"或"添加"是已经导致添加一个或多个核 巧酸的核酸序列的变化。"取代"由一个或多个核巧酸被为与所置换的一个或多个核巧酸不 同的分子的分子置换引起。例如，核酸可被不同的核酸置换，如通过胸腺喀晚被胞喀晚、腺 嚷岭、鸟嚷岭或尿巧置换来举例说明。喀晚至喀晚（例如，C至T或T至C核巧酸取代）或 嚷岭至嚷岭（例如，G至A或A至G核巧酸取代）被称为转换，而喀晚至嚷岭或嚷岭至喀晚 (例如G至T或G至C或A至T或A至C)被称为颠换。或者，核酸可被修饰的核酸置换， 如通过胸腺喀晚被胸腺喀晚乙二醇置换来举例说明。突变可导致错配。术语"错配"是指 两个核酸之间的非共价相互作用，每个核酸驻留在不同的多核酸序列上，所述核酸不遵循 碱基配对规则。例如，对于部分互补的序列5' -AGT-3'和5' -AAT-3'来说，存在G-A错 配（转换）。术语"加合物的引入"或"加合物形成"是指分子与DNA序列中的一个或多个 核巧酸的共价或非共价键联W使得所述键联导致DNA复制和/或转录水平的降低（优选从 10%至100%，更优选从50%至100%，且最优选从75%至100% )。
[0061] 当提及双链核酸序列时术语"链分解"包括单链分解和/或双链分解。单链分解 (缺口）是指双链核酸序列的两条链之一中的中断。运与双链分解形成对比，双链分解是指 双链核酸序列的两条链中的中断。链分解可直接地（例如，通过电离福射或用某些化学品 处理）或间接地（例如，通过在核酸碱基处的酶切割）引入至双链核酸序列中。
[0062] 术语"突变细胞"和"修饰的细胞"是指在细胞的基因组序列中含有至少一种修饰 的细胞。
[0063] 当用于提及核巧酸序列时术语"部分"是指所述核巧酸序列的片段。所述片段大 小在5个核巧酸残基至整个核巧酸序列减去一个核酸残基的范围内。
[0064] DNA分子被说成具有"5'端"和"3'端"，因为单核巧酸W使得一个单核巧酸戊糖 环的5'憐酸通过憐酸二醋键联连接至在一个方向上的其邻居的3'氧的方式反应W制备 寡核巧酸。因此，如果寡核巧酸的5'憐酸未连接至单核巧酸戊糖环的3'氧，则寡核巧酸 的那端被称为"5'端"。如果寡核巧酸的3'氧未连接至另一个单核巧酸戊糖环的5'憐 酸，则寡核巧酸的那端被称为"3'端"。如本文所用，即使在较大寡核巧酸内部，核酸序列 也可被称为具有5'端和3'端。在线性或环状DNA分子中，离散元件被称为在5'元件或 3'元件的"上游"或"下游"。此术语反映转录沿DNA链在5'至3'方向上进行。引导所 连接的基因的转录的启动子和增强子元件通过位于编码区的5'或上游。然而，增强子元件 即使在位于启动子元件和编码区的3'时也可施加其作用。转录终止和多腺巧酸化信号位 于编码区的3'或下游。
[0065] 如本文所用的术语"重组DNA分子"是指通过分子生物学技术连接在一起的DNA区 段构成的DNA分子。
[0066] 如本文所用的术语"重组蛋白"或"重组多肤"是指使用重组DNA分子表达的蛋白 质分子。
[0067] 如本文所用，术语"载体"和"媒介物"可互换用于指将DM区段从一个细胞转移 至另一个细胞的核酸分子。
[0068] 如本文所用的术语"处于可操作的组合中"、"处于可操作的顺序及"可操作地 连接"是指核酸序列的键联处于运种方式，所述方式使得产生能够引导给定基因的转录和/ 或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。所述术语还指氨基酸序列的键联处于运种方式，所 述方式使得产生功能性蛋白质。
[0069] 如本文所用的术语"转染"是指将外来DNA引入至细胞中。。转染可通过本领域 已知的各种方式来完成，包括憐酸巧-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的 转染、电穿孔、显微注射、脂质融合、脂质转染剂、原生质体融合、逆转录病毒感染、基因枪 (即，粒子轰击）等等。
