在轻链的情况下，至少一个恒定区或其一部分，且在重链的情况下优选三个恒定区)。如果存在，人源化抗体的恒定区通常是人恒定区。获得“人源化抗体”的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，美国专利申请公开第 2010/0080800 号。
[0036]本文所用的术语恒定区(CR)指免疫球蛋白恒定区基因。所述恒定区基因编码抗体分子的赋予效应子功能的一部分。对于嵌合人抗体和人源化抗体而言，通常以人恒定区取代非人(例如鼠)恒定区。所述嵌合抗体或人源化抗体的恒定区通常源自人免疫球蛋白。所述重链恒定区可以选自五种同种型中的任意一种:α、δ、ε、Y或μ。此外，各种亚类的重链(例如重链的IgG亚类)负责不同的效应子功能，因此，通过选择想要的重链恒定区，可以产生具有想要的效应子功能的抗体。可以用于本发明范围内的恒定区是Yl(IgGl),特别是Yl(IgGl)同种型的Fe区，Y3(IgG3)以及特别是Y4(IgG4)。所述轻链恒定区是K或λ类型，优选地，是K类。在一实施方案中，所述轻链恒定区是人K恒定链(Hieteret al.(1980)),所述恒定重链是人IgG4恒定链。
[0037]本文所用的术语可变区(VR)指抗体的每对轻链和重链中直接参与抗体与抗原的结合的结构域。每一重链在一端具有可变结构域(Vh)随后是一些恒定结构域。每一轻链在一端具有可变结构域(VJ，并在其另一端具有恒定结构域；所述轻链的恒定结构域与所述重链的第一恒定结构域对齐，且所述轻链可变结构域与所述重链的可变结构域对齐。
[0038]本文所用的术语框架区(FR)指抗体轻链和重链可变区内的一个或多个框架区(参见 Kabat et al.(1992) ； Johnson and Wu (2001) ；http colon backslash backslashimmuno dot bme dot nwa dot edu)。这些表述包括插入抗体轻链和重链可变区内⑶R之间的氨基酸序列区。
[0039]根据标准序列定义(Kabat et al.(1992))和结构定义(如在Chothia andLesk(1987)中)，确定⑶R和FR残基。如果这两种方法导致⑶R的鉴定稍微不同，则优选结构定义，但是通过序列定义方法鉴定的残基被视为用于确定将哪个框架区残基输进共有序列的重要FR残基。
[0040]术语“单克隆抗体”是本领域公认的，指一种抗体，其是产生单一克隆的抗体的细胞的产物。单克隆抗体通常通过将正常的短期存活的产抗体B细胞与快速生长的细胞如癌细胞(有时称为“永生”细胞)融合而制备。所得的杂合细胞或杂交瘤快速繁殖，从而生成产生抗体的克隆。
[0041]术语“片段”指抗体或抗体链的、所包含的氨基酸残基比完整或全长抗体或抗体链少的部分(part)或部分(port1n)。可以通过对完整或完全抗体或抗体链进行化学处理或酶促处理获得片段。还可以通过重组方式获得片段。片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc和/或Fv片段。 术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其与抗原结合，或在抗原结合(即特异性结合)方面与完整抗体(即与衍生所述抗原结合片段的完整抗体)竞争。结合片段通过重组DNA技术或通过酶促或化学裂解完整免疫球蛋白而产生。结合片段包括Fab、Fab’、F (ab’).sub.2、Fabc、Fv、单链以及单链抗体。
[0042]免疫原性降低的人源化抗体指相对于亲本抗体，例如，鼠抗体，表现出免疫原性降低的人源化抗体。
[0043]基本上保留了亲本抗体的结合特性的人源化抗体指，保留了与抗原特异性结合的能力的人源化抗体，用于产生这类人源化抗体的亲本抗体识别所述抗原。优选地，所述人源化抗体会表现出与亲本抗体相同或基本上相同的抗原结合亲和性和亲和力。理想地，所述抗体的亲和性不少于亲本抗体亲和性的10%，更优选地，不少于约30%，以及最优选地，亲和性不少于亲本抗体的50%。测定抗体亲和性的方法是本领域熟知的，包括半最大结合测定、竞争测定以及斯卡查德分析。
[0044]术语“互补性单克隆抗体”指这样一些单克隆抗体,其中一个Mab与特定抗原的一部分相互作用而其他Mab能够与所述特定抗原的剩余部分或不止剩余部分相互作用。互补对在诊断或治疗中充当特定抗原如H5N1的通用试剂。两个Mab的活性范围(active field)可以具有重叠区，但是不相同。互补性抗H5单克隆抗体的实例由Prabakaran et al.(2009)描述。互补性抗H5单克隆抗体的另一实例由He et al.(2010)描述。
[0045]此外，术语“治疗有效量”指当给人或动物施用抗体时足以在所述人或动物中导致治疗效果的抗体的量。按照常规程序，本领域技术人员会容易地确定所述有效量。
[0046]本文所用的术语“治疗(treat) ”、“预防(prevent) ”、“预防(preventing) ”以及“预防(prevent1n) ”指由于施用预防剂或治疗剂而防止个体的病症的一个或多个症状的复发或发作。
[0047]通过表位作图，本申请描述对一组抗进化枝2.3的H5的中和Mab的各自表位的表征。本申请还描述对这些Mab在抑制血细胞凝集和中和病毒方面治疗功效的评估。本申请进一步描述确定这些Mab与Mab 2D9 一起针对不同进化枝的H5N1病毒的通用的治疗功效。在本发明之前，当前可用的Mab针对进化枝2.3的H5流感病毒的中和效价低。现有Mab的针对进化枝2.3的H5流感病毒的中和效价低的问题通过本发明的Mab，即针对进化枝2.3的H5流感病毒的中和效价高的Mab C、F以及H，得到解决。这些Mab在IFA、ELISA、HI以及病毒中和中与进化枝2.3的H5流感病毒有效反应。鉴于它们有效中和进化枝2.3和几个其他进化枝的H5流感病毒，本发明的Mab能够构成通用的治疗性单克隆抗体对的一部分，所述通用治疗性单克隆抗体对提供的保护比目前通用的治疗性Mab对更好。另外，本发明的Mab靶向进化枝2.3的H5病毒上的新的中和表位。如本文所示，Mab C、F以及H都显示出比Mab 2D9更高的对进化枝2.3的H5N1流感病毒反应性，且Mab C、F以及H各自对进化枝2.3的H5N1流感病毒的反应性都显示比对其他进化枝的病毒的反应性更高。鉴于MabC、F以及H的这些特征，这三种Mab的主要用途都是与2D9形成互补性Mab对，用于通用性检测或治疗。
