专利名称：用于将基因引入肾细胞的病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于将基因引入肾细胞的副粘病毒载体。
背景技术：
近年来，将基因转移至哺乳动物细胞的技术得到发展，对于用基因疗法治疗各种人类疾病的兴趣越来越大。将基因转移至活体是在体内或回体(ex vivo)进行。体内基因转移包括给药含有基因等插入物的载体至活体，回体转移包含将基因引入衍生于病人的细胞或其它细胞，然后将它们送回体内。
不同于将基因转移至细胞(如培养的细胞)，一般难以将基因转移至活的器官。尤其，哺乳动物肾脏包含结构复杂的组织以及动脉、静脉、肾小管、肾小球等，其代谢更新相对较少。因此，难以将基因有效地转移到此器官中。肾脏的结构对于维持其正常功能十分重要，因此基因转移必需无损于这一器官或其组织。为了将基因转移至肾脏细胞中，应注意，难以以高效力将基因引入衍生自肾小球、肾小管和间质的细胞中。
已有人利用HVJ(hemagglutinating virus of Japan；Sendai virus)和脂质体(Tomita，N.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.186129-134，1992)将基因引入肾脏。已制备出包含HMG-1(高迁移率1组)蛋白和SV40大T抗原基因的表达质粒的脂质体，它们然后通过一个引自肾动脉的导管被注入大鼠肾脏，以便将所述基因引入肾脏。结果表明，基因转移后第4天，用免疫组化方法在15％的肾小球毛细血管细胞中成功检测到了SV40大T抗原的表达。但是，引入基因数天后，表达水平达到峰值，然后降低，并且仅有肾小球细胞表达该基因。有人用HVJ-脂质体进行了类似的实验，以便将人CD59基因引入狗的肾脏(Akami，T.等，Transplantation Proceedings 261315-1317，1994)。但是，CD59基因在肾小球细胞中仅为瞬时表达，其水平不够高。在基于HVJ-脂质体的基因转移方面，有人致力于改进制备脂质体的方法(Tsujie，M.等，Kidney Int.571973-1980，2000)。但基因转移效力仍然不能令人满意。此外制备HVJ-脂质体的方法很复杂，而且所制备的组合物尚缺乏足够的稳定性。
Zhu等报道了用阳离子脂质体与质粒DNA的混合物将基因转移至成年小鼠的各种组织中(Zhu，N.等，Science 261(5118)209-11，1993)。将这种载体混合物注射到血管中以后，在源自肺、脾、淋巴结、骨髓等组织的细胞中检测到了瞬时表达。而且，基因也被转移至25％-50％的肾内皮细胞中。但是该报道既没提到将基因转移至肾小球细胞中的可能性，也没提到表达的持续时间。
据报道，有人将腺病毒载体用作病毒载体来实现向肾脏中的基因转移(Moullier，P.等，Kidney Int.45(4)1220-5，1994)。β-半乳糖苷酶基因被引入成年大鼠肾脏中，方法是从肾动脉灌注一种含有β-半乳糖苷酶基因的复制-缺陷型腺病毒，或者将该病毒经由导管注入肾盂中，以便引起回流。在从肾动脉灌注的情况中，观察到β-半乳糖苷酶的低水平瞬时表达。相比之下，在为了回流而实施注入的情况中，表达可见于肾乳头和髓质区肾小管，但未见于肾内皮细胞。通常，经由血管内注射腺病毒载体而进行的感染不能保证它们对肾细胞的足够感染力。已有人作出变动，以便改进腺病毒基因转移的方法(美国专利5,869,230)。此专利称，在载体转移期间，通过采用将肾脏在冰上冷却等方法以防止局部缺血性损伤；用诸如血红蛋白等供氧剂防止细胞缺氧；用诸如多巴胺(dopamine)等血管扩张剂调节载体感染；用此方法可以将载体引入5％-15％的肾脏内皮细胞中。
但已有人报道腺病毒载体能诱导相对较强的免疫反应。最初的非-特异性炎症反应之后，由细胞毒T淋巴细胞介导的特异性免疫反应对转染细胞进行攻击。已有人致力于通过基因缺失和修饰来开发免疫原性降低的腺病毒载体，但至今没有成功。
用于基因治疗的病毒载体包括逆转录病毒载体。逆转录病毒载体的优势在于，通过将基因整合至宿主染色体而确保该基因的长期稳定表达，但一般情况下，它们的目标局限于特定细胞，而且必需是分裂中的细胞。由于绝大多数肾脏细胞都是已经终末分化的非分裂细胞，由逆转录病毒载体-介导的基因治疗主要限于回体方法。还有人开发了假型载体和基于慢病毒的载体，但这些载体有通过随机染色体插入而激活癌基因和破坏肿瘤抑制基因的危险。其它缺陷包括难以制备高滴度的病毒载体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够确保高效地将基因转移肾细胞的病毒载体，以及该载体的用途。更具体的，本发明提供了一种将基因引入肾细胞的副粘病毒载体，一种包含了用于将基因转移至肾细胞的载体的组合物，和一种应用该载体将基因引入肾细胞的方法。
近年来，应用病毒反基因技术开发了基于副粘病毒(包括仙台病毒)的用于基因转移的重组病毒载体(Kato，A.等，Genes Cells 1569-579，1996；Kato，A.等，EMBO J.16578-587，1997；Yu，D.等，Genes Cells 2457-466，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Sakai，Y.等，FEBSLett.456221-226，1999)。本发明者使用重组仙台病毒载体将基因转移至肾，以便确定使用该载体是否能够克服以前的基因转移载体的问题。特别是，本发明人从临床角度研究了仙台病毒载体的体内转染活性，包括转染效力，持久性，以及基因表达的效力，和载体给药途径的影响。
结果表明，含外源基因的重组仙台病毒载体能在体内以高效力将基因转移至肾细胞中。无论是从肾动脉灌注给药还是从尿道回流给药，所述载体都能将基因广泛地转移至肾细胞中的大面积区域，尤其是，从肾动脉给药使GFP在诸如间质细胞和肾小球细胞等细胞中高水平表达。经由仙台病毒转移的基因的持久性表达至少可持续约1个月。此外，在长期维持的肾组织中，还可以在肾小管细胞中检测到转基因的表达。另一方面，在从尿道引起回流的给药方法中，转基因主要表达在肾小管细胞(远端和近端肾小管)中，也表达在间质细胞中。
具体地，本发明人发现(1)重组副粘病毒载体可以以高效力在肾细胞中表达基因；(2)所述载体能根据不同的给药途径将基因引入不同类型的细胞中，而且从肾动脉给药不会导致巨噬细胞浸润至间质细胞和肾小球组织附近的区域中；和(3)病毒基因组和外源基因都能长期稳定表达。这些发现证实，副粘病毒载体对于将基因转移至肾脏中是有效的。目前已经验证了腺病毒在向肾脏转移基因方面的可应用性。为了将基因转移至肾脏，本发明的副粘病毒载体可以是具有等效于或高于腺病毒的相容性的载体。重组副粘病毒载体以及腺病毒载体具有数种重要优势，使得转基因的高水平表达和基因转移的高效力都不依赖于细胞类型。
常常与腺病毒载体相伴的一个问题是，短时间的感染不能获得对靶细胞的足够感染力。这可能是因为经由柯萨奇-腺病毒受体(CAR)将载体颗粒掺入细胞需要长时间的接触。在肾脏的体内给药中，给药期间长期阻断血流将由于局部缺血损伤而导致组织破坏。因此，不主张对血流长期阻断。相反，副粘病毒表现出通过短时间暴露就足以高水平感染细胞，并因此在临床基因转移中具有极大优势。由于副粘病毒载体的这些优势，本发明的副粘病毒载体可以是各种临床疾病的基因治疗中极为有效的载体。
具体地，本发明涉及用于将基因转移至肾细胞的副粘病毒载体，利用该载体进行基因转移的方法，更具体地，本发明涉及(1)一种将基因引入肾细胞的方法，其中该方法包括将副粘病毒载体与肾细胞接触。
(2)根据(1)的方法，其中该方法还包括给药副粘病毒载体至血管。
(3)根据(2)的方法，其中血管为肾动脉。
(4)根据(1)的方法，其中该方法还包括给药副粘病毒载体至尿道。
(5)根据(1)到(4)任意一项的方法，其中肾细胞选自间质细胞，肾小球细胞和肾小管细胞。
(6)根据(1)到(5)任意一项的方法，其中副粘病毒为仙台病毒。
(7)一种将基因转移至肾细胞的副粘病毒载体。
(8)一种将基因转移至肾细胞的组合物，其中该组合物包含副粘病毒载体或含有该载体的细胞。
(9)根据(8)的组合物，其中给药该组合物至血管。
(10)根据(9)的组合物，其中血管为肾动脉。
(11)根据(8)的组合物，其中给药该组合物至尿道。
(12)根据(8)至(11)任意一项的组合物，其中肾细胞选自间质细胞，肾小球细胞和肾小管细胞。
(13)根据(8)至(12)任意一项的组合物，其中副粘病毒为仙台病毒。
本文中，“副粘病毒载体”是指衍生自副粘病毒并可用于将基因转移至宿主细胞的一种载体。本发明的副粘病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染性的病毒颗粒。此处，“感染性”是指重组副粘病毒载体，借助其细胞粘附和膜融合能力，将包含在该载体中的基因转移至该载体所粘附的细胞。在一个优选实施方案中，本发明的副粘病毒载体携带能表达的外源基因。所述副粘病毒载体可以具有复制能力，或者可以是不具有复制能力的缺陷载体。本文中，“复制能力”是指病毒载体在感染了该载体的宿主细胞中，复制并产生感染性病毒颗粒的能力。
术语“重组”产物是指由重组多核苷酸产生的化合物或组合物。重组多核苷酸是指这样一种多核苷酸，其中的核酸不是以非天然方式相连。本文中，“重组”副粘病毒载体是指通过基因工程构建的副粘病毒载体或它的扩增产物。例如，重组副粘病毒载体可以通过重组副粘病毒cDNA的重建来制备。
本文中，副粘病毒是指属于副粘病毒科的病毒或其衍生物。本发明所用副粘病毒包括，例如，属于副粘病毒科的病毒，如仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，以及人类副流感病毒的I，II，和III型。本发明的病毒优选是副粘病毒属的病毒或其衍生物。本发明可用的副粘病毒包括，例如，I型人类副流感病毒(HPIV-1)，III型人类副流感病毒(HPIV-3)，III型牛副流感病毒(BPIV-3)，仙台病毒(也称为“I型小鼠副流感病毒”)，和X型猴副流感病毒(SPIV-10)。最优选，本发明的副粘病毒可以是仙台病毒。这些病毒可以是天然产生的，野生型，突变体，实验室传代株，人工构建株等。不完整的病毒如DI颗粒(Willenbrink W.and Neubert W.J.，J.Virol.，1994，68，8413-8417)，合成的寡核苷酸等等也可以当作制备本发明病毒载体的材料来利用。