[0070] 如本文所用，术语"互补的"或"互补性"用于指通过碱基配对规则相关的"多核巧 酸"和"寡核巧酸"（其是指核巧酸序列的可互换的术语）。例如，序列"5' -CAGT-3'"与 序列"5' -ACTG-3'"互补。互补性可W是"部分的"或"全部"。"部分"互补性是其中一 个或多个核酸碱基根据碱基配对规则不匹配。核酸之间的"全部"或"完全"互补性是其中 每一个核酸碱基在碱基配对规则下与另一碱基匹配。核酸链之间的互补性程度可对核酸链 之间杂交的效率和强度具有重要作用。运在扩增反应W及依赖于核酸之间的结合的检测方 法中可能具有特殊重要性。为方便起见，术语"多核巧酸"和"寡核巧酸"包括包含核巧的 分子。
[0071] 如本文所用关于核巧酸序列的术语"同源性"和"同源的"是指与其他核巧酸序列 的互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性（即，同一性）。当关于双链核酸序列如 cDNA或基因组克隆使用时，术语"基本上同源"是指能够在如上所述的低严格度条件下与双 链核酸序列的任一链或两个链杂交的任何核酸序列（例如，探针）。与核酸序列部分互补， 即"基本上同源"的核巧酸序列是至少部分地抑制完全互补的序列与祀核酸序列的杂交的 核巧酸序列。完全互补核酸序列与祀序列的杂交的抑制可使用杂交测定值NA印迹或RNA 印迹、溶液杂交等）在低严格度条件下来检查。基本上同源的序列或探针将在低严格度条 件下竞争并且抑制完全同源序列与祀序列的结合（即，杂交）。运并不是说低严格度条件使 得允许非特异性结合，因为低严格度条件要求两个序列彼此的结合是特异性（即，选择性） 相互作用。不存在非特异性结合可通过使用缺乏甚至部分互补性程度（例如，小于约30% 同一性）的第二祀序列来测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补 祀标杂交。
[0072] 低严格度条件包括等效于W下的条件：在68°C下在由W下组成的溶液中结合或 杂交：5XSS阳(43. 8g/l NaCl、6. 9g/l化&?〇4·&0和1. 85g/l EDTA，用NaOH将抑调节 至7. 4)、0. 1% SDS、5X登哈特氏试剂（50X登哈特氏含有每500ml :5g Ficoll(400型， I^armacia)、5g BSA(级分V ;Sigma))和100 μ g/ml变性的娃鱼精子DM,接着当采用长度 为约100至约1000个核巧酸的探针时在室溫下在包含2. 0XSS阳、0. 1% SDS的溶液中洗 涂。
[0073] 此外，促进在高严格度条件下杂交（例如，增加杂交和/或洗涂步骤的溫度，在杂 交溶液中使用甲酯胺等）的条件是本领域中熟知的。当关于核酸杂交使用时，高严格度 条件包括等效于W下的条件：在68°C下在由W下组成的溶液中结合或杂交：5XSSPE、1%SDS、5X登哈特氏试剂和100yg/ml变性的娃鱼精子DNA，接着当采用长度为约100至约 1000个核巧酸的探针时在68°C下在包含0.IXSS阳和0. 1%SDS的溶液中洗涂。
[0074]本领域中熟知多种等效条件可用于包括低严格度条件；可改变因素如探针的长度 和性质值NA、RNA、碱基组成）和祀标的性质值NA、RNA、碱基组成，存在于溶液中或固定的 等）W及盐和其他组分的浓度（例如，甲酯胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在）W 及杂交溶液的组分W产生不同于但等效于上文列举的条件的低严格度杂交条件。
