专利名称：基片、制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及活性基片的改善，所述活性基片可用来形成结合了探针、用于多反应体系的官能化基片，它们例如与靶分子相互作用。本发明的各个方面涉及化学修饰基片表面而在其上共价结合分子(例如，分子探针)的方法；从所述方法获得的和/或可获得的基片；应用所述基片制备多反应体系的进一步方法；通过所述方法获得的或可获得的多反应体系；所述多反应体系在分析和/或合成中的应用；应用所述多反应体系直接和/或间接合成的产品；和/或得自所述多反应体系的信息的应用。
在本文的实施方案中，所述多反应体系可能是显微阵列(例如，DNA显微阵列-也称为生物芯片)；所述探针可能是DNA序列和/或寡核苷酸，而这样获得的信息可能是(生物)化学的和/或生物的信息。本发明的多反应体系的其它用途包括高处理量筛选。
一种显微阵列是多反应体系的一个实例，它是一种强有效的工具，能利用微量的样品和试剂平行操作数千个检测和分析试验。当例如为了筛选和/或分析和/或了解复杂的过程而需要操作很多试验时，这样的大规模平行技术吸引了科学家。
一个这样的用途是，DNA序列鉴定和基因表达的领域。在可获得DNA芯片以前，基于聚合酶链反应(PCR)的经典技术只能一次检测或研究一个基因的表达。下列文献中描述了这样的技术“L’Avenir de laPCRDiversification de Technologies et des Applications”，Le Technoscope du Biofutur，171，pp.3～9(1997)，将它的公开内容并入本文作参考。相比之下，DNA芯片能一次性分析高达几十万个基因。
应懂得，本文使用术语例如“多反应体系”、“显微阵列”、“芯片”和/或“生物芯片”来表示具有相同或相似的结构和/或基本原理的系统和/或装置，它们在本文可互换使用。生物芯片表示为了与生物活性分子一起使用的芯片。DNA显微阵列、DNA生物芯片和DNA芯片都表示这样的芯片，即，其上的探针都基于DNA序列或寡核苷酸。本文的大多数实例涉及DNA芯片，所以可省去词头DNA。
使多反应体系(例如，显微阵列)成为可能的基本原理是，任选以其上一定的方式选择性地和持久地将各种化学物质(例如，探针分子)结合在一个或一系列基片表面的能力。这类基片可用于这样的用途，即，结合的物质可进一步与它们的环境相互作用而牢固地连接在基片上。这些基片还可用于检测和/或分析(用合适的设备)对于结合到所述基片(和/或基片系列)上的整个系列物质有意义的给定性能。
通过DNA-生物芯片应用的杂交方法更详细地阐明了这一点。在该方法中，当两个彼此存在下，单链DNA片段优选结合在它的互补序列上。实际DNA生物芯片包括一个被有序排列的达数十万单链DNA序列(也称为捕获探针)覆盖的表面，它可以是寡核苷酸、cDNA或DNA片段。然后该芯片暴露于未知的悬浮液中，但标记的DNA序列也称为靶。标记的靶将结合到捕获探针中它们的互补序列(如果它存在于芯片上)。所以，小心清洗后，将只在来自靶样品的片段已发现它的互补捕获探针的位置上发现标记。由于可从它的位置检测每个捕获探针的序列(因而检测它的互补靶的序列)，所以有可能收集关于靶样品的基因含量的信息。
基于前述原理的DNA芯片可被设计成服务于很多不同的用途。例如，有可能测定当个体暴露于给定的物质中时，基因表达是如何变化的。这样的试验在药物工业中对于测定新药物的潜在副作用有意义。DNA芯片还可作为诊断装置，例如，测定引起感染的确切细菌株，于是给予患者最合适的抗生素。为这种用途设计的DNA芯片应证明比现在通用的任何测试迅速得多和更具专一性。DNA显微阵列还可在遗传病领域(其中，复杂的基因模式有时只被一个单一碱基对分化)中提供帮助。在更基本的研究用途中，对于基因测序的工作和在其它生物领域中进一步理解控制细胞寿命的复杂过程来说，显微阵列将继续是很好的工具。
杂交只是一种可在分子之间发生的相互作用，所以，操作千万个平行试验的构思可适用于其它领域。例如，虽然DNA芯片可了解接触某些物质的细胞中发生了什么，但从研究基因表达不能获得某些信息。例如，在mRNA或者甚至蛋白质水平出现的因子使间题复杂化。因而，用来鉴定的蛋白质芯片和在蛋白质水平直接的剂量变化也应当是有意义的。
其它类的探针(它们应用非生物分子)也有意义。例如，要用于高处理量筛选，显微阵列可被选定的活性化学物质覆盖，就可以研究这些物质的各种性能和/或与一个样品的各种化学和物理相互作用。
目前有两类不同的方法来生产特别适用作DNA芯片的显微阵列芯片，两类方法都有缺点。
制造DNA芯片的第一类方法之一是Affymetrix开发的，它基于将构成该阵列的全部分子的就地逐步合成(例如，逐个碱基地合成寡核苷酸)。应用的技术借助于半导体生产工业，应用光刻法选择性地活化每一个位置(取决于接触显微阵列的下一个碱基是否适合该位置)。这类技术只允许有限尺寸的探针用于寡核苷酸和/或长于约20个碱基对的DNA，在制备的每一步引起的组合误差会使得难以达到可靠的产品。此外，该技术麻烦，费时，难于在正规实验室装置中重复，极昂贵和/或固定不变的。
此外，对于显微阵列的非DNA用途来说，光刻法特别不合适，因为通常需要光保护基来保护常用的化学试剂和/或探针上不耐光的基(它们可能包括单体)。在有机化学工艺中，制备多组光保护的结构单元会是不切实际的。