编码副粘病毒蛋白的基因包括NP、P、M、F、HN和L基因。此处的“NP、P、M、F、HN和L基因”分别指编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶和大分子蛋白的基因。副粘病毒亚科的每种病毒的基因通常表示如下。NP基因通常也描述为“N基因”。
副粘病毒属(Paramyxovirus)NP P/C/V M F HN-L风疹病毒属(Rublavirus) NP P/V M F HN(SH)L麻疹(Morbillivirus)属NP P/C/V M F H-L
例如，核苷酸序列数据库中，归类为副粘病毒科呼吸道病毒属的仙台病毒，其NP基因的录入号是M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218；P基因的是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008；M基因的是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056；F基因的是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131；HN基因的是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131；L基因的是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。
本文中，术语“基因”是指遗传物质，包括核酸，如RNA和DNA。基因可以编码或不编码蛋白。例如，基因可以编码功能性RNA(例如核酶)或反义RNA。基因可以是天然序列或人工设计的序列。此外，本文中，术语“DNA”包括单链DNA和双链DNA。
术语“肾细胞”是指正常哺乳动物肾脏中的细胞和浸润至患病肾脏中的细胞。所述浸润至肾脏的细胞包括例如单核细胞，巨噬细胞和白细胞。
具体的，哺乳动物肾脏包含至少15种类型的细胞，包括下列肾小球细胞；肾小球膜细胞；间质细胞；肾小管细胞；足细胞；和内皮细胞。
还包括肾小球基底膜(GBM)和上皮细胞。在本发明中，这些细胞都包括在肾细胞内。
肾动脉是指肾脏内部以及通向肾脏的动脉，包括从腹主动脉分支的肾动脉和下游小叶间动脉，右肾动脉，左肾动脉；肾门附近分支的动脉；5种分节的动脉和下游弓状动脉。肾静脉是指肾脏内部以及通向肾脏的静脉，包括右肾静脉，左肾静脉，小叶间静脉，星状静脉，弓状静脉，和叶间静脉。
本发明提供了副粘病毒载体在将基因转移至肾细胞中的用途。本发明人发现，副粘病毒能以高效力将基因引入肾细胞。本发明人获得的实验结果表明，在肾脏中的广泛区域内观察到转基因的表达。特别是，从肾动脉注射进入肾脏的基因被证实优先转移至间质细胞和肾小球细胞。这些细胞是肾脏疾病中重要的靶细胞，因此本发明的载体适用于肾脏疾病的基因治疗。
此外，本发明人揭示，用重组副粘病毒转移至肾细胞中的基因可持续表达至少1个月。这表明，用重组副粘病毒载体进行靶向肾细胞的基因治疗可以获得持续的治疗效应。
从安全性考虑，副粘病毒载体也优选用于人类基因治疗的临床试验中。首先，高效基因转移中主要的障碍是，导入的DNA必需转运至核内以便外源基因的表达。但在仙台病毒等情况中，外源基因的表达由细胞质中的细胞微管蛋白及其RNA聚合酶(L蛋白)驱动。这提示，仙台病毒不与宿主细胞基因组相互作用，这就避免了诸如致瘤等危险。其次，已知仙台病毒能在啮齿动物而非人类中引起肺炎，证据之一是，鼻内给药野生型仙台病毒不会伤害非人灵长类(Hurwitz J.L.等，Vaccine，1997，15，533-540)。这些特征提示，仙台病毒载体可以应用于人类治疗中，它还提示，仙台病毒有望成为肾细胞基因治疗中的替代工具之一。
因此，本发明发现副粘病毒载体在将基因转移至肾细胞中有多种优势，这一发现有可能给基因治疗带来极大的改进，尤其是靶向肾细胞的基因治疗。
本发明用于将基因转移至肾细胞中的重组副粘病毒载体不限于任何特定的种类。例如，适当的副粘病毒载体包括能复制和自我繁殖的载体。通常，野生型副粘病毒的基因组包含短的3’前导区，后随6个基因，分别编码N(核衣壳)，P(磷)，M(基质)，F(融合)，HN(血凝素-神经氨酸酶)，和L(大)蛋白，另一端有一段短的5’尾部区域。本发明的能自我复制的载体可通过设计具有与上述类似的结构的基因组而获得。此外，表达外源基因的载体可通过将外源基因插入上述载体的基因组而获得。本发明的副粘病毒载体与野生型病毒相比，病毒基因的排列发生了改变。
本发明的副粘病毒可能缺失了野生型病毒中含有的某些基因。例如，重建仙台病毒载体时，一般认为需要反式的由NP，P/C，和L基因编码的蛋白，但这些基因可以不是病毒载体的成分。在一个实施方案中，携带编码所述蛋白的基因的表达载体可以与另一种编码该载体基因组的表达载体共转染至宿主细胞中，以便重建病毒载体。或者，编码所述病毒基因组的表达载体可以转染至携带有编码所述蛋白的基因的宿主细胞中，从而用宿主细胞所提供的上述蛋白重建病毒载体。这些蛋白的氨基酸序列可以与来自起始病毒的序列不同，只要它们在核酸转移方面等效或活性更强，并且可以突变或者被另一种病毒的同源基因取代。
一般认为，由M，F，和HN基因编码的蛋白是副粘病毒载体的细胞-至-细胞繁殖所必需的。但是，当载体为RNP形式时，不需要这些蛋白。如果M，F，和HN基因是包含在RNP中的基因组的成分，当引入宿主细胞时，可以产生这些基因的产物，并产生具有感染力的病毒颗粒。产生感染性病毒的RNP载体包括，编码N，P，M，F，HN，和L基因的病毒基因组RNA以及含有N，P，和L蛋白的RNP。将这种RNP引入细胞后，利用这些蛋白的功能可表达并复制病毒基因组，以及扩增出感染性病毒载体。
可将RNP与转染试剂如脂转染胺(lipofectamine)和聚阳离子脂质体一起作为复合体而引入细胞中。具体地，可使用各种转染试剂，例如，DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Boehringer#1811169)。可加入氯喹以阻止在核内体中的降解(Calos M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。如果是复制型病毒，所得病毒可以通过再感染培养细胞、鸡卵、或动物(如哺乳动物，例如，小鼠)而扩增或传代。
缺乏M，F，和/或HN基因的载体也可以用作本发明的副粘病毒载体。这些载体可以通过外源提供所缺失的基因产物而重建。这种载体仍然可以象野生型一样附着至宿主细胞并诱导细胞融合。但是子代病毒颗粒不具有与起始病毒相同的感染力，因为引入细胞的载体基因组缺乏上述一种基因。因此，这些载体可用作仅能进行一次基因转移的安全的病毒载体。例如，基因组缺失的基因可以是F和/或HN基因。病毒载体可以如下重建将编码缺乏F基因的重组副粘病毒基因组的表达质粒，编码F蛋白的表达载体，以及编码NP，P/C，和L蛋白的表达载体共转染至宿主细胞中(WO00/70055和WO00/70070)。或者，可以使用已经在区染色体中整合了F基因的宿主细胞。这些外源提供的蛋白的氨基酸序列可以与野生型的不同，可以是发生了突变，或者被另一种病毒的同源蛋白取代，只要它们提供等效或更强的基因转移活性。
本发明副粘病毒载体的包膜蛋白除了包含载体的原始基因组的包膜蛋白以外，还可以包含另一种蛋白。对这种蛋白没有限制。这样的蛋白包括其它病毒的包膜蛋白，如水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。因此，本发明的副粘病毒载体包括带有源自不同来源病毒的包膜蛋白的假型病毒载体。
本发明的副粘病毒载体还可在病毒包膜表面包含能粘附特定细胞的蛋白，如粘附因子，配体和受体，或者嵌合蛋白(其在病毒的外表面包含上述蛋白，在病毒的内侧包含病毒包膜衍生的多肽)。这样就能产生靶向特定组织的载体。这些蛋白可以由病毒基因组自身编码，或者在重建病毒时由病毒基因组以外的基因(例如，源自另一种表达载体或宿主细胞染色体的基因)的表达来提供。
可以改变本发明载体中所含的病毒基因，例如，降低抗原性或增强RNA转录效力或复制效力。特别是，可以改变NP，P/C，和L基因(它们是复制因子的基因)中的至少一种，以增强转录或复制。也可以改变HN蛋白(它是具有血凝素活性和神经氨酸酶活性的结构蛋白)，从而通过减弱前一种活性而增加病毒在血液中的稳定性，并通过改变后一种活性而调节感染力。也可以改变F蛋白(它参与膜融合)以便调节膜融合脂质体的融合能力。此外，可以分析细胞编码可能的抗原分子如F蛋白和HN蛋白的抗原呈递表位，利用它们改造副粘病毒，产生抗原提呈能力已减弱的病毒。
用仙台病毒作为本发明的疫苗时，它可能缺乏辅助基因。例如，V基因(仙台病毒的辅助基因之一)的破坏，可以在不影响培养细胞中的基因表达和复制的情况下，使仙台病毒针对诸如小鼠等宿主的致病性减弱(Kato，A.等1997.J.Virol.717266-7272；Kato，A.等1997.EMBO J.16578-587；Curran，J.等，WO01/04272，EP1067179)。这种减毒载体尤其适于用作组建本发明疫苗的载体。
本发明的病毒载体可在其基因组RNA中编码外源基因。含有外源基因的重组副粘病毒载体可通过将外源基因插入上述副粘病毒载体基因组中来制备。外源基因可以是需要在靶肾细胞中表达的基因。外源基因可编码天然蛋白，或通过缺失、取代或插入而修饰最初的蛋白，从而产生修饰的蛋白，只要该修饰的蛋白与天然蛋白有等效的功能。这样的基因还可以编码源自天然蛋白的缺失蛋白，或人工设计的蛋白。例如，为了进行基因治疗等目的，可以将用于治疗目标疾病的基因插入编码所述病毒载体基因组的DNA中。在将外源基因插入仙台病毒载体DNA的例子中，优选在转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间插入包含6的倍数的核苷酸的序列(Calain P.and Roux L.，J.Virol.，1993，67(8)，4822-4830)。可将外源基因插入每种病毒基因(NP，P，M，F，HN，和L基因)的上游和/或下游。为了不干扰上游和下游基因的表达，可在外源基因的上游或下游适当安置E-I-S序列(转录终止序列-间插序列-转录起始序列)或其一部分，使E-I-S序列位于每一基因之间。或者，可借助IRES序列来插入外源基因。
