DMT)保护基。通常，DMT保护基是 在5' -0H上且亚憐酷胺是在3' -0H上。
[0187] 修饰碱基的实例包括但不限于2-氨基嚷岭、2'-氨基-下酷巧-尿巧、2' -氨基 尿巧、2'-脱氧尿巧、2'-氣-胞巧、2'-氣-尿巧、2,6-二氨基嚷岭、4-硫代-尿巧、 5- 漠-尿巧、5-氣-胞巧、5-氣尿巧、5-吗I噪-尿巧、5-甲基-胞巧、肌巧、N3-甲基-尿 巧、7-脱氮-鸟嚷岭、8-氨基己基-氨基-腺嚷岭、6-硫代-鸟嚷岭、4-硫代-胸腺喀晚、2 硫代-胸腺喀晚、5-舰-尿巧、5-舰-胞巧、8-漠-鸟嚷岭、8-漠-腺嚷岭、7-脱氮-腺嚷 岭、7-二氮杂-鸟嚷岭、8-氧代-鸟嚷岭、5,6-二氨-尿巧W及5-径基甲基-尿巧。运些 合成单元是可商购的（例如，购自Glen Research公司）并且可通过化学合成并入至DNA 中。
[018引糖部分的修饰的实例是3'-脱氧化2'-氣化和阿拉伯糖巧化，然而，它不应被 解释为限于此。通过化学合成也可能将运些并入DNA中。
[0189] 5'端修饰的实例是5'-胺化、5'-生物素化、5'-巧光素化、5'-四氣-巧光 素化、5'-硫化W及5'-丹横酷化，然而，它不应被解释为限于此。
[0190] 3'端修饰的实例是3'-胺化、3'-生物素化、2, 3-二脱氧化、3'-硫化、 3'-丹横酷化、3'-簇化W及3'-胆固醇化，然而，它不应被解释为限于此。
[0191] 在一个优选的实施方案中，寡核巧酸可含有5'封闭取代基，其通过接头连接至5' 末端碳。接头的化学结构并不重要，除了它的长度，长度优选应为至少6个原子长，且接 头应当灵活。可使用多种无毒取代基，如生物素、胆固醇或其他类固醇或非嵌入的阳离子 巧光染料。特别优选的制造寡核碱基的试剂是由GlenResearch,SterlingVa.(现在GE Healthcare)作为切3?和切5ΤΜ销售的试剂，所述试剂是封闭的亚憐酷胺，其并入寡核巧酸 后分别产生3, 3, 3'，3' -四甲基Ν，Ν' -异丙基取代的吗I噪单碳菁染料和吗I噪二碳菁染料。 切3是特别优选的。当吗I噪碳菁是Ν-氧基烷基取代的时，其可通过具有5'端憐酸醋的憐酸 二醋，方便地与寡脱氧核巧酸的5'末端连接。当直接使用可商购的切3亚憐酷胺时，所得 的5'修饰包括封闭取代基和接头，所述封闭取代基和接头一起是Ν-径丙基、Ν' -憐脂酷丙 基3, 3, 3'，3' -四甲基吗I噪单碳菁。所考虑的其他染料包括若丹明6G、四甲基若丹明、横酷 若丹明 101、部花青 540、Atto565、Atto550 26、切3. 5、D巧47、D巧48、D巧49、D巧54、D巧55、 Dy556、Dy560、mStrawberry和mCherry。
[0192] 在一个优选实施方案中，吗I噪碳菁染料在吗I噪环的3和3'位置被四次取代。不受 理论的限制，运些取代防止染料变成嵌入染料。在运些位置处的取代基的身份不重要。
[0193] 本文所述的寡核巧酸设计还可与其他DNA编辑或重组技术组合用作更有效的供 体模板，所述技术包括但不限于使用位点特异性同源重组通过锋指核酸酶基因祀向、转录 活化因子样效应物核酸酶（TALEN)或成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR)。
[0194] 本发明总体上设及用于有效修饰基因组细胞DNA和/或将DNA重组至细胞的基因 组DNA中的方法。虽然不限于任何具体用途，但本发明的方法适用于例如将修饰引入细胞 的基因组中W便测定所述修饰对细胞的作用。例如，可将修饰引入编码酶的核巧酸序列中 W测定所述修饰是否改变酶的酶活性，和/或测定酶的催化区的位置。或者，可将修饰引入 DNA结合蛋白的编码序列中W测定所述蛋白质的DNA结合活性是否被改变，并且因此W描 述蛋白质内的特定DNA结合区。另一个替代方案是将修饰引入非编码调控序列（例如，启 动子、增强子、调控RNA序列（miRNA)等）中W便测定修饰修饰对可操作地连接至非编码调 控序列的第二序列的表达水平的作用。运对于例如限定具有调控活性的特定序列来说可能 是合乎需要的。
