抗异常型朊病毒单克隆抗体及其制造方法以及使用其的免疫测定方法

专利名称：抗异常型朊病毒单克隆抗体及其制造方法以及使用其的免疫测定方法
技术领域：
本发明涉及抗异常型朊病毒单克隆抗体及其制造方法以及使用其的异常型朊病毒的免疫测定方法。
背景技术：
以克罗伊茨费尔特-雅各布氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，以下简称为CJD)、羊瘙痒病、传染性貂脑病为主的脑神经系统疾病在经过长时间的潜伏期后发病，这些疾病的主要特征在于几乎局限于神经系统的脑组织海绵状变性以及淀粉样斑(库鲁斑，kuru spot)，进行性恶化直至死亡。发病的原因尚存在很多不明之处，但认为与病毒等感染性病原体无关，是由于异常性朊病毒蛋白质沉积引起的，所谓的“朊病毒假说”占主流。该疾病一直通过脑切片标本的病理学方法进行诊断。
据说该疾病的病原具有感染性，还报道了通过摄食脑神经组织(库鲁病等)、电极或硬脑膜移植等医疗行为引起的感染。最近，认为牛海绵状脑病以及新型CJD是通过经口感染传播的。
正常型朊病毒蛋白质是存在于细胞膜上的糖蛋白质，广泛存在于以酵母为首的真核细胞中。另外，有报道指出编码正常型朊病毒蛋白质的基因是单一基因，编码的氨基酸序列在哺乳类动物间非常保守，特别是人、羊、牛之间的同源性为约90％以上。
关于正常型朊病毒蛋白质的功能，虽然只能说尚不明确，但是由于氨基酸序列保守，推测在神经组织的生成、分化和功能方面发挥重要作用。另外，根据最近采用人工破坏了朊病毒蛋白质基因的小鼠的研究，观察到随着衰老而发生的下半身的震颤等步行异常、小脑的病理性萎缩，特别是小脑普尔基涅细胞(Purkinje cell)的脱落。
尽管有报道指出对于人来说，朊病毒蛋白质的部分氨基酸序列(一级结构)存在个体差异，但是确认在患CJD的患者和健康正常人之间朊病毒蛋白质的氨基酸序列没有差异。因此认为，异常型朊病毒蛋白质的沉积不是由于氨基酸序列的不同引起的，而是由于立体结构的不同引起的。因此，采用以前的技术制得的抗体中，识别氨基酸一级序列的抗体不能区别两者。另外，由于氨基酸序列在动物间非常保守，因而推测抗原性弱。因此，需要制作出一种抗原，该抗原是维持了立体结构的免疫原，同时提高了抗原性。
发明公开本发明的目的在于提供一种能够识别正常型朊病毒和异常型朊病毒的单克隆抗体及其制造方法。另外，本发明的目的还在于提供使用该单克隆抗体对异常型朊病毒进行免疫测定的方法。
如果要制作能够识别正常型朊病毒和异常型朊病毒的单克隆抗体，考虑到使用异常型朊病毒作为免疫原，给动物免疫，按照常规方法得到单克隆抗体，筛选与异常型朊病毒反应而不与正常型朊病毒反应的单克隆抗体。但是，朊病毒蛋白质不仅在异常型和正常型之间氨基酸序列没有差异，而且种特异性小，因此一般而言是难以获得抗体的蛋白质，而且能够识别异常型和正常型的差异的抗体更难获得。另外，使用异常型朊病毒作为免疫原时，是难以确保足够量的蛋白质。具有异常型朊病毒的疾病患病的机率小，而且作为病原体具有很强的感染力，因此在操作时必需非常细心，且能够处理这种病原体的设施也是有限的。要确保大量这样的物质相当困难。而且，为了作为免疫原，有必要进行某种程度的纯化，但是在纯化的阶段会导致该蛋白质不可溶，以致不适于作为免疫原。为了用作免疫原，使用改性剂等，使之变得可溶，但是这时异常型所固有的立体结构是否能够保持不变则成了问题。基于这些理由，很难通过使用异常型朊病毒作为免疫原，制作能够识别正常型朊病毒和异常型朊病毒的单克隆抗体。
本发明人进行了悉心研究，结果在异常型朊病毒的立体结构中，推测出被认为露出到外部的区域，通过使用含有将这些区域中的多数相连结得到的肽的免疫原，成功地制作了能够识别正常型朊病毒和异常型朊病毒的单克隆抗体，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段。另外，本发明还提供产生上述本发明的单克隆抗体的杂交瘤。而且，本发明还提供通过利用上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段与异常型朊病毒的抗原抗体反应进行的免疫测定，测定异常型朊病毒的方法。而且，本发明还提供用于进行上述本发明的免疫测定方法的免疫测定用试剂盒，其中包括上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段。而且，本发明还提供上述本发明的抗异常型朊病毒单克隆抗体的制造方法，包括用具有下述肽的免疫原给动物免疫，所述肽含有将异常型朊病毒的一级氨基酸序列中不连续的多个区域之间连结而成的区域；制作来源于免疫动物的抗体产生细胞的杂交瘤；筛选产生与异常型朊病毒反应但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体的杂交瘤；由通过筛选选中的杂交瘤回收上述抗异常型朊病毒单克隆抗体。而且，本发明还提供该制造方法中使用的免疫原。