所插入的外源基因的表达水平可通过连接在所述基因上游的转录起始序列的类型来调节。也可通过插入点的位置和所述基因周边的序列来调节。例如，在仙台病毒中，插入点越靠近病毒基因组负链RNA的3’-末端(野生型病毒基因组的基因排列中较靠近NP基因)，插入基因的表达水平越高。为了获得外源基因的高水平表达，优选将其插入负链基因组的上游区，如NP基因的上游(负链上的3’侧翼序列)，或NP与P基因之间。相反，插入点越靠近负链RNA的5’-末端(野生型病毒基因组的基因排列中较靠近L基因)，插入基因的表达水平越低。为了降低外源基因的表达，可将其插入负链上的5’最末端位置，野生型病毒基因组的L基因下游(负链上L基因的5’侧翼区)或L基因的上游(负链上L基因的3’侧翼区)。这样一来，可以适当调整外源基因的插入位置，以便获得所需的基因表达水平，或者使插入子与其周边的病毒基因的组合最佳化。例如，如果用高滴度病毒载体引入的基因过度表达可能引起毒性效应，则不仅有可能控制病毒滴度，还有可能通过将插入位置设计成靠近负链的5’-末端而降低单个仙台病毒载体的表达水平，或者通过将转录起始序列用具有较低效力者取代而获得相应效应。
一般情况下，抗原蛋白的高水平表达有利于免疫，只要该蛋白不具有细胞毒活性。因此，优选将编码抗原蛋白的基因与具有高转录效力的转录起始序列相连，并将其插到负链基因组的3’末端附近。适当载体的例子是那些将外源基因置于副粘病毒载体负链基因组中所有副粘病毒蛋白的下游的载体。例如，优选的载体具有位于N基因上游(负链的3’侧)的外源基因。或者可将外源基因插到紧靠N基因的下游。
为了有助于轻易插入外源基因，可以在插入位置设计克隆位点。例如，克隆位点可以是限制酶的识别序列。病毒载体DNA中的限制性位点可以用于插入外源基因。所述克隆位点可以是包含多个限制酶的识别序列的多克隆位点。本发明的载体可以在用于上述插入的位置以外的其它位置具有其它外源基因。
可以，例如按照Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.，1997，782813-2820，Kato A.等，EMBO J.，1997，16578-587，和Yu D.等，Genes Cells，1997，2457-466所述方法，如下构建带有外源基因的重组仙台病毒载体。
首先，制备包含所需外源基因的cDNA序列的DNA样品。优选所述样品的浓度至少为25ng/μl，而且它可以通过电泳确认为单个质粒。以下描述是举例说明外源基因可插入病毒基因组DNA的NotI位点。如果所述cDNA序列包含NotI位点，优选事先通过用已知方法，如定点诱变法改变核苷酸序列而除去该位点，但维持所编码的氨基酸序列。从所述DNA样品通过PCR扩增所需DNA片段。为了获得两个末端都带有NotI位点的片段，并在其中一个末端添加单个拷贝的仙台病毒转录终止序列(E)，间插序列(I)，和转录起始序列(S)(EIS序列)，制备了合成的DNA序列(引物对)，即，含有所需基因的一部分的正向引物(有义链)，以及包含NotI识别位点，E、I和S序列，以及所需基因的一部分的反向引物(反义链)。
例如，正向合成性DNA序列在5’-末端包含两个或更多个核苷酸，以确保用NotI消化(优选4个核苷酸，其不包含来自NotI识别位点如GCG和GCC的序列；更优选ACTT)。在该序列的3’-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3’-末端还添加任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔区。还在3’-末端添加一段约25个核苷酸的序列，它对应于从起始密码子ATG开始的所需cDNA的ORF。优选地，这种包含约25个核苷酸的所需cDNA的正向合成性寡DNA所选的3’-末端应使得最后一个核苷酸为G或C。
反向合成性DNA序列在5’-末端包含两个或更多个核苷酸(优选4个核苷酸，其不包含来自NotI识别位点如GCG和GCC的序列；更优选ACTT)。在该序列的3’-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3’-末端还添加间隔臂寡DNA以便调整引物的长度。寡DNA的长度被设计为6的倍数个核苷酸，包括NotI识别序列GCGGCCGC、该cDNA的互补序列、如下所述源自仙台病毒基因组的EIS序列(所谓“6的法则”；Kolakofski D.等，J.Virol.，1998，72，891-899；Calain P.and Roux L.，J.Virol.，1993，67，4822-4830)。此外，在所添加的序列的3’-末端，进一步添加仙台病毒S序列的互补序列，优选5’-CTTTCACCCT-3’(SEQ ID NO1)，对I序列而言，优选5’-AAG-3’，对E序列而言，优选5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ IDNO2)。最后在该3’-末端添加一段序列，使得所需cDNA的互补序列的最后一个核苷酸为G或C，其中这最后一个核苷酸位于终止密码子上游约25个核苷酸处。如此制备出反向合成的寡DNA的3’-末端。
可以利用ExTaq聚合酶(TaKaRa)通过常规方法进行PCR。优选使用Vent聚合酶(NEB)，扩增的片段用NotI消化，然后插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用自动DNA测序仪检测所得PCR产物的核苷酸序列，选出具有正确序列的质粒。通过NotI消化而将插入片段从该质粒上切下来，亚克隆至包含副粘病毒基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，不利用pBluescript载体也可直接将PCR产物克隆至NotI位点，从而获得重组副粘病毒cDNA。
例如，可按照Yu，D.等，Genes Cells，1997，2，457-466或Hasan M.K.等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820等所述方法构建重组仙台病毒基因组cDNA。例如，将包含NotI位点的18bp间隔臂序列(5’-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’；SEQ ID NO3)插入克隆化仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与N蛋白编码序列的5’-端之间的邻接基因座，获得含有源自丁型肝炎病毒反基因组链的自我切割性核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan M.K.等，J.General Virol.，1997，78，2813-2820)。将外源基因片段插入pSeV18+b(+)的NotI位点，获得插入了所需外源基因的重组仙台病毒cDNA。
将编码病毒基因组的DNA与适当的转录启动子连接，构建出载体DNA。将所得质粒体外或在细胞中转录，在有副粘病毒L，P和NP蛋白的情况下重建RNP，从而产生包含该RNP的病毒载体。本发明提供了产生能将基因引入肾细胞的副粘病毒载体的方法，或者产生包含该载体的能将基因转移至肾细胞的组合物，其中所述方法包括对副粘病毒载体基因组DNA进行转录。本发明还提供了用于产生副粘病毒载体的所述病毒基因组编码DNA，其中所述DNA用作本发明副粘病毒载体或包含该载体并用于将基因转移至肾细胞的组合物的成分。本发明还涉及编码所述载体基因组的DNA的用途，用于制备本发明的副粘病毒载体或作为包含该载体并用于将基因转移至肾细胞的组合物的成分的副粘病毒载体。从病毒载体DNA重建病毒可按照已知方法进行(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P.等，Virol.，1997，235，323-332；Whelan S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，8388-8392；Schnell M.J.等，EMBO J.，1994，13，4195-4203；Radecke F.等，EMBO J.，1995，14，5773-5784；Lawson N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，4477-4481；Garcin D.等，EMBO J.，1995，14，6087-6094；Kato A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Baron M.D.和Barrett T.，J.Virol.，1997，71，1265-1271；Bridgen A.和Elliott R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，15400-15404)。这些方法能从DNA重建副粘病毒载体，包括副流感病毒，水疱性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和仙台病毒载体。F，HN，和/或M基因都已经从病毒载体DNA中缺失，因而无法形成感染性病毒颗粒。但有可能将这些缺失基因和/或编码包膜蛋白的基因从另一种病毒引入宿主细胞中并进行表达，从而产生感染性病毒颗粒。
将载体DNA引入细胞的方法可包括(1)形成能掺入所需细胞的DNA沉淀，(2)制备包含带正电的DNA的复合体，它适于掺入所需细胞并且具有较低细胞毒活性，和(3)利用电脉冲在所需细胞胞浆膜上打开一个暂时性小孔，其大小足以使DNA通过。
步骤(2)中可以使用各种转染试剂，如DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，和DOSPER(Boehringer #1811169)。步骤(1)中，可使用磷酸钙进行转染。在这种方法中，DNA以吞噬泡的形式被细胞摄入，但已知足量的DNA也能被摄入细胞核中(Graham F.L.和vanDer Eb J.，Virol.，1973，52，456；Wigler M.和Silverstein S.，Cell，1977，11，223)。Chen和Okayama研究了转移技术的最佳条件，他们报道说(1)在35℃的2-4％CO2中将细胞和沉淀物温育15-24hr可获得最大效力，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，和(3)当混合溶液中DNA浓度为20-30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen C.和Okayama H.，Mol.Cell.Biol.，1987，7，2745)。上述(2)的方法适于瞬时转染。有一种更经典的转染方法，其中DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885 M.W.5×105)与DNA以所需浓度比混合。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。上述(3)的方法称为电穿孔，它比方法(1)和方法(2)应用更广，因为它可以用于任何类型的细胞。可通过最优化脉冲电流的持续时间、脉冲的形式、电场强度(电极间空隙，和电压)、缓冲液的导电性、DNA浓度和细胞密度，而使转染效力最大化。