[0075] 当在设及目标杂交条件时提及杂交条件时，术语"等效"意指杂交条件和目标杂交 条件导致具有相同范围的同源性百分比（％)的核酸序列的杂交。例如，如果目标杂交条 件导致第一核酸序列与具有与所述第一核酸序列50%至70%同源性的其他核酸序列的杂 交，那么另一种杂交条件在W下情况下被说成等效于所述目标杂交条件：此另一杂交条件 也导致所述第一核酸序列与具有与所述第一核酸序列50%至70%同源性的其他核酸序列 的杂交。
[0076] 如本文所用，术语"杂交"用于指使用任何方法进行互补核酸的配对，通过所述方 法核酸的一条链通过碱基配对与互补链连接W形成杂交复合物。杂交和杂交的强度（即， 核酸之间的缔合强度）受运类因素如核酸之间的互补性程度、所设及的条件的严格度、所 形成的杂合体的TmW及核酸内的G:C比例影响。
[0077] 如本文所用，术语"杂交复合物"是指通过在互补G和C碱基之间和互补A和T碱基 之间形成氨键在两个核酸序列之间形成的复合物；运些氨键可通过碱基堆叠相互作用进一 步稳定。两个互补核酸序列氨键呈反平行构型。杂交复合物可在溶液中（例如，科特（Cot) 或罗特（Rot)分析）或在存在于溶液中的一个核酸序列与固定至固相支持体（例如，如用 于DNA印迹和RNA印迹、斑点印迹中的尼龙膜或硝基纤维素滤膜，或如用于原位杂交、包括 FISH(巧光原位杂交）中的载玻片）的另一个核酸序列之间形成。
[0078] 如本文所用，术语"Tm"用于指"解链溫度"。解链溫度是双链核酸分子的群体变 成半数解离成单个链的溫度。用于计算核酸的Tm的等式是本领域中熟知的。如由标准 参考文献所指示，Tm值的简单估算可通过W下等式计算：Tm= 81. 5+0. 41 (%G+C)，当核 酸处于1M化C1下的水溶液中时（参见，例如Anderson和化ung,如antitativeFilter Hybridization,inNucleicAcidHybridization, 1985)。其他参考文献包括更复杂的计 算，所述计算将结构化及序列特征考虑在内用于计算Tm。
[0079] 如本文所用，术语"严格度"用于指进行核酸杂交的溫度条件、离子强度和其他化 合物如有机溶剂的存在。"严格度"通常在约Tm°C到低于Tm约20°C至25°C的范围内发生。 如本领域的技术人员将了解，严格杂交可用于鉴别或检测相同的多核巧酸序列或用于鉴别 或检测类似或相关的多核巧酸序列。
[0080]当提及第一核巧酸序列与第二核巧酸序列的结合时，术语"特异性结合"、"结合特 异性及其语法等效物是指相较于所述第二核巧酸序列与第Ξ核巧酸序列之间的相互作 用，所述第一核巧酸序列与第二核巧酸序列之间的优先相互作用。特异性结合时不要求绝 对结合特异性的相关术语；换言之，术语"特异性结合"不要求所述第二核巧酸序列与所述 第一核巧酸序列在不存在所述第二核巧酸序列和第Ξ核巧酸序列的相互作用的情况下相 互作用。而是，所述第一核巧酸序列与所述第二核巧酸序列之间的相互作用水平足够大于 所述第二核巧酸序列与所述第Ξ核巧酸序列之间的相互作用水平。第一核巧酸序列与第二 核巧酸序列的"特异性结合"还意指所述第一核巧酸序列与所述第二核巧酸序列之间的相 互作用依赖于所述第一核巧酸序列之上或之内的特定结构的存在；换言之，所述第二核巧 酸序列识别且结合所述第一核巧酸序列之上或之内的特异性结构而不是总体上结合核酸 或结合核巧酸序列。例如，如果第二核巧酸序列对于第一核巧酸序列之上或之内的结构"Α" 具有特异性，则含有结构A的第Ξ核酸序列的存在将减少结合至第一核巧酸序列的第二核 巧酸序列的量。
[0081] 如本文所用，术语"可扩增的核酸"用于指可通过任何扩增方法扩增的核酸。考虑 "可扩增的核酸"通常将包括"样品模板"。
[0082] 术语"异源核酸序列"或"异源DNA"可互换地用于指连接至核酸序列的核巧酸序 列，在自然中所述核巧酸不与所述核酸序列连接或在自然中所述核巧酸序列与所述核酸序 列在不同位置连接。异源DNA对于其所引入的细胞不是内源的，而是获自另一细胞。通常 但不是必须地，运种异源DNA编码通常不由表达其的细胞产生的RNA和蛋白质。异源DNA 的实例包括报道基因、转录和翻译调控序列、选择性标志物蛋白（例如，赋予耐药性的蛋白 质）等。