[0048]在第一方面，本发明提供对H5流感血凝素的主要中和表位具有特异性的单克隆抗体和其活性片段即抗原结合片段(在本文中也称为抗体片段)。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala以及190Pro。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体C特异性结合。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是属杂交瘤C产生的鼠单克隆抗体C。鼠杂交瘤C于2011年11月16日根据布达佩斯条约保藏于 CellBank Australia, 214Hawkesbury Road, Westmead NSW 2145，Australia,保藏号为CBA20110011。本发明还涉及产生鼠单克隆抗体C的鼠杂交瘤。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合或人源化单克隆抗体。特别是，所述嵌合或人源化单克隆抗体与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体C特异性结合。在一实施方案中，单克隆抗体(鼠单克隆抗体或嵌合或人源化单克隆抗体)或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala以及190Proo
[0049]在其他实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体F特异性结合。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在进一步的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤F产生的鼠单克隆抗体F。鼠杂交瘤F于2011年11 月 16 日根据布达佩斯条约保藏于 CellBank Australia, 214Hawkesbury Road, WestmeadNSW 2145，Australia，保藏号为CBA20110012。本发明还涉及产生鼠单克隆抗体F的鼠杂交瘤。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合或人源化单克隆抗体。特别是，所述嵌合或人源化单克隆抗体与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体F特异性结合。在一实施方案中，所述单克隆抗体(鼠单克隆抗体或嵌合或人源化单克隆抗体)或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly。
[0050]在另外的实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141Ρι.ο和152Lys。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体H特异性结合。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在进一步的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤H产生的鼠单克隆抗体H。鼠杂交瘤H于2011年11 月 16 日根据布达佩斯条约保藏于 CellBank Australia, 214Hawkesbury Road, WestmeadNSW 2145，Australia，保藏号为CBA20110013。本发明还涉及产生鼠单克隆抗体H的鼠杂交瘤。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合或人源化单克隆抗体。特别是，所述嵌合或人源化单克隆抗体与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体H特异性结合。在一实施方案中，所述单克隆抗体(鼠单克隆抗体或嵌合或人源化单克隆抗体)或其片段与H5血凝素(HA)的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141Pro和152Lys。
[0051]在另一实施方案中，本发明提供编码本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。在一实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体C或其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体F或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体H或其抗原结合片段。在一实施方案中，本发明提供包含所述核酸的载体。在另一实施方案中，本发明提供包含和表达所述载体的细胞。
[0052]在一实施方案中，使用本文所述的技术以及本领域技术人员熟知的技术，通过将人重链和轻链恒定区与小鼠重链和轻链可变区组合，制备人源化抗体。在另一实施方案中，制备人源化抗体，其中合成编码人源化\和Vh序列的DNA序列，所述人源化\和Vh序列含有本文所述的鼠单克隆抗体的小鼠轻链和重链轻链可变区的CDR。在一实施方案中，所述单克隆抗体是单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是单克隆抗体H。