在上述三种方法中，方法(2)适于将DNA引入细胞以重建载体，因为它便于实施并能用大量的细胞检测大量的样品。优选的转染试剂包括Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，#301305)和DOSPER LiposomalTransfection Reagent(Boehringer Mannheim #1811169)，但不限于此。
特别是，从cDNA进行重建可如下进行在24孔或6孔塑料板或100-mm petri平板中的极限必需培养基(MEM)中培养猴肾细胞系LLC-MK2至70-80％铺满，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)。在有1μg/ml补骨脂素存在的条件下，于UV中暴露20分钟来灭活表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3，然后以2pfu/细胞的量用该病毒感染上述细胞(Fuerst T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126；和Kato.A.等，GenesCells，1996，1，569-579)。补骨脂素的量和暴露于UV的时间长短可以最佳化。感染1小时后，对细胞进行转染，方法可以是用Superfect(QIAGEN)、2-60μg(更优选3-5μg)上述重组仙台病毒cDNA、以及表达病毒蛋白的质粒(24-0.5μg pGEM-N，12-0.25μg pGEM-P，和24-0.5μg pGEM-L，或更优选1μgpGEM-N，0.5μg pGEM-P，和1μg pGEM-L)(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)进行脂转染，所述表达病毒蛋白的质粒发挥反式作用并且是产生全长仙台病毒基因组所需的。在MEM中培养转染的细胞，所述MEM不含血清，但在需要时含有100μg/ml利福平(Sigma)和优选浓度为40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞毒活性最小而回收的病毒最多(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)。转染后将细胞培养48-72hr，然后收集并通过三轮冻融而裂解。用细胞裂解物转染LLC-MK2细胞，经过3天-7天的培养，收集培养基。为了重建缺乏编码包膜蛋白的基因并且不能复制的病毒载体，可用该载体转染能表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞，或与该包膜蛋白的表达质粒一起转染。另一种方法是，将转染的细胞覆盖在表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞的上层并进行培养，使缺陷型病毒载体繁殖(WO0/70055和WO0/70070)。或者，用上述经冻融制备的细胞裂解物接种10日龄鸡胚的尿囊膜，约3日后收获尿囊液。培养基或尿囊液中病毒的滴度可通过测定血凝素活性(HA)来确定。HA可通过“内-点稀释法”来测定(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Yonemitsu Y.和Kaneda Y.，Hemagglutinatingvirus of Japan-liposome-mediated gene delivery-vascular cells.，MolecularBiology of Vascular Diseases.Methods in Molecular Medicine，Ed.by Baker A.H.，Humana Press，1999，295-306)。为了评估痘苗病毒vTF7-3的可能的污染，将所得尿囊液样品进行适当稀释(例如稀释106倍)并在鸡胚中再扩增。可重复扩增三次或更多次。将所得病毒贮存于-80℃。
所收集的副粘病毒可以纯化，使其基本纯。纯化可以用已知的纯化/分离方法进行，如过滤，离心和柱纯化，或它们的组合。术语“基本纯”是指一种分离的物质(化合物，多肽，病毒等)，在含有它的样品中它占主要成分。通常，样品中基本纯的成分占该样品总量(包括其它成分)的50％或更多，优选70％或更多，更优选80％或更多，还更优选90％或更多。这种百分比可以通过本领域已知的方法，例如，重量比[w/w]来估计。计算该比例时，应排除溶剂、盐、添加的化合物等。特异于副粘病毒的纯化方法有，利用硫酸纤维素或交联的多糖硫酸酯进行的方法(特公昭62-30752号公报；特公昭62-33879号公报；特公昭62-30753号公报)，以及包括允许含岩藻糖硫酸的多糖和/或其降解产物吸附病毒的方法(WO97/32010)。
对宿主细胞的类型没有限制，只要所述病毒载体能在这些细胞中重建。宿主细胞包括LLC-MK2细胞，衍生自猴肾的CV-1细胞，培养的细胞系如衍生自仓鼠肾的BHK细胞，和来自人的细胞。此外，为了获得大量仙台病毒，可以用从上述宿主细胞获得的病毒载体感染受孕卵，从而扩增这些载体。用鸡卵产生病毒载体的方法是成熟的方法(Advanced protocols inneuroscience study III，Molecular physiology in neuroscience.，Ed.byNakanishi等，Kouseisha，Osaka，1993，153-172)。例如，具体可以是将受精卵在孵化器中37-38℃培养9-12天以形成胚。将病毒载体接种尿囊腔，进一步将该受精卵培养数日以便繁殖载体。可根据所用的重组仙台病毒类型的不同而改变诸如培养时间等条件。然后，收获含有病毒的尿囊液。用常规方法从尿囊液样品中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro M.，Protocols invirus experiments.，Nagai和Ishihama编辑，MEDICAL VIEW，1995，68-73)。
在制备缺损病毒载体时，将在其载体基因组中缺失了不同包膜基因的两种不同病毒载体转染至相同细胞中。在这种情况下，每种缺失的包膜蛋白通过另一载体的表达来提供，这种相互补充导致能产生具有复制和繁殖能力的感染性病毒颗粒。因此，可以将本发明的两种或更多种病毒载体同时混合接种，使它们相互补充，从而以较低的代价产生各种包膜缺陷型病毒载体的大量混合物。由于这些包膜基因缺陷的病毒具有较小的基因组，它们允许插入较长的外源基因。此外，这些本身没有感染能力的病毒在细胞外稀释后很难维持共感染状态，因此它们不会产生后代，对环境的损害也较小。
一旦用治疗疾病的基因作为外源基因制备了病毒载体，就可以给药该载体以实施基因治疗。当本发明的病毒载体用于基因治疗时，能确保所需治疗效果的外源基因，或在患者体内供应不足的外源基因，可以通过直接给药或间接(回体(ex vivo))给药的方法进行基因表达。对外源基因的类型没有限制，不仅包括编码蛋白的核酸，还包括不编码蛋白的核酸，例如反义核酸或核酶。
本发明的副粘病毒载体可以与所需的可药用载体一起配制成用于将基因转移至肾细胞的组合物。本文中，“可药用载体”是指能与载体一起给药但不显著抑制该载体的基因转移的物质。例如，本发明的副粘病毒载体可以用盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等适当稀释，制成组合物。如果本发明的副粘病毒载体是在鸡卵中繁殖，组合物可包含尿囊液。组合物还可以包含载体或介质如去离子水或5％的葡萄糖水溶液。还可以包含植物油，悬浮剂，去污剂，稳定剂，抗生素等。也可在组合物中添加保存剂和其它添加剂。
由所述副粘病毒载体携带的外源基因，可通过使肾细胞与如上所述获得的副粘病毒载体或含有该载体的组合物接触而转移至肾细胞中。本发明提供了这种副粘病毒载体将基因引入肾细胞的用途。对感染途径没有限制，可包括静脉注射全身给药或限于载体引入区的局部给药。肾脏局部给药可通过给药至肾脏的血管，尿道，肾盂，肾实质等来实现。特别是，优选的给药途径包括从肾动脉或静脉注射以及从尿道或肾盂注射给药以引起回流(Tomita，N.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.186129-134，1992；Isaka，Y.等，J.Clin.Invest.922597-2601；Arai，M.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.206525-532，1995；Heikkila，P.等，Gene Ther.321-27，1996；Rappaport，J.等，Kidney Int.471462-1469，1995；Oberbauer，R.等，Kidney Int.481226-1232，1995；Haller，H.等，Kidney Int.50473-480，1996；Lien，Y.等，Exp.Nephrol.5132-136；Moullier，P.等，Kidney Int.451220-1225，1994；Bosch，R.等，Exp.Nephrol.149-54，1993；Zhu，G等，Gene Ther.3298-304)。特别优选通过血管注射所述载体，因为这种注射可以以较高效力将基因转移至间质细胞和肾小球，但不会引起巨噬细胞浸润至这些细胞附近。
通过血管进行注射时，可将含有目的基因的载体通过导管(见美国专利5,328,470)或带有翼的输注装置(Terumo Medical Corporation)注入动脉。优选在注射期间用止血钳或类似装置阻断血流。例如，将导管插入左肾动脉，在该动脉的靠近腹主动脉处用止血钳阻断血流，灌注盐水，然后注入载体溶液，从而引入基因。这样就能将基因转移至左肾的细胞中。
