.Plant, 31:217-220, 1974 ;Narasimhulu,S.， 等，"SpeciesSpecificShoot民egenerationResponseofCotyledonaryExplantsof Brassicas,"PlantCell民eports(Spring1988) ;Swanson,E.，"MicrosporeCulturein Brassica,"MethodsinMolecularBiology,第 6 卷，第 17 章，第 159 页，1990〇
[0233] 变种的进一步繁殖可通过组织培养和再生发生。大豆的不同组织的组织培养和自 其再生植物是熟知的和广泛公布的D例如，可参考Komatsuda，T.等/'GenotypeXSucrose InteractionsforSomaticEmbryogenesisinSoybeans,"CropSci.31:333-337, 1991 ; Stephens,P.A.，等，"AgronomicEvaluationofTissue-Culture-DerivedSoybean Plants，"T'heor.Appl·Genet. 82:633-635, 1991 ;Komatsuda，T.等，"Maturationand GerminationofSomaticEmbryosasAffectedbySucroseandPlantGrowth RegulatorsinSoybeansGlycinegracilisSkvortzandGlycinemax(L. )Merr."Plant Cell，TissueandOrganCulture, 28:103-113, 1992;加ir，S.等，"Regenerationof FertilePlantsfromProtoplastsofSoybean(GlycinemaxL.Merr. );Genotypic DifferencesinCultureResponse,"PlantCellReports11:285-289, 1992 ;Pandey，P. 等，"Plant民egenerationfromLeafandHypocotylExplantsofGlycinewightii(W. andA. )VERDC.var.longicauda,"JapanJ.Breed. 42:1-5, 1992 ; 及Shetty,K.， 等，"StimulationofInVitroShootOrganogenesisinGlycinemax(Merrill.)通过 尿囊素和醜胺，"PlantScience81:245-251,1992。Collins等的 1991 年 6 月 18 日颁布 的美国专利号5, 024, 944和Ranch等的1991年4月16日颁布的美国专利号5, 008, 200特 此W引用的方式整体并入本文。 实施例
[0234]实施例1 :GR0N长度
[023引 Sommer等（MolBiotechnol. 33:115-22, 2006)描述了用于检测体内基因转化的 报道系统，所述系统依赖于单核巧酸变化在绿色巧光蛋白（GF巧变体中在蓝色与绿色巧光 之间转换。运种报道系统适用于使用拟南芥作为模型物种W便评定在GR0N长度的修饰之 后GR0N转化的效率的W下实验中。
[0236] 简言之，对于此实施例和后续实施例，通过本领域的技术人员已知的方法产生具 有蓝色巧光蛋白基因的多个拷贝的拟南芥品系（参见例如，Clou曲和化ent，1998)。用 此品系建立源自根的分生组织培养物，其用于原生质体分离和培养（参见例如，Mathur 等，1995)。GR0N递送至原生质体中通过聚乙二醇（PEG)介导的GR0N摄取至原生质体中来 实现。使用与由化jiwara和Kato(2007)描述的方法类似的使用96孔型式的方法。在W 下简要描述方案。所给出的体积是施加至96孔培养皿的单独孔的体积。
[0237] 1.将6. 25μ1的GR0N(80μM)与25μ1的拟南芥BFP转基因根分生组织源性的原 生质体在于96孔板的每个孔中5χ106个细胞/ml下进行混合。
[023引 2.添加31. 25μ1的40%PEG溶液并且混合原生质体。
[0239] 3.将处理的细胞在冰上解育30分钟。
[0240] 4.向每个孔添加200μ1的W5溶液且混合细胞。
[0241] 5.使板在冰上解育30分钟，从而允许原生质体沉降至每个孔的底部。