[0053]合成编码序列已知的蛋白质的DNA方法是本领域熟知的。使用这类方法，合成编码本发明的人源化抗体的DNA序列，然后在适合表达重组抗体的载体系统中表达。这可以在为本发明的人源化抗体序列准备的任何载体系统中实现，例如表达融合蛋白，其包含人恒定结构域序列和小鼠可变结构域序列，上述序列相关联而产生功能性(抗原结合)抗体的。
[0054]适合表达重组抗体，特别是人源化抗体的表达载体、宿主细胞，以及适合表达这类抗体的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利第7，074，406号。
[0055]作为实例，已知能表达功能性免疫球蛋白的宿主细胞尤其包括哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞，细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在这些宿主细胞中，众多研究人员使用CHO细胞，其能有效地表达和分泌免疫球蛋白。
[0056]基本上，重组表达人源化抗体是通过两种通用方法中的一种实现的。在第一种方法中，用单个载体转染宿主细胞，所述载体是为表达与选定的恒定区融合的重链可变区序列和轻链可变区序列而准备的。在第二种方法中，用两个载体转染宿主细胞，所述两个载体分别表达与选定的恒定区融合的可变重链序列或可变轻链序列。
[0057]在第二方面，本发明提供使用本文所述的鼠单克隆抗体或其片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。在一实施方案中，本发明提供包含本文所述的单克隆抗体和药学上可接受的稀释剂或运载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述药物组合物包含本文所述的单克隆抗体的抗原结合片段和药学上可接受的稀释剂或运载体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段是鼠单克隆抗体C的抗原结合片段。在其他实施方案中，所述抗原结合片段是鼠单克隆抗体F的抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述抗原结合片段是单克隆抗体H的抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另一实施方案中，所述药物组合物包含载体和药学上可接受的稀释剂或运载体，所述载体包含所述核酸。在另一实施方案中，所述药物组合物包含表达所述载体的细胞和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另一实施方案中，所述药物组合物包含载体和药学上可接受的稀释剂或运载体，所述载体含有所述核酸。在另一实施方案中，所述药物组合物包含表达所述载体的细胞和药学上可接受的稀释剂或运载体。
[0058]在一实施方案中，本发提供减少个体的H5N1流感病毒感染，或降低个体中H5N1流感病毒感染风险，抑制个体被进化枝2.3的一种或多种H5N1病毒毒株或分离株感染，或预防进化枝2.3的一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法。在该实施方案中，所述方法包括，给有需要的个体施用治疗有效量的本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子，包含所述多核苷酸的载体，或表达所述载体的细胞。在一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。在另一实施方案中，施用提供治疗效果。在另外的实施方案中，治疗效果包括抑制流感病毒效价的增加，降低流感病毒效价，抑制流感病毒复制的增加，降低流感病毒复制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率。在一实施方案中，症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。在另一实施方案中，所述治疗效果包括加速个体由H5N1流感病毒感染康复。在另外的实施方案中，给所述个体施用的药剂在个体感染H5N1流感病毒之前，基本上同时或之后施用。
[0059]可以使用已知的技术将本发明的抗体制成生理可接受的剂型，并且可以包含药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂。例如，将本发明的和本文所述的抗体，包括其任何功能等同抗体或功能性部分，与药学上可接收的载体、稀释剂和/或赋形剂组合，形成治疗组合物。合适的药学运载体、稀释剂和/或赋形剂是本领域熟知的，包括，例如，磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。
[0060]本发明药物组合物的配制可以根据本领域技术人员已知的标准方法完成。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Ed.D.B.Troy, Lippincott, ffilliams&ffilkins, Baltimore, 2006,通过引用并入本文。
[0061]可以以固体、液体或气雾剂的形式，以药学有效剂量，给个体施用本发明的组合物。固体组合物的实例包括丸剂、霜剂以及可植入的剂量单位。丸剂可以口服施用。治疗性霜剂可以局部施用。可植入的剂量单位可以局部施用，例如，在肿瘤位点，或可以植入(例如，皮下)，用于系统释放所述治疗性组合物。液体组合物的实例包括适于肌肉内、皮下、静脉内、动脉内注射的剂型和用于局部和眼内给药的剂型。气雾剂的实例包括向肺给药的吸入剂型。
