专利名称：龙芽草的组织培养与快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，尤其涉及一种龙芽草的组织培养与快速繁殖方法。
背景技术：
龙芽草(Agrimonia piIosa)为蔷薇科(Rosaceae)龙芽草属多年生草本植物,是一种重要的药用植物，其地上部分、带短小根茎的冬芽和根均可入药。其中，地上部分入药称仙鹤草，异名脱力草、狼牙草、金顶龙牙、龙牙草、龙芽草、黄龙尾、刀口药、毛脚茵等，性·平，味苦、涩，归肺、肝、脾经，具收敛止血、消炎止痢、杀虫和抗肿瘤之功效，临床用于治疗嗜盐菌感染性食物中毒、滴虫性阴道炎和梅尼埃综合症得到良效；带短小根茎的冬芽入药称鹤草芽，异名狼牙、狼齿、狼牙子、狼牙草根芽、仙鹤草根芽等，其性凉，味苦、涩，具驱虫和解毒消肿之功效，主治绦虫病、阴道滴虫病、疮疡疥癣、疖肿和赤白痢疾。临床治疗绦虫病有良效；根入药名龙芽草根，异名地冻风，其性温，味辛、涩，具解毒和驱虫之功效，主治赤白痢疾、疮疡、肿毒、疟疾、绦虫病和闭经等症。近些年来，对龙芽草的化学成分分析、提取分离、测定方法和功效都有了较深入的研究。目前龙芽的繁殖采用种子和分根方式进行，这两种方法存在淹繁殖系数低、繁殖周期长的缺点，因此建立龙芽草的组培快繁体系，是实现其产业化生产的又一有效途径。已有龙芽草组织培养的报道(《植物生理学通讯》1986年04期，龙芽草的组织培养，吴美芬、陈伟东)以龙芽草实生苗的下胚轴、子叶和叶片为外植体的器官发生途径，叶片和下胚轴需经2，4-D诱导愈伤组织阶段，子叶可经MS+6-BA 2.0 mg/L NAA 0.2 mg/L诱导愈伤组织后分化出不定芽。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，采用该方法进行龙芽草的组织培养与快速繁殖，提高了生根率和生根数，并且根的长度和粗度适中，大大提高了移栽的成活率。为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案
龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，该方法包括以下的步骤
1)外植体的消毒
取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，加洗涤剂仔细刷洗，再用流水冲洗，在超净台里将叶片转入酒精溶液中浸泡，后转入消毒液中浸泡消毒，用无菌水冲洗，然后将叶片切成f 3 cm2的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加不同植物生长调节物质的MS培养基上；
2)不定芽诱导
外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成包括
6-BA 0. 5 5. 0 mg/LTDZ O. Γ . O mg/L ；
先进行暗培养，温度为25土 TC，培养条件为光/暗小时比为12 16: 8^12,光照强度30 40 μ mol/ m · s ;
3)切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3 cm高的不定芽，插入到生根培养基中，所述的生根培养基中包括
基本培养基(1/4 1)MS NAAO. 05 O. 5 mg/L ；
炼苗时微开培养瓶盖进行炼苗，2(T30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯。作为优选，上述的步骤I)消毒液为滴加一滴I mol/L NaOH的O. 2%HgCl2溶液。作为再优选，上述的消毒时间为l(Tll min。 作为优选，上述的步骤2)中添加的植物生长调节物质的组成包括
6-BA1. 0 4. O mg/L
TDZ O. Γθ. 8mg/L。作为最优选，上述的步骤2)中添加的植物生长调节物质选用TDZ 0.3 mg/L +6-BA2. O mg/L ο作为优选，上述的步骤2)植物生长调节物质的组成还包括IAA、NAA或两者的组合，IAA的浓度为0 2· O mg/L, NAA的浓度为0 0· 5 mg/L。作为再优选，上述的步骤2)植物生长调节物质的组成还包括IAA，IAA的浓度为O.5 L 5 mg/L。作为优选，上述的步骤3)生根培养基中NAA为O. 08 0. 3mg/L。作为最优选，上述的步骤3)生根培养基为1/4MS+NAA O.1 mg/L。本发明由于采用了上述的技术方案，采用该方法进行龙芽草的与快速繁殖提高了生根率和生根数，并且根的长度和粗度适中，大大提高了移栽的成活率。该方法建立了龙芽草的组培快繁体系，是实现其产业化生产的有效途径。
具体实施例方式材料来源龙芽草采自浙江省丽水市白云山，移栽种植至中国计量学院网室。外植体材料龙芽草的叶片。1.外植体的消毒取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，加适量洗涤剂仔细刷洗，再用流水冲洗O. 5^1. O h后，在超净台里将叶片转入70%的酒精溶液中浸泡30s，后转入滴加了 I滴I mol/L NaOH的0. 2%HgCl2溶液内浸泡消毒若干时间，用无菌水冲洗4飞次，然后将叶片切成f 3 cm2的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加不同植物生长调节物质的MS培养基上。1.1结果消毒5飞min达到最佳效果，外植体的污染率和死亡率均低于10%。2.不定芽诱导预实验