[0242] 6.除去在沉降的原生质体W上的200μ1培养基。
[024引 7.添加85μ1的培养基（MSAP，参见Mathur等，1995)。
[0244] 8.将板在室溫下在黑暗中解育48小时。在添加培养基之后GR0N的最终浓度是 8μΜ。
[0245] 在GR0N递送之后四十八小时，通过流式细胞术对样品进行分析W便检测绿色和 黄色巧光不同于对照原生质体的绿色和黄色巧光的原生质体度FP0指示与BFP祀标相比非 祀向GR0N无变化；C是编码链设计且NC是非编码链设计）。单一C至Τ核巧酸差异（编码 链）或G至A核巧酸祀向BFP4分子中屯、中的突变（非编码链）。绿色巧光由在BFP基因中 弓I入祀向突变引起，从而导致GFP的合成。图1中示出了结果。
[0246]W下表示出被设计用于将蓝色巧光蛋白度F巧基因转化成绿色巧光的示例性101 聚体和201聚体BFP4/NC5' -3PS/3' -3PSGR0N。（3PS指示在5'和3'寡核巧酸端中的每 个处的3硫代憐酸醋键联）。
[0247]表 1 :
[024引
[0249] * =PS键联（硫代憐酸醋）
[0巧0] 实施例2 :使用5'切3/3'idC标记的GR0N的转化率
[0251] 运一系列实验的目的是比较硫代憐酸醋（P巧标记的GR0N(在替换页（细则第26 条）
[0 巧 2]
[0巧3] GR0N的每一端具有3PS部分）至5'切3/3'idC标记的GR0N的效率。5'切3/3'idC 标记的GR0N具有5'切3巧光团（亚憐酷胺）和3'idC反向碱基。使用蓝色巧光蛋白度FP) 至绿色巧光的转化评定效率。
[0254] 在所有Ξ个实验中，通过将GR0N阳G递送至单独化Icon管（标记的"管"）或96 孔板（标记的"96孔培养皿"）中的原生质体进行，如通过细胞计量术所测定，在BFP至GFP转化效率方面在不同GR0N化学之间不存在显著差异（图1)。
[0巧引实施例3 :41聚体BFP4/NC5' -3PS/3' -3PSGR0N与冈崎片段GR0N之间的比较[0256] 运一系列实验的目的是在存在和不存在多种博来霉素家族Zeocin?(lmg/ml)W 诱导DM断裂的情况下，比较在GR0N的各端具有3PS部分的硫代憐酸醋（P巧标记的GR0N与"冈崎片段GR0N"的转化效率。运些GR0N的设计在图2中描绘。通过PEG处理将GR0N 递送至拟南芥BFP原生质体中，并且通过细胞计量术在处理后24小时测定BFP至GFP转化。 将用博来霉素（Img/ml)处理的样品在阳G处理之前与博来霉素一起在冰上解育90分钟。 [0巧7] -般来说，博来霉素（Img/ml)的存在增加BFP至GFP转化，如通过细胞计量术所 测定（表2)。在博来霉素存在和不存在的情况下，当与在前九个5'RNA碱基中的每个上含 有一个2' -0Me基团的NC冈崎GR0N相比时，在GR0N的5'端处的第一RNA碱基上含有一 个2' -0Me基团的NC冈崎GR0N在将BFP转化至GFP方面更有效（图2和表2)。
[0巧8] 在所有实验中，在存在或不存在Img/ml的博来霉素的情况下，在41聚体BFP4/NC 5' 3PS/3' 3PS与在第一 5'RNA碱基上含有一个5' 2' -0me基团的71聚体冈崎片段BFP4/NCGR0N(指代为BFP4 71聚体（1)NC)之间在BFP至GFP转化方面不存在显著差异，如通过 细胞计量术所测定（图2和表2)。重要的是注意在博来霉素存在下（并且预期对于博来霉 素、腐草霉素、他利霉素、培洛霉素w及此抗生素家族的其他成员来说），所述转化变成链独 立性（即，具有在运些实验中测试的设计的C和NCGRON展示大约相等活性）。
[0巧9] 表2 :在存在和不存在糖肤抗生素博来霉素的情况下标准GR0N设计与冈崎片段 GR0N设计的比较。
[0260]
[026U实施例4 :41聚体、101聚体和201聚体BFP4/NC5' -3PS/3' -3PSGR0N之间的比 较
[0262] 运一系列实验的目的是比较在不同长度的GR0N的各端处具有3PS部分的硫代憐 酸醋（P巧标记的GR0N的转化效率（在存在或不存在博来霉素的情况下）：表1中所示的 41聚体、101聚体和201聚体。再次，博来霉素（Img/ml)的存在增加BFP至GFP转化率，如 通过细胞计量术所测定（表3)。在存在或不存在博来霉素的两者情况下在NC
[0263] 替换页（细则第26条）