制备显微阵列的第二种方法是近期得到普及的所谓的送递法。在送递法中，将探针或DNA片段直接接枝到基片上。首先将它们悬浮于合适的载体介质中，通过任意合适的技术将它以微小的液滴淀积在基片上所要求的位置。典型的液滴体积是毫微升(1×10-9l)或者甚至皮升(1×10-12l)的体积。淀积这些液滴的适当方法包括，直接接触(例如，显微点样)和/或喷墨印刷。但是，虽然淀积微小的液滴可能是有利的，而实现功能显微阵列重要的是，制备的基片应保证DNA探针将在微小的液滴蒸发所需的时间内在那里反应(优选通过形成共价键)。在Marc Schena通过Eaton Publishing(Natick，MA，USA)出版的“显微阵列生物芯片技术”(Micro-array Biochip Technology)，2000中详细描述了该送递方法；所以将该文献的内容并入作参考。
不论用于制备显微阵列的方法如何，要适当地起作用，重要的是显微阵列上的探针足够牢固地连接在显微阵列基片上。固定化探针不允许在不同的处理步骤(例如，与DNA生物芯片一起应用的杂交、洗涤和/或分析步骤)期间解吸。为了满足这些要求，基片与探针之间的共价键是优选的连接方式。牢固地连接了探针的显微阵列是有利的，因为此时探针更容易接受进一步的处理步骤(例如，DNA杂交)，从而改善显微阵列的灵敏度。
为此，人们进行了很多尝试，试图将探针共价结合到显微阵列的基片上。例如，N.Zammateo等(分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)，280，pp.143～15，2000)比较了用于具体的玻璃基片情况的现有技术。研究的体系包括，连接在胺化玻璃上的磷酸化DNA；连接在羧化玻璃上的胺化DNA；以及连接在醛官能玻璃上的胺化DNA。作者们总结出，通过偶联产率和不存在偶联剂时的反应速率测得，将胺化DNA固定在醛改性的表面是构筑DNA显微阵列最好的偶联方法。
然而，醛官能基片与胺化探针的反应虽然有效，但具有这一缺点，即，需要额外的还原步骤来稳定形成的碳-氮键。虽然醛基和氨基之间的初始反应生成亚氨基(包含C＝N双键)，它使探针牢固地连接到表面，但该反应在显微阵列应用时经历的很多条件下是可逆的。因此，在进一步的步骤中必须将亚氨基还原成氨基(包括更有耐性的C-N单键)从而将探针以共价键更不可逆地连接在基片上。又一个问题是，典型的醛官能团在长期贮存和应用的基片上不够稳定。所以，醛官能化基片需要多个处理步骤，而且在稳定性与接枝探针和提供抗性基片所需的反应性之间不具有最恰当的平衡。仍需要改良的结合体系。
现有显微阵列还存在很多其它问题。难于获得具有提高的功能和/或活性位点密度和/或接枝密度的显微阵列。还希望显微阵列应当每单位面积具有尽可能多的探针而改善显微阵列的灵敏度。还重要的是，基片上的活性位点和/或官能度以可重现的和适应性强的方式获得。
不想受任何机理的限制，我们认为，解决上述一些或全部问题的的方法可能是，提供一种官能化基片，它能与同它接触的探针足够迅速地发生化学反应，于是，在其中应用探针的载体介质有时间干燥以前足够迅速地在探针与基片之间形成一种键(优选是共价键)。在载体介质的微小液滴中将探针应用于表面时，该问题是一个特殊的问题，因为这些液滴很迅速地干燥。在基片应用期间经历的条件下，合适的基片应当与探针以基本上不可逆的方式反应。
可任选通过本发明解决的又一个问题是提供在探针(例如，现今应用的典型DNA探针)的化学和基片的化学之间的正确结合，于是有可能将它们二者官能化。本发明解决的另一个任选的问题是提供官能化和/或活性基片，它在正常贮存条件下，在初步处理步骤中和/或在探针结合前的环境中都保持稳定。所以，不容易发现这种基片，它在对探针的高活性与贮存和应用期间的稳定性之间具有合适的平衡。因此，本发明另一个任选的目的是，提供具有基片的显微阵列，所述基片的一个表面可通过共价键牢固地结合探针，而且它在连接探针之前和以后两种情况下、在贮存和应用的条件下是稳定的。如果通过已知方法生产这样的基片，对于可应用的基片材料有严格限制，因为不是所有的方法都与所有的基片匹配。目前应用的大多数显微阵列是由玻璃基片制造的。虽然玻璃具有很多有利的性能，但它也具有缺点，例如，玻璃不容易以任何要求的形状生产。需要比玻璃具有更宽性能范围的基片来开发例如集成化芯片基实验(lab-on-a-chip)和/或用于显微流体技术。聚合物是这类用途的优选基片，因为它们容易被加工成任何所需的形状(例如，通过模制)。因此，任选还希望提供一种适用非玻璃基片的方法，因为这将获得改善的显微阵列。所以，本发明另一个任选的目的是，提供具有本文所述的关于聚合物基片的一些或全部优点的显微阵列。
本发明又一个任选的目的是提供这样的显微阵列，其中，连接的(任选DNA)探针的密度(即，接枝密度)很高。本发明还有一个任选的目的是提供这类基片，即，具有提高的接枝密度(它是以可再现的方式获得的)，而且可轻易按用户需要来修饰。官能化和/或活性基片还可用于显微流体系统，于是，本发明又一个任选的目的是，提供适合这样的系统的基片。
因此，本发明最宽范围的一个目的是，解决与现有技术显微阵列有关的前述的一些或全部问题。