[0195] 用于产生祀向基因破坏的一种策略是通过产生由位点特异性核酸内切酶引起的 单链或双链DNA断裂。核酸内切酶最常用于生物体中的祀向基因破坏，所述生物体在传统 上对于更常规的基因祀向方法难治，如海藻、植物和较大动物模型，包括人。例如，存在设及 用于治疗和预防HIV感染的锋指核酸酶的进行中的当前人临床试验。另外，核酸内切酶工 程化当前用于尝试破坏作物中产生不希望的表型的基因。
[0196] 归巢核酸内切酶（还被称为大范围核酸酶）是序列特异性核酸内切酶，所述核酸 内切酶由于其较大（例如，〉14bp)裂解位点而W较高特异性程度产生基因组DNA中的双链 断裂。虽然归巢核酸内切酶对于其祀位点的特异性允许所诱导的DM断裂的确切祀向，但 归巢核酸内切酶裂解位点是罕见的并且发现祀向基因中的天然存在的裂解位点的概率较 低。
[0197] 一类人工核酸内切酶是锋指核酸内切酶。锋指核酸内切酶将非特异性裂解结构域 (通常化kl核酸内切酶的非特异性裂解结构域）与工程化W结合特异性DNA序列的锋指蛋 白结构域组合。锋指核酸内切酶的分子结构使得它们是用于将位点特异性双链断裂递送至 基因组的通用平台。锋指核酸内切酶的一个限制是对于祀位点的低特异性或基因组中多个 祀位点的存在可导致脱祀裂解事件。因为化kl核酸内切酶裂解为二聚体，所W防止脱祀裂 解事件的一种策略一直是设计在相邻的9碱基对位点处结合的锋指结构域。
[0198]TALEN是用于诱导单链或双链断裂成特异性DNA位点的可祀向的核酸酶，其然后 通过可用于产生裂解位点处的序列改变的机制修复。
[0199]用于工程化TALEN的DNA结合区的基本结构单元是源自天然存在的由黄单胞菌属 变形菌口编码的TALE的高度保守的重复结构域。通过TALEN结合DNA由高度保守的33-35 个氨基酸的重复序列的阵列介导，所述重复序列由在重复序列的氨基末端和簇基末端处的 另外TALE源性的结构域侧接。
[0200] 运些TALE重复序列特异性地结合DNA的单个碱基，所述碱基的身份由通常在重 复序列的位置12和13处发现的两个高变残基确定，其中阵列中重复序列的数目对应于所 需祀核酸的长度，选择重复序列的身份W匹配祀核酸序列。祀核酸优选地在15与20个碱 基对之间W便最大化祀位点的选择性。祀核酸的裂解通常在TALEN结合的50个碱基对内 发生。用于TALEN识别位点设计的计算机程序已经在本领域中描述。参见例如，Cermak 等，NucleicAcidsRes. 2011 年7 月；39(12) :e82。
[0201] 一旦被设计来匹配所需的祀序列，TALEN可重组表达且引入至原生质体中作为外 源蛋白质，或从原生质体内的质粒表达。
[0202] 另一类人工核酸内切酶是工程化的大范围核酸酶。工程化的归巢核酸内切酶通过 修饰现有归巢核酸内切酶的特异性产生。在一种方法中，将变异引入天然存在的归巢核酸 内切酶的氨基酸序列中并且然后筛选所得到的工程化的归巢核酸内切酶W选择裂解祀向 结合位点的功能性蛋白质。在另一种方法中，嵌合归巢核酸内切酶通过组合两种不同归巢 核酸内切酶的识别位点来进行工程化W产生由每个归巢核酸内切酶的半位点组成的新识 别位点。