按照本发明，首次提供了与异常型朊病毒反应但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段，且按照本发明，首次能够进行异常型朊病毒的免疫测定。因此，认为本发明对于感染了牛海绵状脑病的牛或其它动物的诊断以及CJD的诊断做出了很大的贡献。


图1是示意性地表示正常型朊病毒的立体结构、Korth等的报道中记载的异常型朊病毒的立体结构以及本发明人推测出的异常型朊病毒的立体结构的图。
发明的最佳实施方式本发明的单克隆抗体是与异常型朊病毒发生抗原抗体反应，但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体。其中，“实质上不反应”是指对正常型朊病毒的反应性与对异常型朊病毒的反应性相比，低至可以识别的程度。因此，即使在对正常型朊病毒具有交叉反应性的场合，其免疫学的反应性与对异常型朊病毒的免疫学反应性相比低至可识别的程度的情况，包括在本说明书所说的“与正常型朊病毒实质上不反应”的情况内，也包括在本发明的范围内。不言而喻，优选与正常型朊病毒不具有交叉反应性的单克隆抗体，即与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒不反应的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体优选在免疫组织染色中与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒不反应。另外，朊病毒的免疫组织染色以前是在进行了所谓的“酸高压处理”(将浸渍于1.0～100mM HCl溶液中的组织在121℃下高压处理20分钟)后进行，但本发明的单克隆抗体优选与未进行这种酸高压处理等预处理的组织中存在的异常型朊病毒反应。作为这种抗异常型朊病毒单克隆抗体的具体实例，可以例举下述实施例中制作的由杂交瘤EBEB4C3Ebb产生的单克隆抗体。另外，杂交瘤EBEB4C3Ebb已于2000年9月1日保藏在 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(旧工业技术院生命工学工业技术研究所)，保藏号为FERM P-18013(原保藏)，并于2001年11月21日基于布达佩斯条约由原保藏单位移送至国际保藏单位，该国际保藏的保藏号为FERM BP-7808。
本发明还提供上述本发明的单克隆抗体的抗原结合性片段。其中，“抗原结合性片段”是指抗体的Fab片段或F(ab’)2片段等发挥该抗体的抗原结合性的片段。这些片段可以按照常规方法，通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白质分解酶将本发明的单克隆抗体分解，从而容易地得到。这种抗原结合性片段也可以与本发明的单克隆抗体同样用于下述免疫测定。
如上所述，使用异常型朊病毒作为免疫原，难以制作与异常型朊病毒反应但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体。为了解决这一问题，本发明人首先独自推测出了异常型朊病毒的立体结构。图1中，表示正常型朊病毒的立体结构(PrPc模型)、Korth等推测出的异常型朊病毒的立体结构((PrPsc模型1)C．Korth等，Nature 39074-77，1997)以及本发明人推测出的异常型朊病毒的立体结构(PrPsc模型2)。本发明人推测出的异常型朊病毒的立体结构与迄今为止由Korth等推测出的立体结构相比，p折叠结构多。这种推测的根据在于，由cD光谱和FT-IR的结果可知，在PrPC→PrPSc的过程中，a螺旋由4O％减少至30％，p结构由非常少增大至45％。如果由通过NMR得到的立体结构(123-231)进行计算，除去非常易弯曲而不能确定结构的N末端的重复序列部分，PrPC的二级结构为a螺旋占25％，p结构占3.4％(以全长231残基来计)。假定不能计算的N末端部分对a螺旋含量的贡献为15％，如果采用Korth等的模型进行PrPSc的计算，则a螺旋占36％，p结构占7％。因此，按照Korth等的模型，只能解释一部分CD光谱和FT-IR的结果。因此，尝试考虑进一步减少a螺旋且增加p结构的结构变化。如果按照根据SST所做的二级结构预测计算二级结构的含量，则α螺旋占5.6％，β结构占18％。二级结构预测的精度另当别论，朊病毒蛋白质可以说是原本与α螺旋相比容易形成β结构的蛋白质。如果进一步详细检视，相当于PrPC的α螺旋2的部分大约一半被判断为β结构，其它为C(无规卷曲，random coil)结构，即使是α螺旋3，除后半部分含有被判断为α螺旋的残基外，其余为β结构或C结构。因此，尝试作出了α螺旋2的前半部分和α螺旋3的后半部分改变成β结构的模型(模型2)。
