一种融合蛋白的鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种融合蛋白的鉴定方法。首先，将测序正确的克隆转化入BL21感受态细菌，同上挑克隆培养；第二日以1∶50的比例转接震荡培养至OD600nm。在0.6～0.8之间后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4h，收集菌液制样；用10%的SDS－PAGE电泳分析。本发明的有益效果是，所得产物经SDS－PAGE检测后，在45kDa处显示特异条带，最后经WesternBlotting鉴定，所纯化蛋白能被CＲT抗体和PD1抗体抗体识别；获得较纯的融合蛋白，所构建的载体可为进一步研究两者的功能和免疫学特性及肿瘤的免疫治疗奠定了基础。
【专利说明】一种融合蛋白的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化的鉴定方法，具体来说，是指一种融合蛋白的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]钙网蛋白是属于热休克蛋白家族的一类高度保守内质网可溶性蛋白，分子量为46kD，主要存在于内质网腔。研究显示，应用蒽环类药物和Y —射线能诱导肿瘤细胞发生凋亡时，C R T从胞内向膜表面快速转位并在细胞膜上簇集，出现在凋亡细胞膜上的C R T能被吞噬细胞膜上的相应受体识别，由此活化吞噬细胞并启动对凋亡细胞的吞噬作用，这类凋亡的肿瘤细胞具有良好的免疫原性。程序性死亡因子及其配体ro - LI是蛋白家族的两个新成员，属于I型跨膜分子。作为一种免疫共刺激分子，ro -1主要表达于活化的淋巴细胞膜表面，PDLl与ro -1结合产生负向免疫调节作用，在机体的免疫稳定与耐受方面发挥正常的调节功能。新近的体内外实验发现，肿瘤细胞膜上高表达ro - LI分子，它与淋巴细胞上的ro -1结合后，将抑制效应性T细胞活性，同时降低后者IL 一 2和IFN - Y的表达和分泌，形成肿瘤细胞免疫逃逸的微环境，促进肿瘤的生长。而可溶性PDI与ro — LI的结合可以阻断ro — LI的活性，促进淋巴细胞的活性，在抗肿瘤和抗病毒中具有重要作用。
【发明内容】
[0003]为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案:
一种融合蛋白的鉴定方法，将测序正确的克隆转化入BL21感受态细菌，同上挑克隆培养；第二日以1: 50的比 例转接震荡培养至0D600nm ;在0.6~0.8之间后加入IPTG至终浓度为I mmol / L，37 °C诱导4h，收集菌液制样；用10%的SDS — PAGE电泳分析。
[0004]本发明中，还需要进行融合蛋白CR T-PD-1的纯化，首先扩大培养200 mL菌液用于蛋白纯化，同上加入IPTG诱导后收集菌液12 000 r / min，离心10 min用20ml PBS混匀后，冰浴中超声裂解30 min至液体变清亮，12 000 r / minUO min离心收集上清，杂交后加入含有2 mL Ni平衡柱，分别用不同浓度咪唑洗脱液洗涤后收集洗脱液进行SDS —PAGE分析。
[0005]本发明的有益效果是，所得产物经SDS — PAGE检测后，在45 kDa处显示特异条带，最后经Western Blotting鉴定,所纯化蛋白能被C R T抗体和PDl抗体抗体识别；获得较纯的融合蛋白，所构建的载体可为进一步研究两者的功能和免疫学特性及肿瘤的免疫治疗奠定了基础。
【具体实施方式】
[0006]具体步骤为:首先，将测序正确的克隆转化入BL21感受态细菌，同上挑克隆培养；第二日以1: 50的比例转接震荡培养至0D600nm在0.6~0.8之间后加入IPTG至终浓度为I mmol / L，37 °C诱导4h，收集菌液制样；用10%的SDS — PAGE电泳分析。还需要进行融合蛋白C R T— H)— I的纯化，首先扩大培养200 mL菌液用于蛋白纯化，同上加入IPTG诱导后收集菌液12 OOO r / min，离心10 min用20ml PBS混匀后，冰浴中超声裂解30 min至液体变清亮,12 000 r / min、10 min离心收集上清,杂交后加入含有2 mL Ni平衡柱，分别用不同浓度咪唑洗脱液洗涤后收集洗脱液进行SDS - PAGE分析。
[0007]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都`应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种融合蛋白的鉴定方法，其特征在于:将测序正确的克隆转化入BL21感受态细菌，同上挑克隆培养；第二日以1: 50的比例转接震荡培养至0D600nm;在0.6~0.8之间后加入IPTG至终浓度为I mmol / L，37 °C诱导4h，收集菌液制样；用10%的SDS — PAGE电泳分析。
2.如权利要求1所述的一种融合蛋白的鉴定方法，其特征在于还需要进行融合蛋白CR T-PD-1的纯化，首先扩大培养200 mL菌液用于蛋白纯化，同上加入IPTG诱导后收集菌液12 000 r / min，离心10 min用20ml PBS混匀后，冰浴中超声裂解30 min至液体变清亮，12 000 r / minUO min离心收集上清，杂交后加入含有2 mL Ni平衡柱，分别用不同浓度咪唑洗脱液洗涤后收集洗脱液进行SDS - PAGE分析。
【文档编号】G01N27/447GK103614440SQ201310519175
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】王景文 申请人:王景文