外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成分别为
1)2，4-D 2. O mg/L +6-BA 0. 5 mg/L ；
2)6-BA 2. 0 mg/L +NAA 0.1 mg/L ；3)TDZ O. 3 mg/L _1+NAA 0.1 mg/L ；
4)TDZ 0. 05 mg/L +2，4-D 2. 0 mg/L ；
5)TDZ 0. 3 mg/L +6-BA 2. 0 mg/L。重复3次。所有培养基中蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH 5.8-6.0，下同。先进行暗培养，温度为(25±1)°C，培养条件为14 h光/10 h暗，光照强度3(Γ40 μ mol/m*s，下同。平时观察外植体生长情况并记录，在30 d时随机抽出10瓶进行统计，并筛选出较佳的植物生长调节物质组合以进行优化。2.1结果添加2，4-D的培养基(I和4号培养基)中没有诱导出不定芽，而其余3种培养基中均诱导出了不定芽，但不定芽出现的时间不一，以添加TDZ 0.3 mg/L +6-BA
2.O mg/L的最早(5号培养基)，最早可12 d，诱导率也最高(65. 6%)，添加6-BA 2. O mg/L+NAA O.1 mg/L的最晚(2号培养基)，最早时间为20 d，诱导率也最低(12. 2%)，故在最佳 不定芽诱导的筛选中选择TDZ和6-BA作为侯选植物生长调节物质。同时，在培养过程中观察，添加2，4-D的培养基中只观察到较小的愈组织，而在产生不定芽的培养基中，发现一定时间后其部分叶盘基部膨大，边缘翘起，叶片切口处有类似愈伤组织的绿色物质形成，且基部多于端部，但仔细分辨为小芽点，并随着培养时间的增加而更加明显，出现不定芽最多的部分是着生叶柄处。3.不定芽诱导的植物生长调节物质组合的优化
各设置 3 个梯度的 TDZ(O.1、O. 3 和1. O mg/L)和 6_BA(0. 5、2. O 和 5. O mg/L)组合，配制MS培养，将外植体接种于其上，30 d随机抽出10瓶进行统计。3.1结果TDZ和6-BA浓度的升高，不定芽诱导率和诱导数表现出快速上升的趋势，但在高浓度时有所下降，各处理的诱导率介于44. Γ8. 9%之间，诱导出的不定芽数量介于3. 3^7. 7之间。两个植物生长调节物质的叠加效应也非常明显，尤其是低浓度时，一个植物生长调节物质浓度的提高可快速提高诱导率和诱导数，不定芽诱导率最高可达90%左右，诱导出的不定芽也有8个左右。但高浓度的TDZ和6-BA带来了玻璃化的问题，两者也有叠加效应，最高浓度的TDZ和6-BA组合，其玻璃化最严重。适中的TDZ和6-BA的玻璃化程度较低，且不定芽诱导率和诱导数较高，尤以TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L的组合为佳，诱导率可到85. 6%，不定芽数量可达到7. 4，且生长良好。4.不同生长调节物质组合对增殖生长的影响
MS+TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L虽可以诱导出不定芽，但在继代中发现不定芽虽有增殖，但生长缓慢，30 d时很少高于2 cm，很难用于生根实验，故在增殖生长培养中，再额外加入生长素IAA和NAA进行筛选。将于MS+TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L培养基中诱导出的不定芽丛，切成2 3株的小块，接种额外再添加不同浓度IAA(0、0. 2,0. 5、1. O和2. O mg/L)或NAA(0、0. 05,0. 1,0. 2和O. 5 mg · Γ1)的优化培养基中。30 d随机抽出10瓶进行统计。4.1结果随着IAA浓度的升高，不定芽的增殖率提高，生长也同时加快，并在Img/L达到稳定，增殖率可从4. 03升高到4. 39，但NAA对增殖率和不定芽生长的影响均不大，介于4. 09 4. 14之间。5.再生植株的生根培养和移栽
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3 cm高的不定芽，插入到生根培养基中，各设置3个梯度的基本培养基(MSU/2MS 和 1/4MS) ,NAA (0,0.1 和 0. 5 mg/L)和肌醇(0%、50%、100%)，30d时随机抽出10瓶进行统计生根率。炼苗时可微开培养瓶盖进行炼苗，I d后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，土为小粉土，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯，同时统计移栽成活率。5.1结果龙芽草生根容易，各处理的生根率介于88、8%之间。随着MS浓度降低，生根率提高，根数量增加，变长，变细；而随着NAA浓度的增加，生根率先升高再下降，根的数量先增加再减少，根的长度也表现出先增加后减少的趋势，但根的粗度表现出增加的趋势；但肌醇的浓度对于生根培养影响不大。此外，观察发现，各处理的生根时间相近，以1/4MS+NAA 0.1 mg/L最早(6 d)，以MS最晚(8 d)。但移栽成活率上有区别，高浓度(0.5mg/L)NAA培养时，虽然根的数量增加，但变长、变短，这些根的木质化明显，根变得粗而硬，移栽成活率(81%)反而降低，并显著低于其它的处理；MS浓度和肌醇浓度不同获得的再生苗的移栽成活率之间无明显差异，均达到95%左右。故综合生根率、根数、根长、根粗和移栽成活率，适宜的生根培养基为1/4MS+NAA 0.1 mg/L，如果考虑成本因素，可不添加肌醇，SP不添加肌醇的1/4MS+NAA 0.1 mg/L为最佳生根培养基，生根可达98%，生根数为6.1根，根 的长度和粗度适中，移栽成活率可达96%。