所以，按本发明，提供了一种制备在其上具有对分子探针活性基呈活性的位点的基片的方法，该方法包括如下步骤，对所述基片表面施用一种物质，该物质包含一个或多个式I的具有活化乙烯基不饱和双键的活性位点 式I其中，如果n＝0，m＝1，X3是碳且X1是氮，它们之间的键就是三键，而且R4不存在；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它们之间的键就是双键，而且X2是被一个有机取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1或2，X3是硫且X1是氧，它们之间的键就是双键，而且X2是被一个有机取代基取代的氮；R1，R2，各自独立表示氢，羟基或有机基，R3和R4各自独立表示氢或有机基，最后含一个硅原子，R1和R2不与R4连接。
随后，在进一步中，将分子探针的活性基与具有式I的活性位点的活化乙烯基不饱和双键共价结合。
按本发明，位于基片上的活性位点和分子探针之间的连接反应具有下列特征的至少一个(i)连接反应足够快，于是反应在应用的操作条件下基本上完全；(ii)该反应在一个步骤中在物质和基片之间形成牢固的结合键；和/或(iii)物质和基片之间的连接在基片的应用条件下基本上不可逆。
用于本文的“活性基片”表示一种基片，它具有位于它表面的、有效浓度的式I游离活性位点。
任选地，所述基片适用于多反应体系，例如，显微阵列。
本文应用的分子探针表示例如生物分子这样的探针，例如，DNA、RNA、蛋白质、生物素、毒素、除草剂、杀虫剂、碳水化合物、药物靶、抗生素、细胞毒物、类固醇、肽、核苷酸、肽核酸、结合配偶体、半抗原等。在本发明一个实施方案中，在多反应体系中应用的最终探针可能包含一种或多种不同的其它物质，它们以顺序方式(例如，在链中)与结合到基片活性位点上的第一种探针连接。这样，具有任何所需性能的探针即使不适合(和/或不能被修饰而适合)直接连接到基片上的活性位点上，也可以使用。
任选地，所述载体介质是一种流体，例如，一种可在其中分散分子探针的液体。
优选地，所述流体和/或物质呈液滴形式应用，更优选通过直接方法，例如，显微点样和/或喷墨印刷(例如，感热式和/或压电式(piezo)喷墨印刷，例如，压电)，例如采用的平均液滴体积为一毫微升或更小。
任选地，所述连接反应以足够迅速的方式发生，所以，在载体流体从其中蒸发以前(例如，当该载体流体作为液滴应用时)，反应基本上完全。
本文应用的术语“牢固地连接的”表示，在显微阵列和/或基片将被应用的条件下(以及与其它试剂一起)基本上抗脱除。优选地，这说明通过一个共价键将分子探针连接到活性位点上；更优选每个活性位点借助于平均至少一个共价键与探针连接。更优选的是，这样形成的键在显微阵列的应用条件下基本上是不可逆的和/或是通过基本上不可逆的反应形成的。优选的共价键是碳-碳键和/或碳-氮键，而且更优选是饱和键，例如，C-N单键。
所述活性位点对于基片表面自身来说可能是固有的，此时，在本发明的方法中应用基片时可能不需预处理。备选地，或者以及，活性位点可呈另一种物质的形式添加，该物质包含这样的活性位点，而且它例如作为涂层被加到基片上。利用具有活性位点的物质的优点在于，这允许更宽范围地选择基础支持基片。
因此优选地，所述方法进一步包括将一种物质施用和固定到基片上的步骤，所述物质包含活性位点。更优选地，该物质是涂料组合物和/或一种凝胶。优选地，所述物质是可聚合的，所以，有一个在基片上就地聚合该物质而在其上形成涂层的步骤。更优选地，所述涂层包含经受了聚合过程的活性位点，最优选的是，以足够的浓度将分子探针牢固地连接到它上面而足够用于多反应体系(例如，显微阵列)。
本发明还包括那些适合在本发明方法中处理的基片，这样的基片包括在其上具有内在的活性位点的那些基片和/或其上包含一种包含活性位点的物质的那些基片。
还应懂得，本文应用的基片表示任何合适的载体并且可能包含能负载与之结合的物质(如本文所述)的任何合适的物质，而且可能是任意合适的形状，例如，平的、粗糙的和/或弯曲的。这样的载体可以是例如，膜、微孔(microwels)、多孔板、离心管、胶片、显微镜载片。
本发明的基片可以是二维的，例如，大致平面自身支持片的表面。然而，也可应用其它合适的非平面基片，例如，包括2-D外表面的那些基片和/或处于任意适当材料的物品上的它们的部分。
所述基片还可以是三维的，此时，应认为表面是任何暴露的表面，不论处于物品和/或其部分的空腔的外部和/或内部，例如，多孔性物质的物品和/或其上具有多孔表层的物品(例如，烧结的玻璃)。多孔性应当是这样的，物品容易被合适的载体组合物(如本文所述)浸渍而使其暴露的表面(包括空腔和/或间隙内的那些表面)官能化。可应用的其它3-D基片包括呈这种物理形式的物质(作为基片本身和/或作为其上的表层)，即，它是高度疏松的和/或高表面积的，例如，具有作为分散相的气体的分散液，例如，水凝胶和/或气凝胶。就3-D基片来说，优选的是，应当测定每单位体积或每单位表面积的接枝密度(通过任何合适的技术测定的，例如解吸)而不是外表面积的单位。
如本文所述希望的平行操作可按很多方式实现。本文应用的术语“多反应体系”广义上表示这样的任何体系，它提供一系列很多活性位点，它们可被平行处理而且例如可用于同时进行大量通常化学上相似的反应(例如，大量平行的体系)。所以，广义上一个多反应体系包括至少两个不同类的下述体系。应懂得，在本发明最宽广的方面，如本文应用的术语“显微阵列”在适当时可由术语“多反应体系”代替。广义说来，相同的制备技术和化学(例如，本文参照本发明的显微阵列描述的那些)可用于本发明的任何多反应体系，本领域技术人员将懂得进行任何必要的修饰。