[0083]"扩增"被定义为产生核酸序列的另外拷贝，并且通常使用本领域中熟知的聚合酶 链式反应技术来进行值ieffenbachCW和GSDveksle;r(1995)PCRPrimer,aL油oratory Manual,ColdSpring化rborPress,Plainview,N.Y.)。如本文所用，术语"聚合酶链式反 应"(叩CR")是指特此W引用的方式并入的K.B.Mul1iS美国专利号4, 683, 195和4, 683, 202 的方法，所述专利描述用于在无克隆或纯化的情况下增加基因组DNA的混合物中祀序列的 区段浓度的方法。所需祀序列的扩增区段的长度由两个寡核巧酸引物相对于彼此的相对位 置决定，并且因此此长度是可控制的参数。通过所述方法的重复方面，所述方法被称为"聚 合酶链式反应"（下文"PCR")。因为祀序列的所需扩增区段变成混合物中的主要序列（就 浓度而言），所W它们被称为叩CR扩增的"。
[0084] 使用PCR，有可能将基因组DNA中的特定祀序列的单个拷贝扩增至可通过几种不 同方法（例如，与标记的探针杂交；并入生物素化的引物，接着抗生物素蛋白-酶缀合物检 巧U;将32P标记的脱氧核巧Ξ憐酸如dCTP或dATP并入至扩增区段中）检测的水平。除了 基因组DNA之外，任何寡核巧酸序列可用适当组的引物分子扩增。具体地说，通过PCR方法 本身产生的扩增区段本身是用于后续PCR扩增的有效模板。
[0085] 运样一种优选的方法（特别是对于商业应用来说）是基于广泛使用的TaqMmi取 实时PCR技术，并且组合等位基因特异性PCR与阻断剂（ASB-PCR)来抑制野生型等位基因 的扩增。ASB-PCR可用于检测从任何类型的组织（包括福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤 标本）提取的DNA或RNA中的种系或体细胞突变。发展了一组试剂设计规则，从而实现针 对野生型等位基因的背景呈千倍或更大过量的单个点取代、插入或缺失的敏感性和选择 性检测。（Morlan J, Baker ISinicropi D Mutation Detection by Real-Time PCR:A Simple, Robust and Hi曲ly Selective Method.化oS 0肥4(2):e4584,2009)
[0086] 术语"逆转录聚合酶链式反应"和"RT-PCR"是指一种用于逆转录RNA序列W产生 cDNA序列的混合物，接着在无克隆或纯化的情况下增加所述混合物中所转录cDNA序列的 所需区段的浓度的方法。通常，在使用两种引物PCR扩增所转录DNA的所需区段之前使用 单个引物（例如，寡-dT引物）逆转录RNA。
[0087] 如本文所用，术语"引物"是指无论是作为纯化的限制性酶切消化物天然存在的还 是合成产生的寡核巧酸，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下（即， 在核巧酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下和在适合的溫度和抑下）时所述寡核巧酸能够 充当合成起始点。引物优选地是单链的W获得最大扩增效率，但可替代地是双链的。如果 是双链的，首先对引物进行处理W在用于制备延伸产物之前分离其链。优选地，引物是寡脱 氧核糖核巧酸。引物必须足够长W在诱导剂存在下引发延伸产生的合成。引物的确切长度 将取决于许多因素，包括溫度、引物来源和方法的使用。
