一种脐带间充质干细胞的运输保护液的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种脐带间充质干细胞的运输保护液
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，es细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞(totipotentstemcell，tsc)、多能干细胞(pluripotentstemcell)和单能干细胞(unipotentstemcell)。干细胞(stemcell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万用细胞"。近年来，保存胎盘干细胞和脐带血干细胞的热潮逐年上涨，大多数人已经知晓利用脐带血干细胞能够治愈血液系统疾病等等诸多好处，但是对于胎盘干细胞的生物医学领域的重大用途却知之甚少。保存胎盘主要是从保存的胎盘中提取间充质干细胞，胎盘中含有的间充质干细胞非常丰富，这种间充质干细胞属于多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，能够培养发育成人体的各种组织器官与神经系统，此外，胎盘间充质干细胞治疗疾病范围比较广泛，例如治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损失、烧伤烫伤、肌病等多种肌病；同理，很多人们保存脐带血主要是从保存的脐带血中提取脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，脐带间充质干细胞是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复理想的种子细胞。为此，由于胎盘干细胞和脐带血干细胞对于治疗人体疾病的重要性，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞和胎盘干细胞以备将来不时之需。储存脐带间充质干细胞和胎盘干细胞一般包括采集、运输、交接、检测、分离、冻存、复苏、原代培养和传代培养等诸多步骤，在脐带和胎盘采集后到分离前需要运输、交接和检测三个步骤，实际操作中需要存放较长的时间。脐带和胎盘一旦采集，脱离了原有的体内环境，其细胞的活性在短时间内会迅速下降，这直接影响了其分离得到的胎盘细胞和脐带细胞的质量和活力，为此，如何维持离体胎盘和脐带细胞的活性成为了首要解决的问题。诸如时间、温度、渗透压等。目前缺少保证脐带间充质干细胞在运输中稳定性和安全性的保护液，急需一种既能够延长细胞保存期且能够有效保证细胞活性、抗凝血作用的脐带间充质干细胞的运输保护液。技术实现要素：发明型的目的是解决脐带间充质干细胞在运输中凝血、细胞活性下降的问题，提供了一种脐带间充质干细胞运输保护液，具有较强抗凝血作用，可有效保脐带间充质干细胞在运输过程细胞活性。发明型提供的技术方案为：一种脐带间充质干细胞运输保护液，按体积百分计由1％-3％肝素钠溶液、1％-3％硫酸链霉素溶液和80％-96％dmem培养基水溶液、1％～2％大株红景天注射液和1％～2％香丹注射液组成。优选的是，所述肝素钠溶液浓度为12500iu/ml。优选的是，所述硫酸链霉素溶液浓度150iu/ml。优选的是，所述dmem培养基水溶液为高糖型、浓度为55-65％，优选地，dmem培养基水溶液浓度为55％。优选的是，按体积百分计由2.5％肝素钠溶液、2.5％硫酸链霉素溶液、91％dmem培养基水溶液组成、2％大株红景天注射液和2％香丹注射液。优选的是，脐带间充质干细胞的运输保护液在干细胞运输中的应用。发明型的有益效果体现在以下方面：一种脐带间充质干细胞的运输保护液，按体积百分计由1％-3％肝素钠溶液、1％-3％硫酸链霉素溶液和80％-96％dmem培养基水溶液、1％～2％大株红景天注射液和1％～2％香丹注射液组成。本发明对不同组分的运输保护液对相同来源的脐带间充质干细胞进行保存试验和抗凝血实验，在相同的时间处理后统计各处理脐带间充质干细胞的存活率，结果显示，本发明的脐带间充质干细胞运输保护液保证较高的细胞活率，大株红景天注射液和香丹注射液组成，配伍使用保证干细胞抗凝血作用同时，降低了肝素钠的用量，减少由肝素钠带来的副作用，提高了本发明的安全性。附图说明图1所示为实施例2～7所述脐带充间质干细胞运输保护液处理后的细胞活率。具体实施方式下面结合附图对发明型做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施，下列实施例仅用于说明本发明，而不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行，下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径或者市购获得常规产品。