第一类本发明的多反应体系包括，作为单个装置(例如，显微阵列)的一部分的官能化基片，它例如包括其上大量独立的但共同参与的(co-joined)和/或邻近的位点(它们可能是多官能的，和/或不同官能化的和/或花样的)。可从它的呈一定形式(例如，呈阵列形式)的位置获得关于位点性能的信息。这类体系的一个具体实例是一块平的平面薄片(例如，玻璃的或聚合物载片)，它的表面上包括网格状不同的位点，其上以预先排列的形式固定了探针。靶物质就可暴露于整个网格。
本发明的多反应体系还可包括第二种类型，其中，该体系包含和/或由一系列很多(优选是小的或微小尺寸的)官能化基片(任选非平面表面官能化物质)构成，它们各自(和/或它们的组)可能由于活性位点和/或探针和/或特定的组合和/或其混合物的性质不同而有差异地与环境起反应。例如，虽然每种(或每组)基片各不相同，但每种基片可能只包括一类位点和其上固定的探针(均匀活性的)。信息可来自统计分析和/或离析具有选定的特性的物质(例如，具有某些特性的物质的数量和/或分布是可以测定的和/或可以收集到的)。这样的基片混合物可通过就地制备而一起生成和/或可能包括很多分别制备的基片(随后在应用前按要求的比率将它们一起混合)。
因此，多反应体系的用途在于，它们包含很多组分，这些组分与它们的环境有差异地相互作用，从而允许基本同时地(平行地)进行许多试验。如上所述，这可通过两类体系实现，例如通过在其上一定的位置具有不同特性的显微阵列和/或通过一组官能化物质，各个物质一致地在其上官能化但各个物质具有不同的特性。
显微阵列可从包括和/或应用于基片表面的物质(例如，涂料或凝胶)制备，所述物质包含活性位点。随后可通过合适的反应将包含可与所述活性位点反应的化学基的有机探针同所述物质牢固地连接(优选以共价键连接)。优选的是，将所述物质在它连接的基片上(或者它形成的基片上)就地聚合，这样，聚合后足够多的活性位点保持牢固地连接有机探针。还可能，所述物质包括包含所述活性位点的分子。该物质还可被接枝到基片上和/或可形成部分基片表面(即，基片本来包含活性位点而不需进一步涂布)。
还可能在基片上具有活性位点，它们能与多官能的(优选二官能的)连接物质反应而在相同的位置生成另一种与第一种相同或不同的活性位点。例如，基片上的羟基官能位点可与异氰酸根合(甲基)丙烯酸酯的异氰酸基反应而给出新的活性位点，其上具有游离的(甲基)丙烯酸酯部分，通过连接基氨基甲酸酯(甲基)丙烯酸酯连接到基片表面。以这种方式官能化的基片也构成本发明而且也可如本文所述应用。
有利地，首先用含活化不饱和部分的可聚合组合物涂布基片。第二步，按让活化不饱和部分保持在涂层上的方式使涂层聚合。第三步，通过加成反应使涂布的基片与包含对活化乙烯基不饱和双键呈活性的基的有机探针反应。
本发明又一方面提供了一个多反应体系，它包含一种或多种如本文所述的官能化基片，基片上放置有分子探针。
本发明的进一步方面提供了一种应用多反应体系的方法，该方法包括这一步骤，即，对一种或多种如本文所述的本发明官能化基片施用任选分散于一种或多种载体介质中的靶分子。
所述靶可用来提供关于该靶和/或分散它的介质和/或所述多反应体系所接触的和/或已经接触的环境的信息。
优选地，如果所述多反应体系包含单一基片(例如，显微阵列)，活化不饱和部分和/或它(们)的补体以预定的形式(例如，2-D格栅)淀积在其上。
如本文所述获得的和/或可获得的多反应体系(例如，显微阵列)可用来测定关于同牢固地连接到如本文所述基片的那些互补的有机分子的信息(例如，结构，浓度和/或任何其它有用的化学的、生化的和/或生物的信息)。显微阵列还可用来优选与显微阵列所接触的液体中一种或多种选定的物质结合。这将会适用于例如需要钝化或靶向生物活性物质时(例如，如果探针包含生物活性抗体)。
本发明其它非限制性的实施方案(除本文其它地方描述的以外)包括，本发明的基片和/或多反应体系在下列任何和/或全部应用领域(包括其任意可能的组合)中的应用本发明的基片被用于这样的用途，例如，cDNA和寡核苷酸芯片，生物化学免疫测定，蛋白质组(proteonomics)，基因表达，药物靶鉴定，药物基因组(pharmacogenomics)，药物/毒素活性预测(predection)，治疗靶的发现和改良的医学处置，生物样品分析，蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质药物靶的化学实体的筛选。
其它用途是下列物质的检测和/或分析(分析它们的存在和/或浓度)杂质、污染物、反应副产物、微生物区系、小型动物区系、病原体和/或不需要的成分。例如在食品中，可能需要检测例如牛奶或肉中的下列物质，例如，基因修饰的物质、抗生素和/或激素。所以，本发明可用来提供对产品改良的质量控制和/或成分标记。
其它用途还有，适用于动物和/或人体中生物的，药物的和/或兽医的状况(例如，疾病和/或障碍)的检测和/或试验；和/或提供诊断工具，治疗，疗法和/或其预防；和/或适用于任何其它药物的和/或兽医的应用，例如，DNA-RNA和/或RNA-肽作用研究。
本发明另一方面可能提供一种制备基片的方法，其中，可用包含一个或多个活化不饱和部分的可聚合组合物涂布一种基片；然后可按让活化不饱和部分保持在涂层上的方式使涂料聚合；以及在又一个步骤中，涂布的基片就可通过加成反应而与包含对所述活化不饱和部分呈活性的基的有机探针反应。