[008引如本文所用，术语"探针"是指无论是作为纯化的限制性酶切消化物天然存在还是 合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核巧酸（即，核巧酸的序列），所述寡核巧酸能够与另 一目标寡核巧酸杂交。探针可W是单链的或双链的。探针适用于特定基因序列的检测、鉴 别和分离。考虑用于本发明的任何探针将用任何"报道分子"标记，W使得它可在任何检测 系统中检测，所述系统包括但不限于酶（例如，ELISAW及基于酶的组织化学测定）、巧光系 统、放射性系统和发光系统。不意图本发明限于任何特定检测系统或标记。
[008引如本文所用，术语"限制性核酸内切酶"和"限制酶"是指细菌酶，其各自在特异 性核巧酸序列处或附近切割双链或单链DNA或使其缺口，例如可使用IIS型限制性核酸 内切酶的核酸内切酶结构域（例如，化kl)，如由Kim等，1996,Proc.化t' 1.Acad.Sci. USA, 6:1156-60)所教导。
[0090] 如本文所用，术语"具有编码基因的核巧酸序列的寡核巧酸"意指包含基因的编码 区的核酸序列，即编码基因产物的核酸序列。编码区可WcDNA、基因组DNA或RNA形式存 在。当WDNA形式存在时，寡核巧酸可W是单链的（即，有义链）或双链的。另外，如果需 要允许正确起始初级RNA转录物的转录和/或正确加工，"具有编码基因的核巧酸序列的寡 核巧酸呵包括适合的控制元件，如增强子、启动子、剪接点、多腺巧酸化信号等。此外，本发 明的编码区可包含内源性增强子、剪接点、插入序列、多腺巧酸化信号等。
[0091] 真核细胞中的转录控制信号包含"增强子"元件。增强子包括与参与转录 的细胞蛋白质特异性地相互作用的DNA序列的较短阵列（Maniatis,T.等，Science 236:1237, 1987)。增强子元件已经从多种真核细胞来源分离，包括植物、酵母、昆虫和哺乳 动物和细胞和病毒中的基因。特定增强子的选择取决于将使用什么细胞类型来表达目标蛋 白质。
[0092] 表达载体上"剪接信号"的存在经常导致较高水平的重组转录物表达。剪接 信号介导从初级RNA转录物除去内含子并且包括剪接供体和受体位点（Sambrook，J. 等.MolecularCloning:ALaboratoryManual,第 2 片反，ColdSpringHarborLaboratory Press,化wYork,第16. 7-16. 8页，1989)。通常使用的剪接供体和受体位点是来自SV40 的16SRNA的剪接点。
[0093] 真核细胞中重组DNA序列的有效表达需要表达引导所得到的转录物的有效终止 和多腺巧酸化的信号。转录终止信号通常见于多腺巧酸化信号的下游并且长度是数百个核 巧酸。如本文所用的术语"聚A位点"或"聚A序列"表示引导新生RNA转录物的终止和多 腺巧酸化两者的DNA序列。重组转录物的有效多腺巧酸化是合乎需要的，因为缺乏聚A尾 的转录物是不稳定的且快速降解。表达载体中使用的聚A信号可W是"异源性的"或"内源 性的"。内源性聚A信号是在基因组中给定基因的编码区的3'端天然发现的聚A信号。异 源性聚A信号是与一种基因分离且位于另一基因的3'的聚A信号。
[0094] 如本文所用的术语"启动子"、"启动子元件"或"启动子序列"是指当置于寡核巧 酸序列的5'端（即，在其前面）时能够控制寡核巧酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动 子通常位于寡核巧酸序列的5'(即，上游），其控制寡核巧酸转录成mRNA，并且提供用于由 RNA聚合酶特异性结合和用于起始转录的位点。
[0095] 当提及核酸序列时，术语"启动子活性"是指核酸序列起始寡核巧酸序列转录成 mRNA的能力。