[0062]所述组合物可以通过标准给药途径施用。通常，可以通过局部、口服、直肠、鼻、真皮内、腹膜内或胃肠外(例如，静脉内、皮下或肌肉内)途径施用所述组合物。此外，可以将所述组合物并入缓释基质如生物可降解多聚体中，将所述多聚体植入想要递送的位点附近，例如，肿瘤位点。所述方法包括单剂量施用、以预定时间间隔重复剂量施用以及预定时段缓释施用。本文所用的缓释基质是由可通过酶水解和酸/碱水解而降解的材料制成的基质，所述材料通常是多聚体。插入体内之后，酶和体液作用于基质。理想地，缓释基质选自生物相容性材料，如脂质体、聚乳酸(聚乳酸)、聚乙交酯(羟基乙酸多聚体)、聚乳酸共羟基乙酸(乳酸和羟基乙酸的共聚物)、聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物可降解基质是下述基质之一:聚交酯、聚乙交酯或聚乳酸共羟基乙酸(乳酸和羟基乙酸的共聚物)。
[0063]所述组合物可以与其他组合物联合施用，所述其他组合物包含生物学活性物质或化合物以及本发明的抗体，和任选地，药学上可接受的运载体和/或稀释剂和/或赋形剂以及疾病治疗程序，特别地，所述生物学活性物质或化合物是至少一种选自下列化合物的化合物:抗氧化压力化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、I, 3-丙烷基二磺酸(I, 3PDS)、α -分泌酶激活剂、β -和Y-分泌酶抑制剂、τ蛋白、神经递质、β -片层打碎剂(β-sheet breaker)、β淀粉样蛋白清除/消耗细胞组分的引诱剂、N末端截短的β淀粉样蛋白(包括焦谷氨酸化的β淀粉样蛋白3-42)抑制剂、抗炎分子、“非典型抗精神病药物”(例如氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平或胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐和/或加兰他敏)、Ml激动剂和包括任何淀粉样蛋白或τ修饰药物的其他药物，以及营养补充剂(如维生素Β12、半胱氨酸、乙酰胆碱前体、卵磷脂、胆碱、银杏、乙酰基-L-肉碱、艾地苯醌、丙戊茶碱或黄嘌呤衍生物)。
[0064]药学上有活性的蛋白质物质可以以每剂Ing至1mg的量存在。通常，给药方案的范围为0.1 μ g至1mg本发明的抗体,特别是1.0 μ g至1.0mg，更特别是1.0 μ g至100 μ g,落入这些范围内的所有数值也是本发明的一部分。如果通过连续输注进行施用，则更适当的剂量范围为0.01 μ g至1mg/公斤体重/小时，落入这些范围内的所有数值也是本发明的一部分。
[0065]通常进行胃肠外施用，例如静脉内施用。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水性溶液、悬浮剂以及乳剂。非水性溶剂包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性溶剂可以选自水、醇/水溶液、乳剂或悬浮剂，包括盐水和缓冲介质。胃肠外运载媒介包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内运载媒介包括液体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格氏葡萄糖的那些电解质补充物)及其他。也可以存在防腐剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
[0066]所述药物组合物可以进一步包含蛋白质运载体,如血清白蛋白或免疫球蛋白，特别是人源的。在本发明的药物组合物中，可以存在其他生物学活性剂，这取决于预期用途。
[0067]在一实施方案中，用于预防和治疗H5N1流感的方法和组合物将本文所述的鼠单克隆抗体或其片段与至少一种互补性单克隆抗体或其抗体片段组合使用。根据这一实施方案，互补性Mab的使用增加了针对H5N1流感传播毒株的保护并防止逃逸突变。在一些实施方案中，所述方法和组合物将本文所述的第一鼠单克隆抗体或其活性片段与第二互补性鼠单克隆抗体或其活性片段组合使用。在一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体H。在一实施方案中，所述第二互补性鼠单克隆抗体是单克隆抗体2D9。单克隆抗体2D9在Prabakaran et al.(2009)或PCT国际公开申请第WO 2009/035420号中进行了描述。在一实施方案中，所述单克隆抗体2D9由鼠杂交瘤2D9产生。鼠杂交瘤2D9于2007年7月10日根据布达佩斯条件保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd., Manassas, VA 20110，USA，指定的登录号为 PTA-9396。本文描述了关于使用除了用于所述方法和组合物中的互补性单克隆抗体或其片段之外的单一单克隆抗体或其片段的组合物和方法。
[0068]在第三方面，本发明提供使用本文上所述的单克隆抗体或其片段表征和/或定量H5表达的方法和组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，H5表达涉及H5N1流感病毒的HA表达。在一实施方案中，所述组合物包含本文所述的单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述方法包括检测H5与本文所述的单克隆抗体或其片段的结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，本发明涉及免疫荧光测定(IFA)、免疫组织化学测定以及利用这类结合蛋白的其他方法，包括ELISA、血细胞凝集抑制(HI)测定和病毒中和(VN)测定。