以下实验中使用的组分、试剂和仪器如下：名称购买来源，货号dmem培养基雷布斯/sh30243肝素钠cas号:9041-08-1硫酸链霉素腾牧科技/8741大株红景天注射液通化玉圣药业香丹注射液江苏常熟雷允上制药有限公司川穹昆明生物科技有限公司/zbff-15西洋参昆明生物科技有限公司/xysf80莪术昆明生物科技有限公司/zbff-13丹参昆明生物科技有限公司/zbff-06红花昆明生物科技有限公司/xyff-12鸡血藤昆明生物科技有限公司/zbff-15乳香昆明生物科技有限公司/xyff-08实施例1脐带充间质干细胞制备步骤一脐带处理(1)洗涤脐带：无菌有齿镊转移脐带至10cm无菌培养皿中，加入标本洗涤液冲洗，重复2～3次，尽量去除血渍。(2)无菌组织剪将脐带剪成约2～3cm数段，加入10～20ml标本洗涤液洗涤血凝块，重复洗涤直至基本去除血渍，洗涤液较清澈。剔除血管：按血管螺旋走势剔除脐带的两条动脉和一条静脉。(3)将剔除血管的脐带组织用适量标本洗涤液洗涤血渍，重复洗涤直至洗涤液清澈。(4)将洗涤后的脐带放入10cm无菌培养皿中，用无菌三头组织剪将脐带剪成组织均浆块。(5)将组织均浆块平均接种至15cm培养皿中，组织块均匀分布，加入适量完全培养基。(6)正置培养皿使组织块尽量均匀分布于整个底面，将培养皿放置于co2恒温恒湿培养箱中培养。培养条件：37±0.5℃，co2体积分数为：5.0±0.2％。步骤二补液(1)肉眼及倒置显微镜下观察。(2)将适量完全培养基缓慢加入培养皿中，注意不能干扰到贴壁组织块。(3)细胞培养：将培养皿放入37℃5.0％co2恒温恒湿培养箱中进行培养。步骤三换液(1)肉眼及倒置显微镜下观察。(2)半量换液：用吸管将培养皿中旧的培养基的1/2弃掉；补充等量新鲜培养基，注意不能干扰到贴壁细胞，加入细胞培养基时不得将培养基直接对着贴壁细胞打入。(3)换液工作完成后，将培养皿放入37℃、5.0％co2恒温恒湿培养箱中进行培养。弃组织块(1)肉眼及倒置显微镜下观察，见细胞克隆形成。(2)弃除组织块：轻轻碰触培养皿，将贴壁组织块悬起，用小吸管将组织块吸出弃除，加入适量完全培养基。(3)培养：将培养皿放入37℃、5.0％co2恒温恒湿培养箱中进行培养。步骤四细胞收获(1)细胞形态观察。(2)吸出旧培养基。(3)用适量pbs培养基冲洗培养皿。(4)消化：用0.05％胰酶-edta消化细胞，消化至在倒置显微镜下观察到细胞大部分由梭形变为圆形并脱落。(5)加入培养基终止消化。(6)轻轻吹打培养皿，收集细胞，细胞悬液经细胞筛网过滤后离心，离心转速600g，20℃离心时间5min。(7)细胞计数：加入细胞洗涤液轻轻吹打重悬细胞，吹打混匀，取样计数，计数后离心洗涤。(8)冻存：吸弃上清，留少量原液，用手指轻弹悬浮细胞。取出预冷的冻存盒、冻存液以及贴好标签的冻存管。加适量体积的冻存液至含有细胞的离心管中，轻轻沿管壁缓缓滴入，轻轻混匀。(9)分装：每冻存管1.0ml，冻存管上贴相应的标签。(10)将需冻存的细胞置于装有异丙醇的程序降温盒中，-80℃过夜，次日移入液氮罐。实施例2本发明所述脐带充间质干细胞与运输保护液混合一种脐带间充质干细胞运输保护液，按体积百分计由1％肝素钠溶液、1％硫酸链霉素溶液和96％dmem培养基水溶液、1％大株红景天注射液和1％香丹注射液组成。按照配方中比例，取相应体积的硫酸链霉素溶液加入dmem培养基水溶液水溶液并混合均匀，所述脐带间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，所述脐带间充质干细胞制备方法请参照实施例1，所述脐带运输保护液中脐带间充值干细胞的浓度为5.5×105～6.5×105个/ml，分装至冻存管中保存。实施例3本发明所述脐带充间质干细胞与运输保护液混合一种脐带间充质干细胞运输保护液，按体积百分计由2％肝素钠溶液、2％硫酸链霉素溶液和92％dmem培养基水溶液、2％大株红景天注射液和2％香丹注射液组成。按照配方中比例，取相应体积的硫酸链霉素溶液加入dmem培养基水溶液水溶液并混合均匀，所述脐带间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，所述脐带间充质干细胞制备方法请参照实施例1，运输保护液中脐带间充值干细胞的浓度为5.5×105～6.5×105个/ml，分装至冻存管中保存。实施例4本发明所述脐带充间质干细胞与运输保护液混合一种脐带间充质干细胞运输保护液，按体积百分计由3％肝素钠溶液、3％硫酸链霉素溶液和92％dmem培养基水溶液、1％大株红景天注射液和1％香丹注射液组成。