这种方法包括以下步骤(a)阻断肾血管中的血流；(b)将本发明的副粘病毒载体注射到所述肾血管中；和(c)温育，以便使载体感染。需要阻断的血流可以是肾动脉中的血流。优选注射载体之时阻断该动脉，阻断静脉，然后实施温育。
具体地，可钳住紧邻肠系膜上动脉以下和肠系膜下动脉以上的主动脉，从而阻断进入肾脏的血流。如上所述，只有进入左肾或右肾的血流可以阻断。灌注了盐水后，可以用适当型号的针管从肾动脉直接注射本发明的载体。短时间温育使载体感染后，除去止血钳，恢复血流。
可以从颈总动脉和胸主动脉将导管插向靠近肾动脉之处，以注射载体(Tomita，N.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.186129-134，1992)。在这种情况下，通过钳住腹主动脉就可以在远离肾动脉之处阻断血流。灌注盐水后，通过所述导管注射载体溶液。可以用任何其它已知方法经由血管注射载体。
从尿道引入载体而导致向肾脏回流时，在尿道中插入注射器或导管，以便自此注射载体溶液。可以在注射期间用止血钳等阻断血管。这种方法包括以下步骤(a)阻断肾血管中的血流；(b)将本发明的副粘病毒载体引入尿道；和(c)温育，以便使载体感染。例如，可以将左肾静脉钳住，然后注射载体。一旦将导管插入尿道中，就可将载体溶液注入肾盂或其它区域附近或之中。
温育可以进行数分钟(约1-10分钟)以便载体感染。如果血流被阻断，优选使其在短时间内恢复，以确保足够的感染力。因为如此阻断超过10分钟可能对组织造成缺血性损伤。当延长对血流的阻断时，优选用冰或类似物冷却组织，以减小组织损伤的危险。
此外，所述病毒载体与生物相容性多元醇(如poloxamer407等)组合能将转移病毒载体的效力提高10-100倍(March等，Human Gene Therapy641-53，1995)。这能减少病毒载体的用量和感染所需的时间。在本发明中，副粘病毒载体可以与生物相容性多元醇形成组合物。其它生物相容性多元醇也可用于组合。此外，各种能使血压升高或降低的药物可以与所述载体联合给药。这些药物可以与所述载体同时给予或分别给予。
此外，可根据本发明的方法将基因回体转移至肾细胞(Kitamura，M.等，J.Clin.Invest.94497-505；Kitamura，M.等，Kidney Int.511274-1279，1997；Naito，T.等，Mol.Med.2297-312，1996；Koseki，C.等，Am.J.Physiol.261C550-C554，1994；Heikkila，P.等，Gene Ther.321-27，1996；Zeigler，S.等，Transplantation 61812-817，1996)。例如，移植时，可通过手术从供体取出肾脏，将本发明的载体引入该肾脏。或者，从该肾脏采集肾细胞，将基因引入这些细胞，然后将这些细胞注射至患者体内。这样的细胞包括，例如，肾小球膜细胞，巨噬细胞，以及肾小管上皮细胞。具体地，可通过活检从患者肾脏采集肾小球膜细胞，基因转移后使其返回患者肾脏。本发明的载体可用于将基因转移至这样的肾小球膜细胞中。或者，可通过将基因引入肾小管上皮细胞以及对这些细胞进行被膜下移植而实现间质的回体转染。
在利用本发明副粘病毒载体进行的基因转移中，作为转移标靶的肾细胞的类型不限。这样的肾细胞包括，例如，间质、肾小球、血管(包括动脉，静脉和毛细血管)及肾小管(包括远段肾小管和近段肾小管)的细胞。具体地，优选的靶细胞是间质成纤维细胞，肾小球膜细胞，血管内皮细胞，肾小管上皮细胞(TEC)，巨噬细胞等。这样的靶细胞还包括成人和胎儿的肾细胞(包括后肾、中肾和前肾的细胞)。也可以将基因引入肾原始(primordial)细胞如间充质细胞。
要利用本发明副粘病毒进行转移的基因的类型不限。这样的基因可编码天然蛋白或人工蛋白。天然蛋白包括，例如，激素，细胞因子，生长因子，受体，酶和肽。这样的蛋白可以是分泌蛋白，跨膜蛋白，胞浆蛋白，核蛋白，等。人工蛋白包括，例如融合蛋白(如嵌合毒素)，显性阴性蛋白(包括受体的可溶性分子以及膜结合型显性阴性受体)，缺陷型细胞粘附分子，和细胞表面分子。这样的蛋白还可包含分泌信号，膜定位信号，或核转位信号。需要引入的基因可以是肾细胞中原本不表达的基因。或者，可以引入肾细胞中正常表达的基因，以便过度表达。也可以通过引入反义RNA分子或切割RNA的核酶，而抑制肾细胞中表达的不想要的基因的功能。
本发明的载体可以应用于各种肾病的基因治疗。这种基因治疗可以补偿细胞中由于基因缺陷引起的表达缺陷，或者通过将外源基因引入细胞而赋予新功能，或者通过引入能抑制特定基因的活性的基因而抑制细胞中不想要的活性。本发明的载体还可用于将基因转移至非人的哺乳动物肾细胞中。例如，所述载体可用于建立各种疾病模型，并开发或评估疾病模型中或肾移植中的治疗性方法，等等。
本发明可应用于肾移植。可以在同种异体肾移植或异源肾移植中，用本发明的载体将外源基因引入移植体。例如，可以通过表达能抑制排斥的基因，而抑制移植后的急性排斥反应(可参见Zeigler，S.等，Transplantation 61812-817，1996)。或者，可以如上所述分离肾细胞，如巨噬细胞，肾小球膜细胞或内皮细胞，将外源基因引入这些细胞，然后将细胞转入肾脏中。通过移植来给药肾小球膜细胞，可以通过已知的肾小球膜细胞-载体系统来进行(Kitamura，M.等，J.Clin.Invest.94497-505，1994；Kitamura，M.Exp.Nephrol.5118-125，1997)。用这种方法可以将肾小球膜细胞陷在肾小球毛细血管中并表达外源基因。或者，可以使用巨噬细胞载体等(Kitamura，M.等，Kidney Int.511274-1279)。例如，可以将编码各种细胞因子、免疫抑制蛋白或抗纤维蛋白溶解性蛋白的基因引入发炎的肾小球中。
本发明可用于治疗肾脏癌症。可以将治疗癌症的基因经由动脉导管等物质引入癌性病灶。用于此类目的的基因包括编码细胞因子的那些以及编码抑制血管形成的蛋白的那些，如可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体。
本发明的载体还可用于引入编码一氧化氮合成酶(NOS)的基因或抑制细胞间粘附分子-1(ICAM-1)功能的基因来治疗急性肾小管坏死。还可以用本发明的载体实现其它目的，如防止血管成形术后的肾动脉狭窄，或治疗多囊性肾病。
本发明可以应用的其它疾病包括，由上呼吸道细菌感染等引起的急性肾小球肾炎(AGN)，快速进行性肾小球肾炎(RPGN)，慢性肾小球肾炎(CGN)(包括微小变化型，灶性肾小球硬化症，膜性肾病，肾小球膜增生性肾小球肾炎，膜增生性肾小球肾炎和硬化性肾小球肾炎)，由于糖尿病、肝炎和其它疾病继发感染肾小球引起的继发性肾小球疾病，以及肾病综合征。本发明还可用于治疗毛细血管内增生性肾病，半月体形成性肾炎和其它疾病。还可用本发明预防和治疗由人类免疫缺陷病毒(HIV)等引起的肾病。
此外，可以用本发明靶向肾细胞的载体治疗的疾病，以及用于这些治疗的候选基因的例子如下
转化生长因子β(TGF-β)是一种多功能细胞因子，它在组织更新、受损组织的恢复等等中起重要作用。特别是，TGF-β诱导细胞外基质(ECM)的累积并调节ECM受体如整联蛋白的表达。各种进行性肾病包括糖尿病肾病所共有的事件是，细胞外基质(ECM)在肾小球中累积。因此，ECM的累积可以通过抑制TGF-β的表达或功能而抑制。
例如，核心蛋白聚糖是一种小分子硫酸皮肤素蛋白聚糖，它是TGF-β的天然抑制因子。该基因(核心蛋白聚糖cDNA)的诱导导致ECM在肾小球中的累积减少(Isaka，Y.等，Nat.Med.2418-423，1996)。
此外，含有TGF-β受体胞外结构域的分子中和并且限制了TGF-β的功能。有两种类型的TGF-β，I型和II型。TGF-β结合II型受体，产生的复合体与I型受体相互作用。I型和II型受体片段都可用来抑制TGF-β，但优选使用直接与TGF-β相互作用的II型受体片段。通过表达失活的、信号传递功能已被破坏的TGF-β受体可以中和TGF-β。仅表达可溶性受体也可获得某种效应(Lin，H.Y.等，J.Biol.Chem.2702747-2754，1995)。但是，通过表达TGF-β受体胞外结构域与IgG-Fc的融合分子(如TGF-RII/Fc)可产生显著较强的效应(Isaka，Y.等，Kidney Int.55465-475，1999；Isaka，Y.等，J.Am.Soc.Nephrol.71735，1996)。ECM在肾小球中的积累可以通过在肾细胞中表达该分子而抑制。同样地，可以应用血小板衍生生长因子(PDGF)的胞外结构域与Fc的融合蛋白(Imai，R.和Y.Isaka，Nephron 83296-300，1999；Isaka等，Kidney Int.52Suppl.S100-S103，1997)。可以引入反义RNA分子或切割RNA的核酶，从而抑制这些基因的表达。相反，引入TGF-β基因可能对急性肾小球损伤等产生治疗效应。TGF-β基因也可以用于建立肾病模型。
Smad是一个传导TGF-β信号的信号分子家族。该家族基因的功能可以通过基因转移来调节。为了抑制TGF-β的作用，尤其优选引入抑制性Smad基因，该基因对TGF-β有抑制性调节作用。这样的分子包括Smad6和Smad7。
肝细胞生长因子(HGF)为间充质细胞中产生的生长因子，它调节包括肝脏和肾脏在内的器官中内皮细胞和上皮细胞的增殖。HGF还可诱导形态发生，从而形成分支的肾小球。此外，HGF可预防由于缺血或药物所致组织损伤而导致的急性肾衰(Kawaida，K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914357-61，1994)。已经有人用小鼠肾病模型进行HGF治疗(Mizuno，S.等，J.Clin.Invest.1011827-34，1998)。因此，HGF基因作为一种转基因在以肾细胞为目标的基因治疗中十分重要(Imai，R.和Y.Isaka，Nephron 83296-300，1999)。HGF还可用于预防与肾病相关的进行性纤维化。
15-脂肪氧化酶(15-LO)是催化能拮抗白三烯之炎症作用的15-S-hydroxyeicosatetraenoic acid和lipoxin A4合成的酶。据报道，在肾小球肾病模型中引入15-LO基因可产生治疗效应(Yura，T.等，J.Am.Soc.Nephrol.6890，1995；Imai，E.等，Exp.Nephrol.5112-117，1995；Munger，K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9613375-13380，1999)；因此，该基因也可用于治疗目的。