[0069]在第四方面，本发明提供用于检测生物学标本中甲型流感病毒的试剂盒和方法。在一实施方案中，所述检测涉及H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述检测涉及进化枝2家族H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述检测涉及进化枝2.3的H5N1流感病毒检测。在一实施方案中，所述方法包括使所述标本与第一抗体接触，所述第一抗体是本文所述的单克隆抗体或其抗体片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述方法还包括使所述标本与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒的H5血凝素的表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可检测元件或与之缀合。在一些实施方案中，所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。在其他实施方案中，将所述第一抗体固定化于固相表面。
[0070]在一实施方案中，所述试剂盒包含第一抗体，其是本文所述的单克隆抗体或其抗体片段，以及用于进行试验来检测甲型流感病毒的说明书。在一实施方案中，所述试剂盒涉及H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述试剂盒涉及进化枝2家族H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述试剂盒涉及进化枝2.3的H5N1流感病毒的检测。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述试剂盒还包含与甲型流感病毒H5血凝素的表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可检测元件或与之缀合。在一些实施方案中，所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。在其他实施方案中，将所述第一抗体固定化于固相表面。在一些实施方案中，所述试剂盒涉及免疫荧光测定(IFA)、免疫组织化学测定以及其利用此类结合蛋白的其他方法，包括ELISA、血细胞凝集抑制(HI)测定以及病毒中和(VN)测定。所有这些测定是本领域技术人员熟知的。
[0071]在一些实施方案中，所述方法和试剂盒将本文所述的第一鼠单克隆抗体或其活性片段与第二互补性鼠单克隆抗体或其活性片段组合使用。在一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体H。在一实施方案中，所述第二互补性鼠单克隆抗体是单克隆抗体2D9。本文描述了关于使用除了用于所述方法和试剂盒中的互补性单克隆抗体或其片段之外的单一单克隆抗体或其片段的试剂盒和方法。除非另外说明，本发明的实施使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养以及转基因生物学的常规技术，这些技术都在本领域的技能范围内。参见，例如，Maniatis et al., 1982, MolecularCloning(Cold Spring H arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning, 2nd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook and Russell, 2001, MolecularCloning, 3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork) ；Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular B1logy (Johnffiley&Sons,包括定期更新)；Glover, 1985，DNA Cloning(IRL Press, Oxford)；Russell,1984,Molecular b1logy of plants:a laboratory course manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) ；Anand, Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ；Guthrieand Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular B1logy(Academic Press,NewYork,1991) ；Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York) ；Nucleic Acid Hybridizat1n(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984) !Transcript1n And Translat1n(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984) ；Culture Of Animal Cells (R.1.Freshney, Alan R.Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；B.Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning (1984)；专著:Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) ；Methods In EnzymologyjVols.154and 155(Wu et al.eds.), ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular B1logy(Mayer and Walker, eds., AcademicPress,London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes 1-1V(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds., 1986) ；R1tt, Essential Immunology,6thEdit1n,Blackwell Scientific Publicat1ns, Oxford, 1988 ；Fire et al.，RNAInterference Technology:From Basic Science to Drug Development, CambridgeUniversity Press，Cambridge，2005 ;Schepers，RNA Interference in Practice, Wiley -VCHj 2005 ；Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts&Bolts of siRNA Technology, DNAPress,2003 ;Gott，RNA Interference,Editing,and Modificat1n: Methods andProtocols(Methods in Molecular B1logy), Human Press, Totowaj NJj 2004 ；Sohail, GeneSilencing by RNA Interference:Technology and Applicat1n，CRC，2004。
实施例
[0072]参考下述实施例对本发明进行描述，所述实施例用于说明而非以任何方式限制本发明。使用了本领域熟知的标准技术或下文具体描述的技术。
[0073]实施例1:材料和方法
[0074]病毒和细胞:本研究所用的H5N1病毒来自下文表1所示的不同进化枝。除了印度尼西亚毒株外，其余的H5流感病毒感染按之前所描述的(Ho et al.，2009)，在本实验室内以反向遗传学产生。将病毒接种到11日龄含胚鸡蛋的尿囊腔中，并在37°C温育48h后进行收获。根据标准方法(Abdel-Ghafar et al.，2008),使用血细胞凝集试验测定病毒效价。按之前所描述的(He et al.，2007)，用甲醛灭活H5N1亚型病毒。所有用活H5N1亚型病毒的实验按照⑶C/NIH和 WHO建议在生物安全3级防护实验室进行，并且还获得了新加坡农粮兽医局和卫生部(Agr1-Food and Veterinary Authority and the Ministry of Healthof Singapore)的许可。
[0075]MDCK细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。将所有细胞在补充了 10%胎牛血清的达尔伯克氏基本成分培养基(DMEM)中繁殖。使病毒原种(virus stock)在补充了 0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)和200ng/ml胰蛋白酶的DMEM中的细胞内生长。
[0076]MAb产生:用来自A/安徽/1/05的灭活的全病毒，以在0.1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)中28的HA效价，按2周的有规律间隔，皮下免疫BALB/c小鼠两次，所述磷酸缓冲盐溶液用等体积的Montanide ISA 563佐剂(SEPPIC，France)进行了乳化。在脾细胞与SP2/0细胞融合前3天，用相同的病毒抗原对小鼠加强接种。将融合细胞接种于96孔板，如下文所述通过免疫荧光测定筛选它们的上清液。通过至少三次限制性稀释克隆产生Mab的杂交瘤。如下文所述，测试阳性Mab的血细胞凝集抑制活性。如制造商方案所述使用商业化的同种型分型试剂盒(Amersham B1science, England),对来自所选的阳性mAb的免疫球蛋白进行同种型分型。
[0077]免疫荧光测定(IFA):用AIV H5N1毒株感染培养于96孔板中的MDC K细胞。感染后24-48h，在室温将所述细胞用4%多聚甲醛固定30min (分钟)，并用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗三次。将固定的细胞与杂交瘤培养物上清液在37°C温育lh，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗，然后与1:400稀释的与异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako，Denmark)温育。再次用PBS漂洗细胞，并通过宽视野差向荧光显微镜(Olympus 1X71)评估抗体结合。
[0078]血细胞凝集抑制测定:如之前所描述的(Webster et al.，1991)，进行血细胞凝集抑制(HI)测定。简而言之，将Mab在V型底的96孔板中连续稀释(2倍)并与4HA单位H5N1病毒进行混合。将96孔板在室温温育30min，并向每个孔中加入I %鸡RBC。血细胞凝集抑制终点是其中未观察到凝集的最高的Mab稀释度。
[0079]微中和测定:通过之前所描述的微中和测定(Prabakaran et al.，2008),分析单克隆抗体针对H5N1毒株的中和活性。简而言之，将10倍稀释的Mab进一步连续稀释(2倍)，并与10050%组织培养物感染剂量(TCID50)的不同进化枝的H5N1毒株一起室温温育Ih,并一式两份置于生长在96孔板中的MDCK细胞上。各H5N1毒株在MDCK细胞培养物中的TCID50,通过Reed和Muench方法测定(Reed and Muench method)。中和效价被按照其中通过光学显微镜没有观察到细胞病变效果的最高Mab稀释度进行评估的。