[0264]GR0N长度增加的情况下所有Ξ个实验的总体趋势是线性的。除了在博来霉素存 在下BFP-4/NC/101和BFP-4/C/101，运具有接近于等于但小于41聚体NCGR0N的转化率。 运与使用BFP-4/41编码和非编码GR0N的所有先前实验形成对比，其中非编码总是远远优 异于编码GR0N。转化频率的运种不对称还适用于在此实验系列中使用的BFP-4/201GR0N。
[0265]表 3 :
[0266]
[0267] 实施例5 :CRISPR与GRON组合W改进植物中的转化。
[026引 当组装CRISPR复合物时必须考虑Ξ种设计组分：化s9、gRNA(引导RNA)和祀区域 (内源性祀基因中的原型间隔区）。
[026引 Cas9
[0270] -从分别由35S或玉米泛素驱动的针对拟南芥或玉米优化的酿脈链球菌密码子瞬 时表达Cas9基因。通过Genewiz或DNA2. 0合成优
[0271] 替换页（细则第26条）
[027引化的基因。NB必须确保未产生隐蔽型内含子。
[0273] -根据G1155的RBCSE9终止子
[0274] -单一SV40NLS(P邸服V)作为C-末端融合
[0275] -载体主链将是根据所有瞬时表达系统-G1155。
[0276] gRNA
[0277] -建议使用嵌合tracrRNA-根据LeCong等，2013 和Jinek等，2013 的pre-creRNA。 注意LeCong等显示天然全长tracr+pre-crRNA复合物比嵌合型式更有效地裂解。选择因 此将是使用全长（89bp)tracrRNA制备嵌合体。
[0278] -gRNA的序列（(脚2。表示引导序列）。加括号的序列包含全长89bp形式。
[0279] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG(TTATGT TCTTGAAAAAAGTGAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGCTTTTTT)
[0280] W下来自Cong等的图显示天然复合物和嵌合体：
[0281]
[0282] 替换页（细则第26条）
[0283] -gRNA将在拟南芥（W下给出的序列）中在AtU6RNApolIII启动子下表达。在 玉米中，可使用ZmU6RNApolIII启动子。运些选择是基于Wang等2008。
[0284]-根据G1155的RBCSE9终止子或根据Wang等2013的一串Τ'W及W下所示的单 组分方法。
[0285] 在来自Wang等的U6启动子序列处
[0286] 祀区域
[0287]-引导序列特异性由祀区域序列限定。不管模型生物体的选择，运将是BFP的Y6細 基因座。在Y6細附近的PAM(NGG)序列是唯一设计限制。此外，在引导序列（"种子序列"） 的3' 12bp中包括Y6細位置将意味着一旦修复已经实现，位点将不会得到再切割。
[028引
[0289] 将需要来自G1155的独特载体主链W便实现化s9和曲NA的共递送。此问题在单 组分方法情况下将被规避：
[0290] 单组分方法
[02川 LeCong等（2013)使用简化方法，从而由polIIIU6启动子驱动表达曲NA和 化s9作为瞬时构建体，如W下所概述。W此方式，对于给定玉米，可通过在引导插入序列中 简单交换来祀向多个基因。将使EFla启动子置换为适合于作物的一种（pMAS对于At,化i 对于Zm)。对于终止子，将使用RBCSE9。用于植物中的化S将是如上所概述的单一C末端 SV40。
[0292] 替换页（细则第26条）
[0293] 注意在W下的构建体中，截短曲NA在不包括示踪RNA区域的情况下使用。作者表 明，在人中，运在引导全长型式的化s9方面不那么有效。因此建议在此使用全长曲NA。值 得注意的是，在酵母中使用CRISPR的后续论文中，DiCarlo等（2013)使用了全长型式。所 述盒将被克隆至G1155背景中。
[0294]
[0295] 嵌合crRNA的表达载体的示意图。可使用退火的寡核巧酸将引导序列插入在两个 抓si位点之间。载体已经含有部分指导重复序列（灰色）和部分tracrRNA(红色）序列。 WPRE，±拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。
[029引体内测定 阳297] 瞬时洗择
[029引-用于确认植物中的祀标识别和核酸酶活性的一种方法将是模拟Zhang等（2013) 用于TALEN的YFP单链退火测定。间隔区序列（祀序列）加PAM将需要插入YFP或等效基 因中。