权利要求
1.龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下的步骤 1)外植体的消毒 取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，加洗涤剂仔细刷洗，再用流水冲洗，在超净台里将叶片转入酒精溶液中浸泡，后转入消毒液中浸泡消毒，用无菌水冲洗，然后将叶片切成广3 Cm2的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加植物生长调节物质的MS培养基上； 2)不定芽诱导 外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成包括6-BA O. 5 5. O mg/LTDZ O. Γ . O mg/L ； 先进行暗培养，温度为25土 TC，培养条件为光/暗小时比为12 16: 8^12,光照强度30 40 μ mol/ m · s ; 3)切取叶片嫩绿、生长旺盛且2 3cm高的不定芽，插入到生根培养基中，所述的生根培养基中包括 基本培养基(1/4 1)MS NAAO. 05 O. 5 mg/L ； 炼苗时微开培养瓶盖进行炼苗，2(T30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯。
2.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤I)消毒液为滴加一滴I mol/L NaOH的O. 2%HgCl2溶液。
3.根据权利要求2所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤I)消毒时间为5 6 min。
4.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤2)中添加的植物生长调节物质的组成包括6-BA1. 0 4. O mg/LTDZ O. Γθ. 8mg/L。
5.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤2)中添加的植物生长调节物质选用TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L。
6.根据权利要求1或3或4所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤2)植物生长调节物质的组成还包括IAA、NAA或两者的组合，IAA的浓度为(Γ2. O mg/L,NAA的浓度为O O. 5 mg/L ο
7.根据权利要求5所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤2)植物生长调节物质的组成还包括IAA，IAA的浓度为O. 5^1. 5 mg/L。
8.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤3)生根培养基中NAA为O. 08 O. 3mg/L。
9.根据权利要求7所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤3)生根培养基为 1/4MS+NAA O.1 mg/L。
全文摘要
本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，尤其涉及一种龙芽草的组织培养与快速繁殖方法。龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，该方法包括以下的步骤1)外植体的消毒取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，清洗后消毒，然后将叶片切成1～3cm2的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加不同植物生长调节物质的MS培养基上；2)不定芽诱导外植体接入的MS培养基中；3)切取叶片嫩绿、生长旺盛且2～3cm高的不定芽，插入到生根培养基中，20～30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，待新叶长出，即可除去烧杯。本发明的优点在于提高了生根率和生根数，并且根的长度和粗度适中，大大提高了移栽的成活率。
文档编号A01H4/00GK103004589SQ201210505869
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者孙骏威, 朱诚, 王飞娟, 江琼, 丁艳菲 申请人:中国计量学院