[0080]逃逸突变体的分离和分析:按之前所描述的(Kaverin et al.，2007),通过表征逃逸突变体，对Mab识别的表位进行作图。简而言之，将H5N1病毒与过量Mab温育lh，然后接种到11日龄含胚鸡蛋中。将所述蛋于37°C温育24-48h。收获病毒，用于在含胚鸡蛋内的限制性稀释液中进行克隆，并对逃逸突变体进行斑块纯化。从尿囊液中提取RNA。对血凝素基因进行反转录酶(RT)-PCR扩增，并将其克隆到TA克隆载体(Promega)中，对几个克隆进行测序。通过与亲本病毒的序列进行比较，分析单个克隆的序列。
[0081]实施例2:鼠单克隆抗体C、F和H的表征
[0082]由用A/Anhui/1/05H5N1病毒免疫的小鼠产生Mab C、F和H。Mab C和H经鉴定属于同种型IgG2a，而Mab F则属于IgG3。除了在安徽感染的MDCK细胞的IFA中的阳性活性之外，所有这三种Mab还都表现出针对H5N1毒株A/Anhui/1/05 H5N1 (安徽)的中和活性(图1)，这表明它们都识别H5的中和表位。
[0083]实施例3:Mab C、F或H与Mab 2D9进行互补性中和
[0084]用Mab C、F和H针对一系列来自不同主要进化枝的H5N1病毒进行HI和微中和测试。如表1和表2所示，Mab C、F以及H能有效中和进化枝2.3的H5N1病毒。此外，这三种Mab能与进化枝2.2的一些H5N1病毒反应。Mab C能中和比Mab F和H更多的本研究所用的来自进化枝2.2的病毒。它们当中没有一个能与进化枝O和1.0的病毒反应。如之前所示，Mab 2D9能中和不同进化枝的不同H5N1病毒，但是不能有效抑制进化枝2.3的病毒。据证明，Mab 2D9与Mab C的Mab混合物能中和本研究所用的所有主要进化枝的病毒。发现2D9+C的中和效价比Mab 2D9与Mab 4C2的更好。
[0085]表1:Maba’b的血细胞凝集抑制效价
[0086]

【权利要求】
1.单克隆抗体或抗体片段，其与H5血凝素构象表位特异性结合，其中所述构象表位选自: (a)包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala和190Pro的构象表位； (b)包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly的构象表位；以及 (c)包含成熟HA蛋白的氨基酸141Pro和152Lys的构象表位。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述H5血凝素的构象表位选自: (i)鼠单克隆抗体C所特异性结合的(a)中所述的构象表位； (?)鼠单克隆抗体F所特异性结合的(b)中所述的构象表位；以及 (iii)鼠单克隆抗体H所特异性结合的(c)中所述的构象表位。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体选自: (1)鼠单克隆抗体C; (2)鼠单克隆抗体F;以及 (3)鼠单克隆抗体H。
4.单克隆抗体，其选自: (a)杂交瘤C产生的单克隆抗体C,所述杂交瘤C保藏于CellBankAustralia,保藏号为 CBA20110011 ； (b)杂交瘤F产生的单克隆抗体F,所述杂交瘤F保藏于CellBankAustralia,保藏号为 CBA20110012 ； (c)杂交瘤H产生的单克隆抗体H,所述杂交瘤H保藏于CellBankAustralia,保藏号为 CBA20110013。
5.检测生物学标本中甲型流感病毒的方法，其包括使所述标本与第一抗体接触，其中所述第一抗体是权利要求1-4中任一项的单克隆抗体或抗体片段。
6.如权利要求5所述的方法，其进一步包括使所述标本与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可检测元件或与其三双口 ο
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一抗体固定化于固相表面。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述甲型流感病毒是H5N1流感病毒。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述H5N1流感病毒是进化枝2家族的H5N1流感病毒。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述H5N1流感病毒是进化枝2.3的H5N1流感病毒。
12.如权利要求5-11中任一项所述的方法，其中将互补性单克隆抗体与所述第一抗体组合使用。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述互补性单克隆抗体是单克隆抗体2D9。
14.检测生物学标本中甲型流感病毒的试剂盒，其包含第一抗体以及进行检测所述甲型流感病毒的测定的说明书，其中所述第一抗体是权利要求1-4任一项的单克隆抗体或抗体片段。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其还包含与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可检测元件或与之缀合。
16.如权利要求14或15所述的试剂盒，其中所述甲型流感病毒是H5N1流感病毒。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述H5N1流感病毒是进化枝2家族的H5N1流感病毒。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述H5N1流感病毒是进化枝2.3的H5N1流感病毒。