[029引-瞬时洗择
[0300] -TALEN-BFP系统可用作对照。
[0301]-虽然上述方法将是用于确认给定CRISPR系统对于给定间隔区序列的功能性的 进行中工具，但在植物中CRISPR的活性概念的证据将是使用GFP系统。
[0302]-在此用于BFP-GFP的设计将与G1155 -起共转化成At并且无GR0N。如果切 割足够有效，GFP表达的降低将是明显的。运将可能需要质粒负载的优化。
[030引-一旦活性得W确认，基因组BFP祀标将W可视和基于序列的读数祀向。
[0304] 体外测定
[030引-为了快速确认CRISPR系统的活性，可根据Jinek等2012使用体外测定。将在此 预先制备的和纯化的酿脈链球菌化s9与合成曲NA和含有识别序列的质粒一起解育。通过 凝胶电泳分析成功的裂解W寻找切割质粒。详细方案：
[0306] 质粒DNA裂解测定。在反应之前通过加热至95°C且缓慢冷却至室溫来将合成或体 外转录的tracrRNA和crRNA预先退火。将天然或限制酶切消化线性化质粒DNA(300ng(~ 8nM))与纯化的Cas9 蛋白（50-500nM)和tracrRNA:crRNA双链体巧0-500nM，l:l) 一起在 Cas9质粒裂解缓冲液（20mM肥阳SpH7. 5，150mMKC1，0. 5mMDTT，0.ImM邸TA)中在有或 无lOmMMgC12的情况下在37°C下解育60分钟。用含有250mM邸ΤΑ的5XDNA加载缓冲液 终止反应，通过0. 8%或1%琼脂糖凝胶电泳解析且通过漠化乙锭染色可视化。对于化s9 突变体裂解测定，在负载于琼脂糖凝胶上之前用5XSDS加载缓冲液（30%甘油、1. 2%SDS、 250mM邸TA)终止反应。
[0307] 作物中的性状祀标
[030引鉴于CRISPR识别序列的灵活性，不难发现如由3'NGGPAM序列限定的潜在原型间 隔区序列。
[0309]ZmEPSPS
[0310]W下实施例示出适合的原型间隔区序列（黄色）和PAM(蓝色）W便在ZmEPSPS 的催化位点中形成DS断裂，其中在T97和P101处的突变已知引起草甘麟抗性。断裂的随 后寡核巧酸介导的修复（0DM)将产生所需变化。
[0311]
[0312]W下表给出目标作物中的目标基因的原型间隔区序列：
[031引
[0314] 设计约束的限制在于经常难W发现被0DM改变的核巧酸的12bp内的NGG序列。运 是重要的，因为如果事实如此，则成功0DM将意味着随后切割将是不可能的，因为原型间隔 区种子序列将被改变。Jinek等（2012)表面运对于切割效率来说是有害的。
[0315] 参考文献
[0316]LeCong等 2013Science:第 339 卷第 6121 期第 819-823 页。
[0317]Jinek等 2012Science. 337:816-21 [031引Wang等 2008RNA14:903-913
[0319]Zhang等 2013.PlantF*hysiol. 161:20-27
[0320] 本领域技术人员易于了解，本发明充分适于执行目标并且获得所提到的W及其中 固有的结果和优点。本文中提供的实施例代表优选实施方案，为示例性的，并且并非意图作 为本发明的范围的限制。
[0321] 本领域技术人员将易于显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可 对本文中所公开的发明进行可变的替换和修改。
[0322] 说明书中提到的所有专利和公布指示本发明所属领域中的普通技术人员的水平。 所有专利和公布在本文中W引用的方式并入，其程度等同于仿佛特定且个别地指示每一单 独的公布W引用的方式并入。
[0323] 本文中适当地说明性地描述的发明可在缺少在本文中并未具体公开的任何一个 或多个元件、一个或多个限制的情况下实践。因此，例如，在本文中的每一个例子中，术语 "包括"、"主要由……组成"和"由……组成"中的任何术语可由其它两个术语中的任何一个 代替。已使用的术语和措辞是用作描述而非限制的术语，并且在使用运类术语和措辞时并 非旨在排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，各种修改在本发 明要求的范围内是可能的。因此，应理解，尽管本发明已由优选实施方案和任选特征具体公 开，但是本领域技术人员可采用本文中公开的概念的修改和变化，并且应理解，所述修改和 变化被视为在如由所附权利要求书定义的本发明的范围内。