该模型与Korth等的模型不同，形成15B3的抗原表位(epitope)的E1、E2、E3部分均发生了结构变化，在分子模型中可以使3个部分均形成β发夹结构而聚集在一起，因此不会发生矛盾。另外，该模型的二级结构含量为α螺旋占27％，β结构占17％，并非与CD光谱和FT-IR的结果完全一致，但是与Korth等的模型相比，显示较为接近的值。
本发明人认为在该独自推测出的异常型朊病毒的立体结构中，将向外部露出的区域，即B1区域(朊病毒的一级氨基酸序列的第128个氨基酸至第131个氨基酸，以下记作“128-131a.a.”)、B2区域(138-141a.a.)和B3区域(149-152a.a.)以及E1区域(141-149a.a.)、E2区域(164-170a.a.)和E3区域中2个以上区域连结得到的肽作为免疫原使用，能够得到对异常型朊病毒特异反应的单克隆抗体，实验的结果，如下述实施例具体记载的那样，使用将E1区域和B2、B3区域连结的肽(序列号1)以及含有E2区域的肽(序列号2)分别连结在同一KLH上得到的物质作为免疫原，得到了由上述杂交瘤EBEB4C3Ebb产生的单克隆抗体。另外，上述各区域可以直接连结，也可以通过1个或数个其它氨基酸间接地连结。因此，“连结”这一用语包括上述区域直接连结的情况以及通过1个或数个氨基酸残基间接连结的情况这两种情况。另外，上述各区域也可以缺失或添加1个或数个氨基酸。本质上由这些区域构成的肽可以使用市售的自动肽合成机容易地制备。因而，使用将蛋白质的一级氨基酸序列中的不连续区域连结得到的物质作为免疫原的想法是本发明人独创的。另外，上述各区域的氨基酸序列如下所述。
B1Tyr Met Leu GlyB2Ile Ile His Phe
B3Tyr Tyr Arg GluE1Gly Ser Asp Tyr Glu Asp ArgE2Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser上述肽也可以直接作为免疫原使用，但是如果使用将上述肽结合在匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等载体分子上得到的物质作为免疫原，则抗原性提高，因此优选。另外，也优选使用在1个载体分子上结合多种上述肽得到的物质作为免疫原。
除使用上述免疫原以外，可以按照常规方法制作本发明的单克隆抗体。也就是说，可以通过用上述免疫原给动物免疫，制作来源于免疫动物的抗体产生细胞的杂交瘤，筛选产生与异常型朊病毒反应但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体的杂交瘤，由通过筛选选中的杂交瘤回收上述抗异常型朊病毒单克隆抗体进行。使脾细胞或淋巴细胞等抗体产生细胞与骨髓瘤细胞等无限增殖化细胞融合制作杂交瘤的方法是本领域众所周知的。
通过利用本发明单克隆抗体和异常型朊病毒的抗原抗体反应的免疫测定，能够测定异常型朊病毒。另外，其中，“测定”包括检测和定量测定两者。免疫测定方法自身是本领域众所周知的，众所周知的任何方法均包括在本发明的范围内。也就是说，如果根据反应形式分类，有夹心法、竞争法、凝集法等，如果根据标记分类，有酶免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析等，这些方法均包括在本发明所说的“免疫测定”中。而且，免疫组织染色、Western印迹法等也包括在本发明所说的“免疫测定”中。
另外，这些免疫测定方法本身是众所周知的，在本说明书中没有说明的必要，如果简单记载的话，例如按照夹心法，将本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为第1抗体固定于固相，使之与检体反应，洗涤后，使之与能够和异常型朊病毒发生抗原抗体反应的第2抗体(可以是与正常型朊病毒也发生抗原抗体反应的抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体)反应，洗涤后，测定固相结合的第2抗体。通过预先用酶、荧光物质、放射性物质、生物素等标记第2抗体，可以测定结合在固相上的第2抗体。按照上述方法对已知浓度的多种标准试样进行测定，基于测定的标记量和标准试样中异常型朊病毒量的关系制作标准曲线，将对于未知浓度的被测试样的测定结果套用在该标准曲线中，可以定量被测试样中的异常型朊病毒。另外，上述说明中的第1抗体和第2抗体可以互换。另外，按照凝集法，将本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段固定在胶乳等粒子上，使之与检体反应，测定吸光度。按照上述方法对已知浓度的多种标准试样进行测定，基于测定的标记量和标准试样中异常型朊病毒量的关系制作标准曲线，将对于未知浓度的被测试样的测定结果套用在该标准曲线中，可以定量被测试样中的异常型朊病毒。