19.如权利要求14-18中任一项所述的试剂盒，其中将互补性单克隆抗体与所述第一抗体组合使用。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述互补性单克隆抗体是单克隆抗体2D9。
21.包含药剂和药学上可接受的稀释剂或运载体的组合物，其中所述药剂是权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。
22.包含药剂和药学上可接受的稀释剂或运载体的组合物，其中所述药剂是权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段与至少一种互补性单克隆抗体或其片段的组合。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述互补性单克隆抗体是鼠单克隆抗体2D9。
24.减少个体的H5N1流感病毒感染，或降低个体的H5N1流感病毒感染风险，或抑制个体被一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株感染，或预防一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法，其包括给有需要的个体施用治疗有效量的药剂，其中所述药剂是权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述施用提供治疗效果。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述治疗效果包括(a)抑制流感病毒效价的增加，(b)降低流感病毒效价，(C)抑制流感病毒复制的增加，(d)降低流感病毒复制，(e)抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，(f)降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率，或(g)加速个体由流感病毒感染康复。
28.如权利要求27所述的方法，其中症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。
29.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述甲型流感病毒是进化枝2.3的H5N1亚型。
30.减少个体的H5N1流感病毒感染，或降低个体的H5N1流感病毒感染风险，或抑制个体被一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株感染，或预防一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法，其包括给有需要的个体施用治疗有效量的药剂，其中所述药剂是权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段与至少一种互补性单克隆抗体或抗体片段的组合。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述互补性单克隆抗体是鼠单克隆抗体2D9。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。
33.如权利要求30或31所述的方法，其中所述施用提供治疗效果。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述治疗效果包括(a)抑制流感病毒效价的增加，(b)降低流感病毒效价，(c)抑制流感病毒复制的增加，(d)降低流感病毒复制，(e)抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，(f)降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率，或(g)加速个体由流感病毒感染康复。
35.如权利要求34所述的方法，其中症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。
36.表征和/或定量样品中H5表达的方法,所述方法包括使所述样品与第一抗体接触，所述第一抗体是权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。
37.如权利要求36所述的方法，其 进一步包括使所述样品与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可检测元件或与其缀合。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第一抗体固定化于固相表面。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。
40.表征和/或定量样品中H5表达的试剂盒，其包含第一抗体以及进行表征和/或定量所述样品中H5表达的测定的说明书，其中所述第一抗体是权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。
41.如权利要求40所述的试剂盒，其进一步包含与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可检测标记或与之缀合。
【文档编号】G01N33/577GK104169297SQ201280071324
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2012年1月12日 优先权日:2012年1月12日
【发明者】F·和, H-S·J·光 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司