[0324] 在W下权利要求书内阐述其它实施方案。
【主权项】
1. 一种用于将基因修复寡核碱基（GRON)介导的突变引入细胞中的靶脱氧核糖核酸 (DNA)序列中的方法，所述方法包括： 将GR0N递送至所述细胞中，其中所述GR0N包括以下特征中的一项或多项且优选2、3、 4、5或更多项： 所述GR0N长度大于55个碱基，所述GR0N任选地包含两个或更多个突变位点以用于引 入所述靶DNA中； 所述GR0N包含一个或多个无碱基核苷酸； 所述GR0N包含一个或多个8'氧代dA和/或8'氧代dG核苷酸； 所述GR0N包含在其3'端处的反向碱基； 所述GR0N包含在其5'或3'端处的一个或多个2' 0-甲基核苷酸； 所述GR0N包含在其5'端处的一个或多个2' 0-甲基RNA核苷酸； 所述GR0N包含在其5'端处的至少两个2' -0-甲基RNA核苷酸； 所述GR0N包含嵌入染料； 所述GR0N包含5'末端帽； 所述GR0N包含选自由以下组成的组的主链修饰：硫代磷酸酯修饰、膦酸甲酯修饰、锁 核酸（LNA)修饰、0-(2-甲氧基乙基）（Μ0Ε)修饰、二PS修饰以及肽核酸（PNA)修饰； 所述GR0N包含一个或多个链内交联； 所述GR0N包含共价连接至其的一种或多种荧光染料；以及 所述GR0N包含增加杂交能量的一个或多个碱基。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括使用核苷酸多聚体合成所述GR0N的 全部或一部分。3. 如权利要求1或2中的一项所述的方法，其中所述靶脱氧核糖核酸（DNA)序列是在 所述植物细胞基因组内。4. 如权利要求1-3中的一项所述的方法，其中所述植物细胞是选自由以下组成的组的 物种：芥花、向日葵、玉米、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、苜蓿、大麦、高粱、西红 柿、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、洋葱、大豆、大豆属、甘蔗、豌 豆、鹰嘴豆、紫花豌豆、蚕豆、扁豆、萝卜、芜菁甘蓝、球芽甘蓝、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘蓝、菜 豆、杨树、松树、桉树、葡萄、柑橘、黑小麦、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和牧草、亚麻、油菜、芥菜、 黄瓜、牵牛花、香脂、辣椒、茄子、万寿菊、莲花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鸢尾以及百 合。5. 如权利要求1-4中的一项所述的方法，其中所述植物细胞是转基因的。6. 如权利要求1-5中的一项所述的方法，其中所述靶DNA序列是所述植物细胞的内源 基因。7. 如权利要求1-6中的一项所述的方法，其还包括从所述植物细胞再生具有通过所述 GR0N引入的突变的植物。8. 如权利要求7所述的方法，其还包括从所述植物采集种子。9. 一种植物细胞，其包含根据权利要求1-6中的一项所述的方法由GR0N引入的基因组 修饰，或一种植物，其包含根据权利要求7所述的方法由GR0N引入的基因组修饰，或一种种 子，其包含根据权利要求8所述的方法由GR0N引入的基因组修饰。10.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是选自由以下组成的组的一种或多种细 胞：植物细胞、动物细胞、细菌细胞、酵母细胞以及真菌细胞。
【专利摘要】本发明提供用于修饰植物细胞以及源自其的植物和种子中的基因的改进方法。更具体地说，本发明涉及通过组合基因修复寡核苷酸与增强靶细胞基因修复机制的组分的可用性的方法来增加靶基因突变的效率。
【IPC分类】A01H1/00, A01H5/00
【公开号】CN105431039
【申请号】CN201480024688
【发明人】P·R·比瑟姆, G·F·W·格卡尔, C·施波克, N·J·萨奥尔, J·皮尔斯, R·E·塞格米, J·莫左鲁克
【申请人】希博斯美国有限公司, 希博斯欧洲有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2905391A1, EP2966980A1, WO2014144951A1