本发明又一方面可能提供一种制备显微阵列的方法，其中，可将涂布组合物淀积在一种基片表面；然后可就地聚合而在其上形成一涂层，它在聚合后包含活化不饱和部分；随后可通过加成反应将包含对所述活化不饱和部分呈活性的化学基的有机探针共价结合到基片上。
本发明又一方面可能提供一种基片，它包含通过活化不饱和加成反应牢固地连接到它表面的有机探针，该有机探针以一定的形式和/或显微阵列形式排列在和/或置于它上面。在本说明书中，术语“活化不饱和部分”被用来表示一种物质，它包含与至少一个活化部分化学邻近的至少一个不饱和碳碳双键。该物质由式I表示。优选地，所述活化部分包括任意基，该基通过合适的亲电基活化其上的乙烯基不饱和双键而加成。适宜的活化部分包括氧，硫，(任选有机取代的)氨基，硫代羰基和/或羰基(后两种基任选被硫、氧或(任选有机取代的)氨基取代)。它们还包括磺酰胺、砜和亚砜基。更适宜的活化部分是(硫代)醚、(硫代)酯和/或(硫代)酰胺部分。最适宜的“活化不饱和部分”包括一个“不饱和酯部分”，它表示一种有机活性种，该活性种包含一个或多个“烯化烃基(硫代)羰基(硫代)氧基”和/或一个或多个“烯化烃基(硫代)-羰基(有机)氨基”和/或类似的和/或衍生的部分，例如，包括(甲基)丙烯酸酯官能团和/或其衍生物的部分。“不饱和酯部分”可任选包括任选取代的普通α，β-不饱和酸、酯和/或它们的其它衍生物，包括硫代衍生物及其类似物。
所述活化不饱和部分是式1表示的那些
式1其中，如果n＝0，m＝1，X3是碳且X1是氮，它们之间的键就是三键，而且R不存在；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它们之间的键就是双键，而且X2是被一个有机取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它们之间的键就是双键，而且X2是被一个有机取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1或2，X1是硫且X1是氧，它们之间的键就是双键，而且X2是被一个有机取代基取代的氮；R1，R2，各自独立表示氢，羟基或有机基，R3和R4各自独立表示氢或有机基，最后含一个硅原子，R1和R2不与R4连接。
应懂得，本文的式1可表示独立的化学物质(例如，一种化合物、离子、自由基、低聚物和/或聚合物)和/或其任意部分。所以，式1还可表示多价(优选二价)自由基。于是，本文关于R1，R2，R3，R4和R5给定的选择在适当时还包括相应的二价或多价自由基。
更优选的式1部分(包括它们的异构体和混合物)是那些，其中，n是1；X1是O；X2是O，S或NR5；X3是碳。
R1，R2，R3和R4独立地选自H，任选的取代基和任选取代的C1-10氢碳基(hydrocarbo)，其中，R5选自H和任选取代的C1-10氢碳基。
最优选的是，n是1；X1是O；X2是O或S；X3是碳，而且R1，R2，R3和R4独立是H，羟基和/或任选取代的C1-6烃基。R4还可表示C1-6烃基烷氧基硅烷。
例如，n是1；X1和X2都是O；而且R1，R2，R3和R4独立是H、OH和/或C1-4烷基或R4是C1-4烷基硅烷。
至于式1部分，其中，n是1而且X1和X2都是O并且X3是碳，那么当(R1和R2)之一是H且R3也是H时，式1表示一个丙烯酸酯部分，它包括丙烯酸酯(当R1和R2都是H时)及其衍生物(当R1或R2不是H时)。同样，当(R1和R2)之一是H而且R3是CH3时，式1表示一个甲基丙烯酸酯部分，它包括甲基丙烯酸酯(当R1和R2都是H时)及其衍生物(当R1或R2不是H时)。式1的丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯部分是特别优选的。
式1适宜的部分是那些，其中，n＝1；X1& X2＝O，X3是碳；R1和R2独立是H，甲基或OH，而且R3是H或CH3。
式1最适宜的部分是那些，其中，n＝1；X1& X2＝O，X3是碳；R1是OH，R2是CH3，而且R3是H，和/或其互变异构体(例如，乙酰乙酸基官能团)。
最适宜的不饱和酯部分选自-OCO-CH＝CH2；-OCO-C(CH3)＝CH2；乙酰乙酸基，-OCOCH＝C(CH3)(OH)及其全部合适的互变异构体。应懂得，式1表示的任何合适的部分在本发明含义中都可以用，例如，其它活性部分。
本文应用的术语“任选的取代基”和/或“任选取代的”(除非后面是其它取代基的清单)表示下列基的一种或多种(或者被这些基取代)羧基、磺基、甲酰、羟基、氨基、亚氨基、次氮基、巯基、氰基、硝基、甲基、甲氧基和/或它们的组合。这些任选的基包括，很多(优选两个)前述基的相同部分的所有化学上可能的组合(例如，氨基和磺酰基如果彼此直接连接，就表示氨磺酰基)。优选的任选的取代基包括羧基、磺基、羟基、氨基、巯基、氰基、甲基和/或甲氧基。