特别可用于靶向肾细胞的基因转移(如，基因治疗)的外源基因包括编码下列的基因(1)细胞周期抑制剂(如p53，p21，p16和p27)，(2)细胞增殖信号的抑制剂(如突变的H-Ras)，(3)分泌型细胞增殖抑制剂(如eNOS和CNP(C型利尿钠肽))，(4)血管平滑肌松弛因子(如eNOS和CNP)，(5)血管平滑肌松弛离子通道(如Kir 6.2钾离子通道的C-末端缺失突变)，(6)溶血栓蛋白(如组织纤溶酶原激活剂和尿激酶)，(7)组织因子通路抑制剂(TFPI)，(8)血管形成因子(如VEGF，FGF，和HGF)，以及(9)超氧化物歧化酶(SOD)(如包括Cu/Zn型SOD，Mn型SOD，和EC-SOD)本发明载体的优点之一是能将基因高效转移至肾间质细胞中。这一优点使得对各种肾病进行基因治疗成为可能。所有人类进行性肾病最终都导致肾小管间质纤维化。间质的持续炎症或复发性损伤逐渐损害肾脏组织，常导致严重的肾功能障碍(Schainuck，L.I.等，Hum.Pathol.1631-641，1970；Bohle，A.等，Virchows Arch.376211-232；Bohle，A.等，Virchows Arch.37315-22，1977；Mackensen，S.等，Nephron 2430-34，1979)。间质纤维化有时可以由肾小球或血管损伤而继发。肾病发展至肾衰的过程中的详细机制目前不明。有报道说，是肾小管间质损伤而非肾小球损伤的程度与肾功能障碍和长期预后的程度有关(Risdon，R.A.等，Lancet 2363-366，1968；Schainuck，L.等，Hum.Pathol.1631-641，1970)。
可以假定导致间质纤维化的过程归因于细胞成分和细胞外基质的正常调节性代谢转换的异常延长。间质成纤维细胞获得所谓“肌成纤维细胞”的复合表型，并增殖，以便向有活动性炎症的滞留区浸润(Alpers，C.等，J.Am.Soc.Nephrol.5201-210，1994)。然后，这些细胞胞外基质的合成并促进局部纤维化。相应地，靶向间质成纤维细胞的基因转移技术允许对间质中特定分子的体内效应进行评估。此外，该项技术对于开发治疗间质纤维化的方法也十分重要。
可以通过将含有副粘病毒载体的组合物直接或间接地体内给药至肾脏，在肾细胞中表达外源基因，以此来实现基因治疗。另一种方法是，通过回体(ex-vivo)给药来进行这种治疗。体内基因转移可通过局部给药来实现，如从肾动脉或肾静脉注射所述载体，直接向肾脏内注射，从尿道回流，和从肾盂回流。此外，间接向肾细胞给药可通过全身性给药或给药至其它器官来实现。回体基因转移可通过将载体给药至手术取出的肾脏来实现，方式有，注射进肾动脉或肾静脉，直接注射进肾脏，从尿道回流，和从肾盂回流。或者，可以通过从器官等制备肾细胞，将该细胞与本发明的载体一起保温，而引入所述基因。引入了所述基因的肾细胞可以送回肾脏。
为了进行治疗和预防，用于将基因转移至肾细胞的副粘病毒可以以确保向肾细胞引入有效量所述载体的足够量来给药。术语“有效量”是指能确保通过本发明方法将基因引入肾细胞，至少部分产生所需治疗或预防效应的量。将含有所需基因的本发明副粘病毒载体以有效量给药，导致在引入了该载体的细胞中产生转基因产物。这包括改变所述细胞和/或周围肾细胞的表型(具体地，诱导或抑制转基因和其它基因的表达，形态学改变，生物化学改变，等)。优选地，将含有所需基因的本发明副粘病毒载体以有效量给药至肾脏，导致将基因引入肾脏中显著数量的细胞中，并诱导所述细胞的表型改变。属于“显著数量的细胞”是指通过本发明载体将基因引入给药部位的至少约0.1％，优选约1％或更多，更优选约5％或更多，还要优选约10％或更多，最优选约20％或更多的目标肾细胞中。目标肾细胞包括，例如，间质细胞，肾小球细胞，肾小管细胞，肾小球膜细胞，上皮细胞，和内皮细胞。
基因是否成功转移至细胞中可通过本领域技术人员已知的试验来证实。例如，可通过Northern杂交，逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，或RNA保护试验来检测并定量基因的转录。通过Northern杂交，RT-PCR等进行的检测可以原位进行。对翻译产物的检测可如下进行应用抗体进行Western印迹，免疫沉淀，RIA，酶联免疫吸附试验(ELISA)，pull-down试验等。为了便于检测基因转移的成功，可以使将要表达的蛋白带上标签，或者可以插入报告基因以确保它的表达。报告基因包括，但不限于，编码β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白(GFP)的基因。
载体的用量可以根据疾病，体重，年龄，性别，症状，给药目的，转基因，将要给药的组合物的剂型，给药方法等而改变，可以由本领域技术人员作出适当决定。优选载体用量在约105pfu/ml-1011pfu/ml的范围内，更优选约107pfu/ml-109pfu/ml，最优选约1×108pfu/ml-5×108pfu/ml，含有可药用载体。
本发明包含病毒载体的组合物可以给予包括所有哺乳动物在内的受试者，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和狗。
图1的照片显示了荧光立体显微镜的观察结果大鼠肾脏从肾动脉给药SeV/GFP后第4天，经手术切除的额切面(frontal)。在皮质和髓质的较大范围内观察到强荧光信号。
图2的照片显示了荧光立体显微镜的观察结果大鼠肾脏从尿道给药SeV/GFP后第4天，经手术切除的额切面。在皮质和髓质的较大范围内观察到强荧光信号。
图3是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第4天获得的。阳性信号散布于间质成纤维细胞中。该组织的每一部分在下图中指明。
图4是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从尿道给药SeV/GFP后第4天获得的。阳性信号散布于间质成纤维细胞中。该组织的每一部分在下图中指明。
图5是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第4天获得的。在肾小球中也观察到GFP抗体-阳性染色；约20％的肾小球被所述载体感染。肾小球部分在下图中示出。浸润细胞以阴影表示。
图6是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从尿道给药SeV/GFP后第4天获得的。在肾小管上皮细胞中检测到阳性信号。此外，发现有巨噬细胞浸润。该组织的每一部分以及细胞在下图中指明。浸润细胞以阴影表示。
图7是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第7天获得的。在肾小球中观察到GFP抗体-阳性染色。
图8是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第7天获得的。在间质细胞和肾小球中观察到GFP抗体-阳性染色。
图9是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第7天获得的。可观察到GFP抗体-阳性染色。
图10是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第14天获得的。
图11是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第14天获得的。
图12是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第14天获得的。
图13是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第14天获得的。
图14是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第28天获得的。
图15是用抗GFP抗体染色的肾组织切片的照片。该切片是从肾动脉给药SeV/GFP后第28天获得的。
实施本发明的最佳方式本发明参照实施例详细描述，但它不限于此。本文引用的所有参考文献和公开出版物(包括参考文献，专利和已出版的专利申请)都是全文引入以作参考。
构建并制备用于肾脏给药的含有GFP基因的重组仙台病毒载体(GFP/SeV)包含GFP基因的重组仙台病毒载体(GFP/SeV)根据Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587和Yu，D.等，1997，Genes细胞2457-466所述来构建，具体是首先，制备含有GFP基因的cDNA核苷酸序列(结构基因长度＝717bp)的DNA样品。纯化该DNA样品，直至在电泳中可观察到所述质粒是位于25ng/μl或更高浓度处的单一电泳带。为了从该样品中扩增并收集所需基因片段，制备含有合成的正向DNA序列和反向DNA序列(反义链)的引物对；这些引物包含NotI限制性位点序列；下述转录终止序列(E)，间插序列(I)，和转录起始序列(S)；以及GFP基因序列的一部分。
正向DNA合成序列在其5’-末端包含ACTT，其3′-侧是NotI识别位点“GCGGCCGC”，再向3’-侧是间隔臂序列。接着是对应于所需cDNA的ORF中从起始密码子ATG开始的前25个核苷酸的序列。
反向DNA合成序列在其5’-末端包含ACTT，其3′-侧是NotI识别序列“GCGGCCGC”，再向3’-侧是用于调整引物长度的间隔臂寡聚DNA。寡聚DNA的长度被设计成6个核苷酸的倍数，其包含NotI识别序列GCGGCCGC，与所述cDNA互补的序列，和源自仙台病毒基因组的EIS序列，如下所述(所谓“6的法则”；Kolakofski D.等，J.Virol.，1998，72，891-899；Calain P.和Roux L.，J.Virol.，1993，67，4822-4830)。此外，在所加序列的3’-侧，添加与仙台病毒S序列互补的序列(5’-CTTTCACCCT-3’(SEQ ID NO1))、与仙台病毒I序列互补的序列(5’-AAG-3’)以及与仙台病毒E序列互补的序列(5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO2))。最后，在3’-侧添加与所需cDNA的终止密码子上游25个核苷酸互补的序列，将其作为所述反向合成性寡聚DNA的3’-末端。