按照配方中比例，取相应体积的硫酸链霉素溶液加入dmem培养基水溶液水溶液并混合均匀，所述脐带间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，所述脐带间充质干细胞制备方法请参照实施例1，运输保护液中脐带间充值干细胞的浓度为5.5×105～6.5×105个/ml，分装至冻存管中保存。实施例5本发明所述脐带充间质干细胞与运输保护液混合一种脐带间充质干细胞运输保护液，按体积百分计由3％肝素钠溶液、3％硫酸链霉素溶液和90％dmem培养基水溶液、2％大株红景天注射液和2％香丹注射液组成。按照配方中比例，取相应体积的硫酸链霉素溶液加入dmem培养基水溶液水溶液并混合均匀，所述脐带间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，所述脐带间充质干细胞制备方法请参照实施例1，运输保护液中脐带间充值干细胞的浓度为5.5×105～6.5×105个/ml，分装至冻存管中保存。实施例6本发明所述脐带充间质干细胞与运输保护液混合一种脐带间充质干细胞运输保护液，按体积百分计由2％肝素钠溶液、2％硫酸链霉素溶液和92％dmem培养基水溶液、2％大株红景天注射液和2％香丹注射液组成。按照配方中比例，取相应体积的硫酸链霉素溶液加入dmem培养基水溶液水溶液并混合均匀，所述脐带间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，所述脐带间充质干细胞制备方法请参照实施例1，运输保护液中脐带间充值干细胞的浓度为5.5×105～6.5×105个/ml，分装至冻存管中保存。实施例7本发尝试使用中药提取物代替大株红景天和丹香注射液与肝素钠溶液配伍使用，作为主要脐带间充质干细胞运输保护液抗凝血物质。一种脐带间充质干细胞的运输保护液，按体积百分计由1％肝素钠溶液、1％硫酸链霉素溶液和83％dmem培养基水溶液培养基水溶液和15％中药材提取物组成，所述中药材提取物由川穹、西洋参、莪术、丹参、红花、鸡血藤和乳香水溶液按体积比1:1:1:2:2:2:3混合而成，所述川穹水溶液浓度为2g/ml，所述西洋参水溶液浓度为2g/ml，所述莪术水溶液浓度为3g/ml，所述丹参水溶液浓度为3.5g/ml，所述红花水溶液浓度为3.5g/ml，所述鸡血藤水溶液浓度为4g/ml，所述乳香水溶液浓度为2.5g/ml。按照配方中比例，取相应体积的硫酸链霉素溶液加入dmem培养基水溶液水溶液并混合均匀，所述脐带间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，所述脐带间充质干细胞制备方法请参照实施例1，运输保护液中脐带间充值干细胞的浓度为5.5×105～6.5×105个/ml，分装至冻存管中保存。对比例1将纯净水等量作为空白例；将实施例2～7制备的脐带充间质干细胞运输保护液作为试验例2～7；将实施例1提供的脐带间充质干细胞运输保护液与脐带充间质干细胞重悬混合物稀释5、10、15以及20倍后作为对比例1-4。实验例1脐带间充质干细胞保存存活活性试验取对数生长期的第3代脐带充间质干细胞，分别加入等体积的实施例2～7中配方的运输保护液。轻轻吹打均匀分装后，置于-80℃冻存盒中3天，取出计算细胞活率。细胞活率测定方法如下：取少许细胞悬液按9：1与0.4％台盼蓝溶液混匀，置于显微镜下，计算活细胞数及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数*100％。实验结果如表2所示：表2实施例2～7细胞活率表结合表2和如图1所示，实施例5配方(3％肝素钠溶液、3％硫酸链霉素溶液和90％dmem培养基水溶液、2％大株红景天注射液和2％香丹注射液组成)细胞活率最高，优于其他组。实验例2脐带间充质干细胞运输保护液抗凝血实验实验方法：观察空白例、试验例2-7以及对比例1-5，放入37℃条件下，观察血凝，结果参见表3：表3抗凝血性能检测结果示例凝血时间空白例2.5mim实验例2未凝血实验例3未凝血实验例4未凝血实验例5未凝血实验例6未凝血实验例7未凝血对比例17min35s对比例26min02s对比例34min15s对比例43min20s通过表3可以明显看出，本实施例提供的脐带充间质干细胞运输保护液可有效防止脐带充间质干细胞在运输过程中血液凝结，凝血效果好，经稀释后的抗凝血护理液效果逐渐减弱。尽管发明型的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合发明型的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，发明型并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。当前第1页12