[0203] 其他DNA修饰分子可用于祀向基因重组中。例如，肤核酸可用于将修饰诱导至一 个或多个祀细胞的基因组中（参见例如，Ecker的美国专利号5, 986, 053,其W引用的方式 并入）。简言之，包含至少部分肤主链的合成寡核巧酸用于祀向同源基因组核巧酸序列。在 结合双螺旋DNA之后或通过连接至肤核酸的诱变剂，诱导祀DNA序列的修饰和/或重组发 生。祀向特异性通过祀向序列与基因组序列之间的序列同源性程度测定。
[0204] 此外，本发明不限于本文用于执行基因组序列的修饰的具体方法。确实，考虑多种 方法。例如，可使用Ξ链体螺旋形成寡核巧酸灯F0)祀向基因。TF0可例如通过PCR或通过 使用基因合成仪设备合成产生。另外，在发现适合的天然序列的情况下TF0可分离自基因 组DNA。TF0可W多种方式使用，包括例如通过键结至诱变剂如包括但不限于补骨脂素或苯 下酸氮芥（参见例如，化vre等，Proc化t，1AcadSci,U.S.A. 90:7879-7883, 1993 出avre 等，JVirol67:7323-7331，1993 ;Wang等，MolCellBiol15:1759-1768, 1995;Takasugi等，P;roc化t，1AcadSci,U.S.A. 88:5602-5606,1991;Belousov等，NucleicAcidsRes 25:3440-3444, 1997)。此外，例如，TFO可键结至供体双链DM(参见例如，Chan等，JBiol 化em272:11541-11548,1999)。TFO还可通过W足够亲和力结合W引起易错修复来起作用 (Wang等，Science271:802-805, 1996)。
[020引本发明的方法不限于所使用的DNA修饰试剂的性质或类型。例如，运类DNA修饰 试剂释放自由基，所述自由基导致DNA链断裂。或者，所述试剂烷基化DNAW形成将阻断 复制和转录的加合物。在另一个替代方案中，所述试剂产生抑制细胞酶、从而导致链断裂 的交联或分子。已经连接至寡核巧酸W形成TF0的DNA修饰试剂的实例包括但不限于，吗I 噪并巧挫、糞二咸亚安（NDI)、反销、博来霉素、环丙烷并化咯并吗I噪的类似物W及菲并二氨 二嗯英。具体地说，吗I噪并巧挫是拓扑异构酶I抑制剂。运些酶的抑制导致链断裂和DNA 蛋白质加合物形成[Arimondo等，BioorganicandMedicinalQiem. 8,777,2000]。NDI 是可氧化鸟嚷岭的光氧化剂，所述鸟嚷岭可能引起鸟嚷岭残基的位点处的突变[Nunez, 等，Biochemistry, 39, 6190, 2000]。反销已经显示在TFO连接至所述试剂时与Ξ链体革己标 中的DNA反应。运种反应引起将是致突变的DNA加合物的形成[Columbier,等，Nucleic AcidsResearch, 24:4519, 1996]。博来霉素是广泛作用福射模拟物的DM断裂剂。它已 经连接至寡核巧酸并且显示作为呈所述型式的断裂剂是活性的[Sergeyev,NucleicAcids Research23, 4400, 1995 ;Kane,等，Biochemistry, ：34, 16715, 199引。环丙烷并化咯并吗I噪 的类似物已经连接至TF0并且显示烷基化Ξ链体祀序列中的DNA。烷基化DNA然后将含有 将是致突变的化学加合物[Lulditanov,等，NucleicAcidsResearch, 25, 5077, 1997]。菲 并二氨二嗯英是在光活化时释放自由基种类的掩蔽酿。它们已经连接至TFO且已经显示在 光活化时将断裂引入双链DNA中怔endinskas等，BioconjugateChem. 9, 555, 199引。