[0096] 术语"组织特异性"在其应用于启动子时是指能够在于不同类型的组织中寡核巧 酸的表达的相对不存在下引导针对特定类型的组织选择性表达相同寡核巧酸序列的启动 子。启动子的组织特异性可通过W下方式来评估：例如，将报道基因可操作地连接至启动子 序列W产生报道基因构建体，将所述报道基因构建体引入至植物或动物的基因组中，W使 得所述报道基因构建体被整合至所得到的转基因动物的每一组织中，并且检测所述转基因 植物或动物的不同组织中报道基因的表达（例如，检测mRNA、蛋白质或由报道基因编码的 蛋白质的活性）。选择性不必是绝对的。在一种或多种组织中检测到报道基因相对于在其 他组织中报道基因的表达水平更高的表达水平表明启动子对于其中检测到更高表达水平 的组织来说是特异性的。
[0097] 术语"细胞类型特异性"在应用于启动子时是指能够在于同一组织内的不同细胞 类型中寡核巧酸序列的表达的相对不存在下引导相同寡核巧酸序列在特定细胞类型中的 选择性表达的启动子。术语"细胞类型特异性"当应用于启动子时也意指能够促进寡核巧酸 在单一组织内的区域中的选择性表达的启动子。再次，选择性不必是绝对的。启动子的细 胞类型特异性可使用本领域中熟知的方法来评定，例如，如本文所述的免疫组织化学染色。 简言之，将组织切片包埋于石蜡中，并且使石蜡切片与第一抗体反应，所述第一抗体对由寡 核巧酸序列编码的多肤产物具有特异性，所述寡核巧酸序列的表达受启动子控制。作为石 蜡切片的替代方案，可将样品冷冻切片。例如，可在切片之前或期间冷冻切片，从而避免残 余石蜡的潜在干扰。允许对第一抗体具有特异性的标记的（例如，过氧化物酶缀合的）第 二抗体结合切片的组织且通过显微术检测特异性结合（例如，用抗生物素蛋白/生物素）。 [009引术语"选择性表达"、"选择性地表达"及其语法等效物是指在两个或更多个目标区 域中相对表达水平的比较。例如，"选择性表达"当与组织结合使用时是指目标基因在特定 组织中或表达所述基因的细胞在所述组织内分别与同一基因在另一组织中的表达水平和 表达所述基因的细胞在另一组织中的数目相比基本上更高的表达水平或基本上更大的细 胞数目（即，选择性不必是绝对的）。选择性表达不要求（但它可包括）目标基因在特定组 织中的表达和同一基因在另一组织中表达的总体不存在。类似地，如本文关于细胞类型所 用的"选择性表达"是指目标基因在特定细胞类型中或表达所述基因的细胞在特定细胞类 型中当分别与所述基因在另一细胞类型中的表达水平或表达所述基因的细胞在另一细胞 类型中的数目相比时基本上更高的表达水平或基本上更大的细胞数目。
[0099] 当关于两个或更多个核巧酸序列使用时术语"连续的"意指核巧酸序列在不存在 插入序列的情况下或在存在不包含一个或多个控制元件的插入序列的情况下串联连接。
[0100] 如本文所用，术语"编码……的核酸分子"、"编码……的核巧酸"、"编码……的DNA 序列"和"编码……的DNA"是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核巧酸的顺序或序列。运 些脱氧核糖核巧酸的顺序确定沿着多肤（蛋白质）链的氨基酸顺序。因此，DNA序列编码 氨基酸序列。
[0101] 当关于核酸使用时，术语"分离的"（如在"分离的寡核巧酸"中）是指在其天然来 源中通常与之缔合的至少一种污染物核酸分离的核酸序列。分离的核酸是W不同于在自然 中发现它的形式或布置存在的核酸。相比之下，未分离的核酸是W它们存在于自然中的状 态发现的核酸如DNA和RNA。例如，给定DNA序列（例如，基因）接近邻近基因在宿主细胞 染色体上发现；RNA序列如编码特定蛋白质的特异性mRNA序列在细胞中作为与编码众多蛋 白质的多种其他mRNA的混合物发现。然而，编码目标多肤的分离的核酸作为举例包括通常 表达目标多肤的细胞中的核酸，其中所述核酸处于不同于天然细胞的核酸的染色体或染色 体外位置中，或W另外的方式由与在自然中发现的不同的核酸序列侧接。分离的核酸或寡 核巧酸可W单链或双链形式存在。分离的核酸可通过多种技术（例如杂交、斑点印迹等） 容易地鉴别（如