如本文应用的术语“有机取代基”或“有机基”(本文还缩写为“有机的”)表示任何一价的或多价的部分(任选与一个或多个其它部分连接)，它包含一个或多个碳原子和任选一个或多个其它杂原子。有机基可包括有机杂原子基(organoheteryl groups)(也称为有机元素基)，它们包括一价含碳基，所以它们是有机的，但它们在非碳原子上具有游离价键(例如，有机硫基)。有机基可备选地或另外地包括有机基(organyl groups)，它们包含任意有机取代基，不管官能型如何，在碳原子上具有一个游离价键。有机基还可包括杂环基，它们包括通过从杂环化合物(一种环状化合物，它具有作为环节的至少两种不同元素的原子，此时一种原子是碳)的任意环原子上除去一个氢原子而形成的一价基。优选地，本文的有机基中的非碳原子可选自氢、磷、氮、氧、硅和/或硫，更优选选自氢、氮、氧、磷和/或硅。
最优选的有机基包括一个或多个下列含碳部分烷基，烷氧基，烷酰基，羧基，羰基，甲酰和/或其组合；任选与一个或多个下列含杂原子部分组合氧，硫，亚磺酰，磺酰，氨基，亚氨基，次氮基和/或其组合。有机基包括，很多(优选两个)前述含碳和/或含杂原子部分的相同部分中的所有化学上可能的组合(例如，烷氧基和羰基如果彼此直接连接，就表示烷氧羰基)。如本文应用的术语“氢碳基(hydrocarbogroup)”是有机基的一个亚组并且表示任何一价或多价部分(任选与一个或多个其它部分连接)，它由一个或多个氢原子和一个或多个碳原子构成而且可包括饱和的、不饱和的和/或芳族的部分。氢碳基可包括下列基中的一个或多个。烃基，包括通过除去烃中的一个氢原子而形成的一价基。亚烃基，包括通过除去烃中的两个氢原子而形成的二价基，它的游离价键不参与双键。烯化烃基(hydrocarbylidene groups)，包括通过除去烃中相同碳原子上的两个氢原子而形成的二价基(由“R2C＝”表示)，它的游离价键参与双键。次烃基，包括三价基(由“RC≡”表示)，是通过除去烃中相同碳原子上的三个氢原子而形成的，它的游离价键参与叁键。氢碳基还可能包括饱和碳碳单键；不饱和碳碳双键和/或三键(例如，分别是烯基和/或炔基)和/或芳族基(例如，芳基)而且当有指明之时可被其它官能团取代的基。
适当时和除非文中另外清楚地指出，如本文应用的术语“烷基”或其等同术语(例如“烷”)可轻易被包括下列基的术语替代，即，任何其它氢碳基，例如本文描述的那些(例如，包括双键，三键，芳族部分(例如，分别是烯基，炔基和/或芳基)和/或其组合(例如，芳烷基)以及连接两个或多个部分的任何多价氢碳基(例如，二价亚烃基，例如，亚烷基)。
除非另外说明或文中另外清楚地指出，本文所述任何自由基或部分(例如，作为取代基)可能是多价的或一价的自由基(例如，连接两个其它部分的二价亚烃基部分)。然而，本文指出的这类一价基或多价基还可包括任选的取代基。一个包含三个或更多个原子的链的基表示一个这样的基，其中，整条链或部分链可能是线形的、支化的和/或形成一个环(包括螺环和/或稠合环)。对某些取代基规定了某些原子的总数，例如，C1-N有机基，表示有机部分含1～N个碳原子。在本文的任何式中，如果没有指出一个或多个取代基连接到某部分的任意特定原子上(例如，在沿链和/或环的特定位置上)，该取代基就可替代任何H和/或可位于化学上适合的或有效的部分上的任意可提供的位置。
优选的是，本文列出的任何有机基包含1～36个碳原子，更优选1～18个。特别优选的是，有机基中的碳原子数是1～10个，尤其1～4个(含端值)。
如本文应用的化学术语(除了关于特别标记的化合物的IUPAC名称)，它们包括括号中给出的特征-例如，(烷基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸酯和/或(共聚)聚合物-表示括号内的部分是随含义指示任选的，所以，例如，术语(甲基)丙烯酸酯表示甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯这两者。
除非文中另外清楚地指出，如本文应用的很多术语形式都应认为包括单数形式，反之亦然。
如本文应用的术语“包括”应理解为，表示随后列出的不是穷举的而且可能包括或者可能不包括任何其它另外合适的项目，例如，一个或多个另外的特征、组分、成分和/或合适的替代物。
术语“有效的”(例如，参照方法、用途、产品、原料、化合物、单体、低聚物、本发明的聚合物母体和/或聚合物)应理解为表示在下列应用和/或用途的任一项或多项中的适用性显微阵列装置和/或其部件例如，官能化基片(优选为了化学分析和/或合成)的制备和/或应用，和/或从它直接和/或间接获得的产物和/或结果的应用；和/或本文描述的任何其它应用。
这样的适用性可能是直接的(此时某物质具有前述应用的所需性能)和/或是间接的(此时某物质具有作为合成中间体的应用)和/或是制备直接有用的物质中的检定工具。如本文应用的术语“合适的”表示一个官能团适合于生产一种有效的产品。可以选定重复单元中的取代基以改善某些物质与聚合物和/或树脂(其中，可能为了前述应用而配制和/或掺和它们)的相容性。于是，可选定取代基的尺寸和长度而优化与树脂的物理缠结或内在位置或者它们可能包括或可能不包括其它能与这样的其它树脂进行化学反应和/或交联的活性体。