另外，各免疫测定所必要的试剂类也是众所周知的，除了单克隆抗体具有特征以外，可以使用常规的免疫测定试剂盒进行免疫测定。例如通常包括缓冲液、固相、标记第2抗体等。
以下，结合实施例更具体地说明本发明。但是，本发明并不受下述
(1)免疫原的制作Korth等人报道指出，以采用基因重组方法使牛朊病毒蛋白质表达得到的重组抗原作为免疫原，解析抗体识别部位(表位，epitope)，朊病毒蛋白质的主要抗原部位为上述E1区域、E2区域和E3区域3处(Kroth等，与上述相同)。基于该结果，推测正常型朊病毒蛋白质的立体结构，认为虽然E2和E3接近，但是与E1存在距离。与此相对，如果推测如上所述采取β折叠结构的情况，认为由于E1采取环结构，在形成新出现的2根β链(B2、B3)的同时，形成新的表位。因此，按照常规方法化学合成连结E1区域和B2、B3区域的E1B1肽(序列号1)以及包括E2区域的E2-1肽(序列号2)，再按照常规方法将其结合在KLH上(上述两者肽结合在单一的KLH分子上)，使用得到的结合体作为免疫原。
(2)免疫和细胞融合将浓度0.5～1.0mg/mL的免疫原悬浊于等量的弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)中，给BALB/C小鼠免疫2至3次，每次0.2～0.3mL/mouse。最终免疫3至4日后，摘出脾脏，将细胞分散后，采用聚乙二醇法与P3U1骨髓瘤细胞进行细胞融合。
通过在HAT培养基中培养，选择杂交瘤后，使用将上述各合成肽结合在牛血清白蛋白(BSAbovine serum albumin)上得到的抗原，按照ELISA法进行抗体产生细胞的筛选。也就是说，采集细胞培养上清液，分别注入固定有BSA结合体的ELISA板(96孔型)中，使之反应后洗涤，再使辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠Ig(IgG+IgM)反应，通过显色反应确认有无抗体产生细胞。表1表示采用ELISA法得到的阳性数。
表1

(3)异常型朊病毒特异反应性单克隆抗体的筛选为了确认抗体的特异性，由GSS(Gerstmann Straussler综合症)患者的脑制作脑的薄切片，利用免疫组织学检索讨论反应性。标本使用进行了酸高压处理作为预处理的物质以及没有进行预处理的物质，选择对异常型朊病毒蛋白质特异反应的抗体无性系。另外，作为对照，使用对正常人脑的薄切片进行酸高压处理得到的物质以及没有进行这种处理的物质，确认没有反应。该免疫组织染色的操作具体详细叙述如下。
1、用二甲苯使组织片脱石蜡后，阶段性地降低醇浓度，进行水合。
2、用蒸馏水洗涤5分钟。
3、浸渍于0.3％过氧化氢-甲醇溶液中，使之反应30分钟，除去内因性过氧化物酶。
4、用生理磷酸缓冲液洗涤5分钟。
5、将需要进行酸高压处理的组织片浸渍于10～1000mM盐酸溶液中，在121℃下进行高压处理20分钟。
6、在室温下使之与用生理磷酸缓冲液稀释到5％的家兔血清反应30分钟。
7、除去多余的血清，在室温下使之与杂交瘤培养液反应1小时。
8、用生理磷酸缓冲液洗涤5分钟。
9、在室温下使之与稀释的生物素化抗小鼠免疫球蛋白家兔抗体反应1小时。
10、用生理磷酸缓冲液洗涤5分钟。
11、在室温下使之与稀释的ABC试剂(Vector公司制)反应30分钟。
12、用生理磷酸缓冲液洗涤5分钟。
13、在室温下使之与过氧化物酶基质溶液反应5～30分钟。
14、用蒸馏水洗涤。
15、用Lillie-Mayer苏木精进行对比染色后，进行洗涤、密封。
通过上述操作选择的细胞株如表2所示。
表2

(表中，高压处理一行中，+表示进行了高压处理，-表示没有进行高压处理，各单克隆抗体的行中，+表示阳性，-表示阴性，+W表示弱阳性)(4)结果以上结果，得到了与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒实质上不反应，能够识别这两者的单克隆抗体。产生该单克隆抗体的杂交瘤EBEB4C3Ebb如上所述保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，其保藏号为FERM BP-7808。
工业实用性本发明的单克隆抗体由于与异常型朊病毒发生抗原抗体反应，但与和正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒不发生抗原抗体反应，因而按照本发明，首次能够进行异常型朊病毒的免疫测定。因此，认为本发明对感染了牛海绵状脑病的牛或其它动物的诊断以及CJD的诊断作出了很大的贡献。