用Vent聚合酶(NEB)进行PCR。所得扩增片段用NotI消化，插入质粒载体pBluescript的NotI位点。所得PCR产物的核苷酸序列通过自动DNA测序仪证实，选出具有正确序列的质粒。
根据Kato A.等，EMBO J.，1997，16，578-598和Hasan M.K.等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820所述方法构建重组仙台病毒基因组cDNA。将含有NotI位点的18bp间隔臂序列(5’-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’；SEQ ID NO3)插入已克隆的仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与N蛋白编码序列的5’-末端之间的位置，得到含有源自丁型肝炎病毒反基因组链的可自我切割型核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan M.K.等，J.General Virol.，1997，78，2813-2820)。上述编码GFP的DNA用NotI消化，插入仙台病毒基因组的cDNA质粒pSeV18+b(+)中的NotI位点，得到含有GFP基因的重组仙台病毒cDNA。
将如上所述制备的重组仙台病毒cDNA在体外或在细胞中转录，以便重建该病毒，获得重组病毒载体，具体如下。
在6孔塑料板上，将猴肾细胞系LLCMK2在含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)的极限必需培养基中培养至70-80％汇合(1×106细胞)。表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3通过UV辐射灭活(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986，Kato，A.等，Genes Cells 1569-579，1996)，用所述病毒以2PFU/细胞的水平感染细胞。1小时后，利用Superfect(QIAGEN)通过脂质转染方法将3-5μg重组仙台病毒cDNA与表达产生全长仙台病毒基因组所必需的病毒反式作用蛋白的质粒(1μg pGEM-N，0.5μg pGEM-P，和1μg pGEM-L)共转染(Kato，A.等，Genes Cells 1569-579，1996)。将转染细胞在仅添加了100μg/ml利福平(Sigma)和40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)的无血清MEM培养基中进行培养。确定这些试剂的最佳浓度，以便使痘苗病毒的细胞毒作用最小而病毒的产量最大(Kato，A.等，1996，Genes细胞1569-579)。转染的48小时后，收获细胞，通过三个冻融循环破碎细胞，然后接种至10日龄受孕卵的尿囊膜。3日后，收获尿囊液，通过测定凝血活性(HA)而确定病毒滴度。HA通过“内点稀释法”而测定(Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，“Hemagglutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery-vascular cell”，Baker A.H.(ed.)，Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine，Humana Press，pp.295-306，1999)。为了排除滴度为103-104pfu/ml或更低的痘苗病毒vTF7-3样品，将尿囊液样品稀释106倍，用这些稀释物在受孕卵中再繁殖病毒。将该过程重复三次或更多次。所得尿囊液作为给药肾脏的样品溶液于4℃贮存。根据HA值估计，病毒滴度为2×109pfu/ml。
构建并制备缺乏F基因的仙台病毒载体(1)构建缺失F基因的仙台病毒基因组cDNA和表达F基因的质粒全长仙台病毒(SeV)基因组cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan M.K.等，J.General Virol.，1997，78，2813-2820)(pSeV18+b(+)也称pSeV18+)，用SphI和KpnI消化，回收所得片段(14673bp)，将其克隆至pUC18，获得pUC18/KS。用pUC18/KS构建缺失F基因的区域。F基因的缺失通过PCR和连接反应的联合应用来实施，将F基因的ORF(1698bp，从ATG至TGA)替换为序列5’-atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO4)，从而构建F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。用正向引物(5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO5)和反向引物(5’-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO6)进行PCR，以便扩增F基因的上游区，用正向引物(5’-atgcatgccggcagatga/SEQID NO7)和反向引物(5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO8)进行PCR以便扩增F基因的下游区，用EcoT22I连接这些PCR产物。所得质粒用SacI和SalI消化，回收含有F基因缺失位点的片段(4931bp)并克隆至pUC18，获得pUC18/dFSS。pUC18/dFSS用DraIII消化，将所回收的片段替换为包含F基因的pSeV18+的DraIII片段，并连接，得到pSeV18+/ΔF。
然后，通过PCR扩增EGFP基因，以构建在F缺失位点包含EGFP基因的一种cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)。将EGFP基因的长度调整为6的倍数(Hausmann，S.等，RNA2，1033-1045(1996))，方法是用针对5’-末端的NsiI-结尾型引物(5′-atgcatatggtgatgcggttttggcagtacSEQ ID NO9)和针对3’-末端的NgoMIV-结尾型引物(5′-tgccggctattattacttgtacagctcgtcSEQ ID NO10)进行PCR。将PCR产物用限制酶NsiI和NgoMIV消化。所得片段从凝胶中回收，然后连接至pUC18/dFSS中位于F缺失位点处的NsiI和NgoMIV之间，然后测序。从该质粒切出包含EGFP基因的DraIII片段，用以替换pSeV18+中包含F基因的区域中的DraIII片段。通过连接反应获得质粒pSeV18+/ΔF-GFP。
(2)制备能诱导表达SeV-F蛋白的辅助细胞如下构建仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP可诱导型表达质粒。通过PCR扩增SeV-F基因并验证其序列。将PCR产物插入pCALNdlw质粒的唯一SwaI位点，该位点被设计为使基因产物的表达能被Cre DNA重组酶诱导(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121(1998))。由此获得质粒pCALNdLw/F。
为了从F基因缺失型基因组回收感染性病毒颗粒，建立能表达SeV-F蛋白的辅助细胞系。使用衍生自猴肾并通常用于SeV繁殖的LLC-MK2细胞。将LLC-MK2细胞培养在37℃、5％CO2下的MEM中，该培养基包含10％热灭活并固定的胎牛血清(FBS)，50U/ml青霉素G钠，和50μg/ml链霉素。考虑到SeV-F基因产物的细胞毒作用，将该基因克隆至pCALNdLw中，在这里，克隆基因的表达由Cre DNA重组酶诱导。用上述pCALNdLw/F通过磷酸钙法(哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))按照所述方案转染LLC-MK2细胞。
在10-cm平板中培养LLC-MK2细胞至40％汇合，用10μgpCALNdLw/F转染，在含有10％FBS的10ml MEM中37℃、5％CO2培养24hr。然后，使细胞脱壁，重悬在10ml培养基中，铺板于5个10-cm平皿中，使其中一个平皿铺5ml细胞，两个铺2ml，还有两个铺0.2ml。将细胞在含有10％FBS并添加了1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的10mlMEM中培养14天，每两天更换一次培养基，选出稳定的转染子。用克隆环(cloning ring)回收培养基上30个G418抗性克隆。将每个克隆的细胞进一步在10-cm平皿中培养至100％汇合。
为了诱导F蛋白表达，将细胞在6cm平皿中培养至100％汇合，用AxCANCre腺病毒以moi＝3进行感染，采用Saito等(Saito等，Nucleic AcidsRes.，1995，23，3816-3821；Arai T.等，J.Virol.，1998，72，1115-1121)的方法。
(3)重建并繁殖F基因缺失型SeV病毒
LLC-MK2细胞用上述质粒pSeV18+/ΔF-GFP如下进行转染，该质粒中，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因已根据6n法则插入F缺失位点。