某些部分、物质、基、重复单元、化合物、低聚物、聚合物、原料、混合物、组合物和/或配方，它们包括和/或被用于某些或全部本文描述的本发明，可能以一种或多种不同的形式存在，例如，下列非穷举的那些的任意形式立体异构体(例如，对映体(例如，E和/或Z型)，非对映异构体和/或几何异构体)；互变异构体(例如，酮和/或烯醇形式)，构象异构体，盐，两性离子，络合物(例如，螯合物，笼形化合物，填隙化合物，配体络合物，有机金属络合物，非化学计量络合物，溶剂合物和/或水合物)；同位素替代的形式，聚合构型[例如，均聚物或共聚物，无规、接枝或嵌段聚合物，线形或支化的聚合物(例如，星型和/或侧链支化的)，交联的和/或网状的聚合物，可从二价和/或三价重复单元获得的聚合物，树枝状聚合物，不同立构规整性的聚合物(例如，全同立构的、间同立构的或无规立构的聚合物)]；多形物(例如，填隙形，晶型和/或无定形)，不同的相，固溶体；它们的组合和/或其混合物。本发明包括和/或应用有效的所有这些形式。
本发明的一个特征是一层涂层，它里面携带活化不饱和部分而将DNA和/或其它生物分子结合到基片上。从实际前景来看，存在很多方法来增大涂层中活化不饱和部分的量。按本发明，在涂层表面能达到这样的作用的所有工艺和方法都是合适的。
现在描述两种方法，它们优选用作、用于本发明和/或与本发明一起使用以获得含游离活化不饱和部分的涂料。
在这些方法之一中，用作、用于本发明和/或与本发明一起应用的涂料是从含一种或多种聚合物母体(它(们)包含作为唯一可聚合基的活化不饱和部分)的组合物获得的和/或可获得的。所述聚合物母体可能含任意单体、低聚物和/或预聚物(单独的和/或呈掺和物)。可按任何合适的方法固化这些组合物，它给出包含足够数量游离的(即，活性的)活化不饱和部分而适用作官能化涂料的聚合物。
可用来制备用作、用于本发明和/或与本发明一起作用的涂料的一种备选方法包括聚合物母体，它(们)包含的官能团能与含活化不饱和部分(例如，(甲基)丙烯酸酯部分)的化合物的另一种官能团反应。例如，一种含羟基的聚合物母体可与丙烯酰氯反应，或者一种含羧酸基的聚合物母体可与(甲基)丙烯酸缩水甘油酯反应。合作为唯一化学上可聚合部分的(甲基)丙烯酸酯部分的聚合物母体还可按一定的方式固化而在聚合后给出含游离(甲基)丙烯酸酯部分的聚合物。
很多不同的聚合物适合作为用作、用于本发明和/或本发明一起作用的聚合物母体和/或聚合物涂料，例如，任何下列聚合物和/或它们的任意混合物，它们的共聚物和/或相同物质中它们的组合体聚氨酯(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸(甲基)丙烯酸酯，聚酯(甲基)丙烯酸酯，环氧(甲基)丙烯酸酯，树枝状和/或超支化聚酯(甲基)丙烯酸酯和/或聚氨酯丙烯酸酯，聚硅氧烷(甲基)丙烯酸酯和/或(甲基)丙烯酸酯的胺。
能生产合适的聚合物(例如，本文描述的那些)的组合物是本领域熟知的那些任意组合物，它们优选属于技术领域中称为辐射可固化的(辐射固化)组合物。有效的组合物可呈任何合适的物理状态和/或形式存在，例如，分散液，溶液和/或乳液，例如，以水和/或有机溶剂为连续相；和/或没有任何水或有机溶剂的组合物(例如，聚合物母体的混合物和/或固溶体)。乳液可包含任意合适的连续相(例如，油包水(W/O)，水包油(O/W)乳液)，而分散相还可任选包含乳液(例如，水包油包水(W/O/W)和/或油包水包油(O/W/O)乳液)。
其它合适的聚合物和/或组合物包括如下文献中列出的那些“表面涂料技术”，Vol.II-预聚物和活性稀释剂-Chemistry &Technology of UV and EB Formulations for Coatings，Inks andPaints，G.Webster编辑，由Wiley出版(1997)。
可通过任意合适的可被用来获得用作、用于本发明和/或本发明一起使用的聚合物涂料的方法引发聚合，例如，含游离活化不饱和部分的那些涂料。有两种优选的聚合引发方法，即，热引发和/或通过辐射(例如，UV或电子束辐射)。适合热聚合的组合物可能包含热引发剂。聚合还可在紫外线辐射下发生，于是通常在组合物中存在一种光敏引发剂而有助于聚合。还可应用电子束辐射。
残余未反应的游离活化不饱和部分(例如，游离(甲基)丙烯酸酯)的量可通过聚合条件来调节，例如，温度，辐射剂量，引发剂的类别和量等，例如下列文献中所述超速光聚合反应的动力学研究，C.Decker，B.Elzaouk，D.Decker，J.M.S.-Pure Appl.Chem.，A(33)，pp.173～1790(1996)。
可用来制备本发明的基片的另一条途径应用的涂料组合物包含单独的或呈掺和物的任意聚合物母体(例如，单体、低聚物和/或预聚物)，它的至少一种包含至少一种能加聚的化学活性基。活化不饱和部分还可存在于这些聚合物母体的至少一种中。备选地，包含能加聚的化学活性基的聚合物母体可反应而生成这样的聚合物母体，即，大致不含(甲基)丙烯酸酯部分，但是仍包含可随后与其它活化不饱和部分反应的活性基。
例如，聚氨酯聚合物(例如，溶于溶剂中和/或呈水分散液的那些)可通过多元醇与多异氰酸酯反应而制备。所以，游离(甲基)丙烯酸酯部分可作为(甲基)丙烯酸酯的醇和/或(甲基)丙烯酸酯的多元醇掺入聚合物，例如，通过异氰酸酯末端的聚合物母体的封端(它任选可能是全部或部分地链增长的)和/或作为聚合物母体自身的组分(它也任选可能是全部或部分地链增长的)。
本文描述的相同和/或相似的方法可用来制备含很多(甲基)丙烯酸酯部分的树枝状和/或超支化的羟基化合物(例如，醇和/或多元醇)。这样的羟基化合物掺入聚氨酯可生产具有高浓度游离(甲基)丙烯酸酯部分的涂料。
在本发明一个实施方案中，如果R4表示含取代基的烷氧基或卤代硅，式I的不饱和活化部分可直接结合到载体上。