[0206] 本发明考虑诱导修饰和/或重组的其他方法。例如，另一个实施方案设 及诱导外源DNA片段与祀基因之间的同源重组（参见例如，Capecchi等，Science 244:1288-1292,1989)或通过使用具有针对祀向位点的亲和力的肤核酸（PNA)。仍然其他 方法包括通过聚酷胺进行的序列特异性DNA识别和祀向（参见例如，Dervan等，化rr化in ChemBiol3:688-693, 1999biochemistry38:2143-2151，1999)和使用具有位点特异性 活性的核酸酶（例如，锋指蛋白、TALEN、大范围核酸酶和/或CRISPR)。
[0207] 本发明不限于修饰和/或重组的任何特定频率。本发明的方法导致把核巧酸序列 中0. 2%至3%的修饰频率。然而，考虑任何修饰和/或重组频率（即，0%与100%之间） 在本发明的范围内。修饰和/或重组频率取决于用于诱导修饰和/或重组的方法、所使用 的细胞类型、所祀向的特定基因W及所使用的DNA突变试剂（如果存在）。另外，由于检测 方法的限制，用于检测修饰和/或重组的方法可能不能检测修饰和/或重组的所有发生。 此外，一些修饰和/或重组事件可能是沉默的，从而未给出已发生修饰和/或重组的可检测 的指示。不能检测沉默的修饰和/或重组事件提供修饰和/或重组的人工低估。由于运些 原因及其他原因，本发明不限于任何具体修饰和/或重组频率。在一个实施方案中，修饰和 /或重组的频率在0. 01%与100%之间。在另一个实施方案中，修饰和/或重组的频率在 0. 01 %与50%之间。在另一个实施方案中，修饰和/或重组的频率在0. 1 %与10%之间。 在另一个实施方案中，修饰和/或重组的频率在0. 1%与5%之间。
[020引如本文关于用能够将突变引入细胞基因组中的祀位点的DM修饰分子处理的细 胞群体所用的术语"突变频率"是指在处理的群体中与用DNA修饰分子处理的细胞的总数 目相比含有在祀位点处的突变的细胞的数目。例如，相对于用被设计来在细胞基因组中的 祀位点处引入突变的键结至补骨脂素DNA修饰分子TF0处理的细胞群体，5 %的突变频率意 指在用TF0-补骨脂素处理的总计100个细胞之中，5个细胞含有祀位点处的突变。
[0209] 虽然本发明不限于细胞中DNA修饰和/或重组的任何精确度，但应考虑取决于所 需结果，本发明的一些实施方案要求较高精确度。例如，基因修复所需的特异性序列变化 (例如，特定碱基变化）要求与产生仅需要破坏基因的基因敲除相比更高的精确度。使用本 发明的方法，实现大于现有技术方法的修饰和/或同源重组的更高精确度水平。
[0210] 基因修复寡核碱基至植物细胞中的递送
[0211] 用于转化植物细胞的任何通常已知的方法可用于递送基因修复寡核巧酸。说明性 方法在W下列出。本发明考虑许多方法来用一种或多种DNA修饰试剂转染细胞。确实，本 发明不限于任何具体方法。用于将DNA修饰试剂引入一种或多种细胞的方法是本领域中熟 知的并且包括但不限于，显微注射、电穿孔、被动吸附、憐酸巧-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介 导的转染、聚凝胺介导的转染、脂质融合、脂质转染剂、核转染、原生质体融合、逆转录病毒 感染、基因枪（即，粒子轰击）等。
[0212] 用于通过射弹穿透将DNA的较大片段引入具有纤维素细胞壁的植物细胞中的金 属微载体（微球体）的使用是相关领域的技术人员所熟知的（自此生物射弹递送）。美国 专利号4, 945, 050 ;5, 100, 792和5, 204, 253描述用于选择用于发射它们的微载体和装置的 一般技术。