序列表<110>富士瑞必欧株式会社<120>抗异常型朊病毒单克隆抗体，其制造方法，以及使用其的免疫测定方法<130>01PF231<160>7<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>作为用于产生抗异常型朊病毒单克隆抗体的免疫原而使用的肽<400>1Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu1 5 10 15<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>作为用于产生抗异常型朊病毒单克隆抗体的免疫原而使用的肽<400>2Val Tyr Try Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Cys1 5 10<210>3<211>4<212>PRT<213>人<400>3Tyr Met Leu Gly1<210>4<211>4<212>PRT<213>人<400>4Ile Ile His Phe1<210>5<211>4<212>PRT<213>人<400>5Tyr Tyr Arg Glu1<210>6<211>7<212>PRT<213>人<400>6Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人<400>7Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser1 权利要求
1.一种抗异常型朊病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段，其与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒实质上不反应。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段，在免疫组织染色中，与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒不反应。
3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段，与未进行预处理的异常型朊病毒反应。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其来源于将含有序列号2所示氨基酸序列的肽结合在载体上得到的物质作为免疫原进行了免疫的动物。
5.一种单克隆抗体或其抗原结合性片段，由杂交瘤EBEB4C3Ebb(FERM BP-7808)产生。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段，为单克隆抗体。
7.一种杂交瘤，产生权利要求1至5中任意一项所述的单克隆抗体。
8.一种测定异常型朊病毒的方法，利用权利要求1至6中任意一项所述的单克隆抗体与异常型朊病毒的抗原抗体反应进行免疫测定，从而测定异常型朊病毒。
9.用于进行权利要求8所述的方法的免疫测定用试剂盒，其中包括权利要求1至6中任意一项所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
10.权利要求1至6中任意一项所述的抗异常型朊病毒单克隆抗体的制造方法，包括用具有下述肽的免疫原给动物免疫，所述肽本质上由将异常型朊病毒的一级氨基酸序列中不连续的多个区域连结而成的区域构成；制作来源于免疫动物的抗体产生细胞的杂交瘤；筛选产生与异常型朊病毒反应但与正常型朊病毒实质上不反应的抗异常型朊病毒单克隆抗体的杂交瘤；由通过筛选选择出的杂交瘤回收上述抗异常型朊病毒单克隆抗体。
11.如权利要求10所述的方法，上述免疫原是将上述肽结合在载体上得到的物质。
12.如权利要求11所述的方法，上述免疫原是将多种上述肽结合在载体上得到的物质。
13.如权利要求10至12中任意一项所述的方法，上述肽包括将选自E1区域、E2区域、B1区域、B2区域和B3区域中的2个以上区域连结而成的区域。
14.如权利要求13所述的方法，上述肽具有序列表中序列号1所示的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的方法，上述免疫原是将具有序列表中序列号1所示的氨基酸序列的肽以及具有序列号2所示的氨基酸序列的肽结合在载体上得到的物质。
16.按照权利要求10至15中任意一项所述的方法制造的抗异常型朊病毒单克隆抗体。
17.权利要求10至15中任意一项所述的方法中使用的免疫原。
全文摘要
本发明公开了能够识别正常型朊病毒和异常型朊病毒的单克隆抗体及其制造方法。本发明的抗异常型朊病毒单克隆抗体与异常型朊病毒反应，但与正常型朊病毒实质上不反应。本发明的抗异常型朊病毒单克隆抗体可以通过使用具有下述肽的免疫原得到，所述肽包含将异常型朊病毒的一级氨基酸序列中不连续的多个区域连结而成的区域。
文档编号C12N15/02GK1479748SQ01820260
公开日2004年3月3日 申请日期2001年12月7日 优先权日2000年12月8日
发明者仓野义裕, 梅谷淳, 宫腰秀夫, 柳谷孝幸, 夫, 幸 申请人:富士瑞必欧株式会社