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿的密度铺板于100-mm petri平皿上，培养24hr，然后室温下用表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染1hr，所述重组病毒已用补骨脂素和长波紫外线(365nm)处理了20min(Fuerst T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126)(moi＝2)(优选moi＝2-3；更优选moi＝2)。紫外线辐射用配备有5个15-瓦灯泡的UV Stratakinker2400(目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)进行。将细胞洗三遍，将质粒pSeV18+/ΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，和pGEM/L(Kato A.等，Genes细胞，1996，1，569-579)分别以12μg/皿，4μg/皿，2μg/皿，和4μg/皿的比例重悬在OptiMEM(GIBCO)中，并与SuperFect转染试剂(每1μg DNA对5μl SuperFect(QIAGEN))混合。将混合物室温温育10min，然后重悬于3ml含3％FBS的OptiMEM中，添加所述细胞。在培养箱中培养了3小时后，将细胞用无血清的MEM洗两次，再于包含40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM中培养70hr。然后，收获细胞，以107细胞/ml重悬于OptiMEM中。将细胞冻融3次，与脂转染试剂DOSPER(Boehringer mannheim)混合(106细胞/25μlDOSPER)，室温温育15min，然后用于转染LLC-MK2/F7细胞(106细胞/孔，在12-孔板上)，所述细胞是如上所述选出的表达F基因的辅助细胞的克隆之一。将所述细胞培养在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM中，收获培养上清。
将仙台病毒载体体内给药至肾脏中(1)从肾动脉给药所述病毒使用6周龄Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，体重160-180g)。用戊巴比妥将它们麻醉；将戊巴比妥原液用盐水稀释10倍，然后以体重的1/100ml体积给药至腹腔。沿中线开腹。除去附着的组织如脂肪组织，暴露出左肾和肾动脉。将一个24-G的导管插入左肾动脉，以便灌注生理盐水并给药病毒。此外，为了防止回流至腹主动脉，钳住肾动脉靠近腹主动脉的部分。肾脏灌以数百μl生理盐水。之后，用1-ml注射器给药300，500或700μl包含实施例1制备的病毒(滴度2×109pfu/ml)的样品溶液。取出导管后，用AronalphaTM(Toagosei Co.，Ltd.)封闭针痕。5分钟后，除去钳子，用创口夹(Michel’s clip)闭合腹腔。
(2)从尿道给药所述病毒使用6周龄SD大鼠(雄性，体重160-180g)。用戊巴比妥将它们麻醉；将戊巴比妥原液用盐水稀释10倍，然后以体重的1/100ml体积给药至腹腔。沿中线开腹。暴露出左肾和尿道。将一个26-G的针头插入尿道，钳住左肾静脉，将300，500或700μl包含实施例1制备的病毒(GFP/SeV)(滴度2×109pfu/ml)的样品溶液给药至肾脏。5分钟后，除去钳子，用创口夹闭合腹腔。
(3)收集肾脏样品并制备切片收集病毒给药的4，7，14，21和28天后的肾脏样品。将大鼠用戊巴比妥麻醉并开腹。为了进行肾灌注，将分支为肾动脉的腹主动脉上部用动脉钳封闭，将翼状针插入分支为肾动脉的腹主动脉的下部。将生理盐水(20ml)注射至所述动脉中，以除去血液，然后经手术取出肾脏。沿肾脏的额切面切片，在切片前新鲜配制的methacam溶液(甲醇∶氯仿∶乙酸＝9∶6∶1)中固定。用常规方法将已固定的样品包埋在石蜡中，制备4-μm厚的石蜡切片。用二甲苯和系列稀释的乙醇脱蜡。
(4)免疫组织化学染色测定反应性抗-GFP抗体(大鼠多克隆抗体；Molecular Probes，Oregon，USA)以及针对巨噬细胞的抗-ED-1抗体(小鼠单克隆抗体，Serotec，Oxford，England)，以便鉴定被病毒感染的组织并评估向细胞内的浸润。将按照上述方法制备的切片用甲醇和过氧化氢(9∶1)的混合溶液在室温下处理5分钟，以灭活内源过氧化物酶。用PBS溶液(10分钟)洗三次后，将样品切片用封闭试剂室温处理20分钟(所述封闭试剂选自以下组合5％山羊抗兔抗体的血清；5％马抗小鼠单克隆抗体的血清；各200μl)。将切片与每种已稀释50倍的第一抗体于4℃温育16小时。切片样品用冷PBS洗三次，然后与第二抗体温育。所用的第二抗体为用于证实GFP的存在的生物素化山羊抗-兔IgG(H+L)的抗体(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)(稀释150倍)；和用于证实巨噬细胞存在的生物素化马抗-小鼠IgG(H+L)的抗体(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)(稀释150倍)。室温下与抗体反应30分钟。将切片用冷的PBS溶液(10分钟)洗三次。将样品与亲和素-生物素化(Vector；按照亲和素-生物素化试剂盒所附的说明书)辣根过氧化物酶复合物室温温育30分钟。用DAB溶液显色。终止该反应后，将样品切片用甲基绿复染。
(5)荧光显微镜检观察到的病毒给药4天后未固定的肾脏切片上GFP的表达从手术取出但未固定的肾脏制备额面切片，在荧光立体显微镜下观察(荧光光源为激发波长425nm；发射波长480nm)，由此证实给药GFP/SeV后的GFP表达。用于进行荧光观察的所有样品都是在肾动脉或尿道给药500μl病毒的4天后获得的。结果见图1(从肾动脉给药)和图2(从尿道给药)。皮质区和髓质区都观察到大面积的强荧光信号。
(6)给药4天后样品的免疫组织化学染色用抗-GFP抗体获得的结果表明，从肾动脉或尿道给药的情况中，间质成纤维细胞有弥散性病毒感染(图3和4)。从肾动脉给药的情况中，GFP抗体阳性染色可见于肾小球；约20％的肾小球被感染(图5)。据认为肾小球中的抗体阳性细胞为肾小球膜细胞。应注意，从肾动脉给药后，在GFP-阳性肾小球及其附近的间质细胞中未观察到巨噬细胞浸润。在从尿道给药的情况中，强GFP表达可见于肾盂上皮细胞，间质细胞和肾小管上皮细胞中弥散着被感染的细胞(图6)。在从尿道给药的情况中，所述表达不仅见于远端肾小管，还见于近端肾小管。此外，在从尿道给药的情况中，大量巨噬细胞浸润至肾小管周围的组织。两种给药途径对浸润诱导程度的差异可部分归因于肾小管上皮细胞作为抗原呈递细胞的活性。
(7)给药的7，14，21和28天后的免疫组织化学染色使用6周龄雄性SD大鼠，本实验中全部都是从肾动脉给药。所给与的病毒液的体积是700μl/只大鼠；病毒液中GFP/SeV的滴度为2×109pfu/ml。免疫组织化学染色显示，给药后任何一个取样日制备的样品都为GFP抗体-阳性染色(7天，图7-9；14天，图10-13)。在经证实已被感染的间质细胞和肾小球细胞附近未发现巨噬细胞的浸润。在这项给药实验中，GFP抗体阳性染色可见于任一个取样日获得的肾小管上皮细胞(28天，图14和15)，但是在肾动脉给药后第4天的样品中未观察到这样的染色。在给药后第28天的样品中，细胞浸润可见于某些例子中的GFP抗体阳性肾小管细胞附近。这表明肾小管间质中有损伤。
工业实用性使用常规载体未能以足够高的效力将基因转移至肾细胞，而本发明使用副粘病毒载体使得有可能仅通过短时间的载体接触而将基因高效引入肾细胞。本发明提供了一种靶向肾细胞的基因治疗的基本技术。
序列表<110>株式会社载体研究所(NAVEC Research Inc.)<120>用于将基因引入肾细胞的病毒载体<130>D3-A0005P<140><141><150>JP 2000-197870<151>2000-06-27<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>1ctttcaccct 10<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>2tttttcttac tacgg 15<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>3cggccgcaga tcttcacg 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>4atgcatgccg gcagatga 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5gttgagtact gcaagagc 18<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>7atgcatgccg gcagatga 18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8tgggtgaatg agagaatcag c 21<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9atgcatatgg tgatgcggtt ttggcagtac 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10tgccggctat tattacttgt acagctcgtc 30
权利要求
1.一种将基因引入肾细胞的方法，其中该方法包括使副粘病毒载体与肾细胞接触。
2.权利要求1的方法，其中该方法还包括给药副粘病毒载体至血管。
3.权利要求2的方法，其中血管为肾动脉。
4.权利要求1的方法，其中该方法还包括给药副粘病毒载体至尿道。
5.权利要求1到4任意一项的方法，其中肾细胞选自间质细胞，肾小球细胞和肾小管细胞。
6.权利要求1到5任意一项的方法，其中副粘病毒为仙台病毒。
7.一种用于将基因转移至肾细胞的副粘病毒载体。
8.一种将基因转移至肾细胞的组合物，其中该组合物包含副粘病毒载体或含有该载体的细胞。
9.权利要求8的组合物，其中该组合物被给药至血管。
10.权利要求9的组合物，其中血管为肾动脉。
11.权利要求8的组合物，其中该组合物被给药至尿道。
12.权利要求8至11任意一项的组合物，其中肾细胞选自间质细胞，肾小球细胞和肾小管细胞。
13.权利要求8至12任意一项的组合物，其中副粘病毒为仙台病毒。
全文摘要
本发明提供了确保将基因高效转移至肾细胞中的病毒载体及其用途。副粘病毒载体的应用导致能将基因高效转移至肾细胞。通过体内给与而转移的基因可以在肾细胞中长期持续表达。本发明的载体适用于肾脏的基因治疗。
文档编号C12N15/86GK1447700SQ01814143
公开日2003年10月8日 申请日期2001年6月27日 优先权日2000年6月27日
发明者今井圆裕, 猪阪善隆, 福村正之, 长谷川护 申请人:株式会社载体研究所