[021引在本发明的方法中使用微载体的具体条件描述于国际公布W0 99/07865中。在 说明性技术中，按顺序添加冰冷的微载体化Omg/mL)、混合双链寡核巧酸化0mg/mL)、2. 5M 化CI2和0. 1M亚精胺；例如通过满旋轻轻揽拌混合物10分钟，并且然后在室溫下静置10 分钟，随后将微载体在5体积的乙醇中稀释，离屯、并重悬于100%乙醇中。在粘附溶液使用 8-10μg/μL微载体、14-17μg/mL混合双链寡核巧酸、1. 1-1. 4MCaClz和18-22mM亚精胺 的浓度可获得良好结果。在8μg/μL微载体、16. 5μg/mL混合双链寡核巧酸、1. 3MCaClz 和21mM亚精胺的条件下观察到最佳结果。
[0214] 还可使用微纤维将基因修复寡核碱基引入用于实践本发明的植物细胞中W穿透 细胞壁和细胞膜。Coffee等的美国专利号5, 302, 523描述使用碳化娃纤维来促进黑色墨西 哥甜的玉米悬浮培养物的转化。可用于使用微纤维引入用于植物细胞转化的DNA的任何机 械技术可用于递送用于衍变的基因修复寡核碱基。
[0215]用于基因修复寡核碱基的微纤维递送的示例性技术是如下：将无菌微纤维 (2μg)悬浮在150μL的含有约10μg的混合双链寡核巧酸的植物培养基中。使悬浮培养 物沉降并且将等体积的压积细胞和无菌纤维/核巧酸悬浮液满旋10分钟并接种。立即或 在达约120小时的延迟情况下（如对于特定性状适当的）施加选择性培养基。
[0216] 在替代实施方案中，基因修复寡核碱基可通过来源于植物部分的原生质体的电 穿孔递送至植物细胞。根据本领域的技术人员熟知的技术通过植物部分、特别是叶的酶 处理来形成原生质体。参见，例如Gallois等，1996,MethodsinMolecularBiology 55:89-107,HumanaPress,Totowa,N.J.;Kipp等，1999,MethodsinMolecularBiology 133:213-221,HumanaPress,Totowa,NJ。原生质体不需要在电穿孔之前在生长培养基中培 养。用于电穿孔的示例性条件是0. 3mL总体积中的3X105个原生质体，其中基因修复寡核 碱基的浓度是0. 6-4μg/mL之间。
[0217] 在一个替代实施方案中，根据本领域的技术人员熟知的技术在膜修饰剂聚乙二醇 的存在由植物原生质体摄取核酸。在另一个替代实施方案中，基因修复寡核碱基可通过用 微毛细管将其注射至植物细胞中或至原生质体中来递送。
[021引在一个替代实施方案中，将核酸包埋在由藻酸巧组成的微珠中并且在存在膜修饰 剂聚乙二醇的情况下由植物原生质体摄取（参见例如，Sone等，2002,Liu等，2004)。
[0219] 在一个替代实施方案中，将核酸冷冻在水中并且通过轰击W微颗粒的形式引入植 物细胞中（参见例如，Gilmore, 1991，美国专利5, 219, 746 ;化inegar等）。
[0220] 在一个替代实施方案中，将连接至纳米颗粒的核酸通过在含有所述纳米颗粒的悬 浮液中解育细胞来引入完整植物细胞中（参见例如，Pasupathy等，2008)或通过经由颗 粒轰击将它们递送至完整细胞或通过共解育将它们递送至原生质体中（参见，例如Torney 等，2007)。
[0221] 在一个替代实施方案中，使核酸与穿透肤复合且通过共解育递送至细胞中（参见 例如，Chu曲等，2008,W0 2008148223A1;Eudes和Chu曲）。
[0222] 在一个替代实施方案中，通过电穿孔将核酸引入完整细胞中（参见例如，化 等，1998,US2003/0115641Al，Dobres等）。
[0223] 在一个替代实施方案中，通过将干燥胚胎细胞浸溃在具有核酸的溶液中来将核酸 递送至细胞中（通过将干胚胎浸溃在（参见例如，T6pfer等，1989,Senaratna等，1991)。
[0224] 植物的选择
[0225] 在不同实施方案中，如本文所公开的植物可W是双子叶植物、单子叶植物或裸子 植物的任何物种，包括作为树或灌木生长的任何木本植物物种、任何草本物种或产生食用 水果、种子或蔬菜的任何物种或产生彩色或芳香花的任何物种。例如，植物可选自由W下 组成的组的植物物种：芥花、向日葵、玉米、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、首猜、 大麦、高梁、西红柿、芒果、桃子、苹果、梨、草替、香蕉、甜瓜、上豆、胡萝K窝宦、洋葱、大豆、 大豆属、甘薦、魏豆、鹰嘴豆、紫花魏豆、蚕豆、扁豆、萝K宪菁甘蓝、球芽甘蓝、羽扇豆、花挪 菜、羽衣甘蓝、菜豆、杨树、松树、按树、葡萄、相橘、黑小麦、首猜、黑麦、燕麦、草皮和牧草、亚 麻、油菜、芥菜、黄瓜、牵牛花、香脂、辣椒、茄子、万寿菊、莲花、卷屯、菜、菊花、康乃馨、郁金 香、尊尾、百合W及产坚果植物（在它们尚未具体地提及的情况下）。
[0226] 可使用本领域中通常已知的方法针对对除草剂的抗性或耐受性对植物和植物细 胞进行测试，例如通过在存在除草剂的情况下生长植物或植物细胞且测量相较于在不存在 除草剂情况下的生长的生长速率。
[0227] 如本文所用，植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本上正常生长被定义为植 物、植物器官、植物组织或植物细胞的生长率或细胞分裂率为表达野生型AHAS蛋白的对应 植物、植物器官、植物组织或植物细胞的生长率或细胞分裂率的至少35%、至少50%、至少 60 %或至少75%。
[022引如本文所用，植物、植物器官、植物组织或植物细胞的基本上正常发育被定义为植 物、植物器官、植物组织或植物细胞中的一个或多个发育事件的出现与在表达野生型蛋白 质的对应植物、植物器官、植物组织或植物细胞中发生的那些发育事件基本上相同。
[0229] 在某些实施方案中，本文提供的植物器官包括但不限于叶、茎、根、叶芽、花芽、分 生组织、胚芽、子叶、胚乳、專片、花瓣、雌蕊、屯、皮、雄蕊、花药、小抱子、花粉、花粉管、胚珠、 子房和果实或从其取得的切片、薄片或盘。植物组织包括但不限于愈伤组织、基本组织、维 管组织、胆藏组织、分生组织、叶片组织、茎组织、根组织、冠瘦组织、植物肿瘤组织W及再生 组织。植物细胞包括但不限于具有细胞壁的分离的细胞、其各种大小的聚集体W及原生质 体。
[0230] 当与由类似经受的非耐受样植物提供的相比，植物当其经受相关除草剂时是对所 述除草剂基本上"耐受性的"并且提供转移至右侧的剂量/响应曲线。运类剂量/响应曲 线具有绘制在X轴上的"剂量"和绘制在y轴上的"致死百分比"、"除草作用"等。耐受性 植物将需要比非耐受性样植物更多的除草剂，W便产生给定除草作用。当经受在通常由农 用化学品团体用于杀死地中的杂草的浓度和比例下的除草剂时，对除草剂基本上"抗性"的 植物展示很少（如果有）坏死、溶解、稱绿或其他损害。对除草剂具有抗性的植物还是能够 容忍除草剂的。
[0231] 植物的产生
[0232] 植物物种的不同组织的组织培养和自其再生植物是已知的。例如，通过组织培 养繁育芥花栽培品系在W下的任一者中描述但不限于W下中的任一者：化uong等，"A SimpleCultureMethodforBrassicahypocotylsProtoplasts,"PlantCellReports 4:4-6, 1985 ;Barsby,T.L.，等，"ARapidandEfficientAlternativeProcedurefor the民egenerationofPlantsfromHypocotylProtoplastsofBrassicanapus,"Plant CellReports(Spring,1996) ;Kartha,K.，等，"InvitroPlantFormationfrom StemExplantsof民ape,"Physiol