为此，必须选定具有羟基的载体，例如，玻璃或硅片。羟基或卤硅烷基与载体表面存在的羟基反应，将活化不饱和部分直接结合到载体上。
本文所述本发明的任意合适的基片可用来制备本发明的显微阵列。优选的基片包括玻璃和/或塑料，例如，聚碳酸酯(PC)，聚酯(PE)，聚烯烃(例如，聚丙烯(PP))，聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，尼龙，聚苯乙烯，环烯烃共聚物(COC)和/或活化纤维素或其混合物。任选地，这样的基片可被预处理(例如，通过用高压电晕放电处理)以便促进粘合，然后就可如本文所述处理。
优选的分子探针包含一个或多个不同的羟基和/或氨基，更优选是氨基。
不想受任何机理的束缚，我们认为，所述探针包含化学基，它们容易以共价键与活化不饱和部分结合(优选通过加成反应)。如果活化不饱和部分包括不饱和酯，合适的加成反应可包括人们熟知的迈克尔加成反应。优选地，这类反应在显微阵列的生产过程中在室温下进行。更优选地，该反应在例如淀积在基片上的含氨基的物质与官能化基片表面可利用的不饱和酯部分(例如，含(甲基)丙烯酸酯部分的那些)的不饱和(烯化烃基)之间进行。
优选的有机探针是生物分子，更优选是DNA，最优选是含氨基的那些。氨基是常见于生物分子中的普遍的活性基。在本发明方法的一个实例中，可通过任意合适的方法(例如，显微点样和/或喷墨印刷)将胺终端的DNA序列淀积在基片上而与基片上以预定的形式排列的(例如，显微阵列)不饱和(甲基)丙烯酸酯部分反应。
本发明的主要优点包括下列的任意和/或全部任何基片都可利用适当地配制的适用于DNA生物芯片和/或相似用途的涂料来处理。
可实现高丙烯酸酯密度从而产生相应的每单位面积探针的高密度。
丙烯酸酯部分的反应性在基片上探针的迅速固定化的竞争要求与官能化基片的良好贮存性能之间提供了良好的平衡。
与醛官能化基片(被认为是目前可利用的最佳官能化基片)相比，应用普及的送递技术生产合适的官能化基片需要的操作步骤减少了，本发明的丙烯酸酯官能化基片取消了还原步骤但具有可比的(如果不是更好的)反应性。
本文应用的方法适合很多材料，所以减少了以前关于显微阵列的设计限制并且促进集成化芯片基实验系统的生产。
本发明的官能化基片具有良好的化学和/或机械抗性-特别是当应用辐射可固化原料时。更具体地说，当辐射可固化原料用于金属表面(例如，见于CD-ROM的银表面)时，有可能配制涂料而将它良好的粘合特性与基础金属层很好的耐腐蚀性结合。
本文还没有描述的本发明其它方面和/或优选的特征给出于权利要求书中。
可通过后面的附图阐述本发明，其中
图1是关于本发明基片的DNA接枝效率对游离丙烯酸酯官能度的曲线图；以及图2是在本文描述的各种固定化和杂交试验中测试的本发明显微阵列的图。
现在将通过如下非限制性的实施例和试验(它们只是阐述性的)阐述本发明。这些实施例包括两类配方(热固化的或通过辐射固化的)，它们阐明和评价了某些用于显微阵列(例如生物芯片)的丙烯酸化基片。在这些实施例中，分别描述了制备基片的操作方法，利用结果来评价基片。在本文的实施例中NCO值或浓度(本文还以INCO表示)可利用任意合适的标准方法(例如，ASTM D2572-87中描述的方法)测定；羟基值或浓度(本文还以IOH表示)可利用任意合适的标准方法(例如，E222-73中描述的方法)测定；酸值或浓度(本文还以IH+表示)可利用任意合适的标准方法(例如，ASTM D 974-64中描述的方法)测定；和/或游离丙烯酸值或浓度(本文还以IACR表示)可利用本领域技术人员已知的任意合适的标准方法来测定。
基片制备涂料聚合物母体的合成实施例1羟基官能的氨基甲酸酯丙烯酸酯的合成将444g量的预热的5-异氰酸根合-1-异氰酸根合甲基-1，3，3-三甲基环己烷(也称为IPDI，可从Degussa-Huels，Germany商购)导入一个装有搅拌器、温度计、水冷却的冷凝器和滴液漏斗的2升四颈圆底烧瓶。在45℃下加热混合物，然后添加0.37g作为催化剂的二月桂酸二丁基锡(也称为DBTL，可从Akcros商购)。从滴液漏斗缓慢地添加232g丙烯酸羟乙酯和0.925g氢醌一甲基醚，同时将反应混合物的温度保持在65℃的极大值。在该温度下将混合物保持一小时直到INCO达到2.96meq/g。然后添加250g二-三羟甲基丙烷(IOH为898mgKOH/g)，同时在65℃下进一步加热反应物直到INCO降到低于0.05meq/g。在40℃下冷却低聚物，用927g乙酸丁酯稀释而获得产物氨基甲酸酯丙烯酸酯的50％有机溶液，具有在25℃下135mPas的粘度，IOH为60mg KOH/g和1.078meq/g游离丙烯酸酯(固体产物的IOH是121mg KOH/g)。该氨基甲酸酯丙烯酸酯的分散液被直接用于下述配方。
实施例2多元醇的合成在一个装有搅拌器、填充柱、冷凝器、温度计和惰性气体入口的三升反应器中混合1，6-己二醇(1,144.2g)和己二酸(1,135.6g)(两者可从BASF商购)与DBTL催化剂(O.02g)。用惰性气体冲洗反应器并将反应物加热到195℃～200℃的温度，同时除去酯化产生的水。反应继续进行5小时直到IH+是5mg KOH/g和IOH是117mg KOH/g，从而获得多元醇产物，它具有1000的Mn和112mg KOH/g的最终IOH。该多元醇被直接用于下述配方。
基片的配方和涂布基片从商品化光盘(可从ISP，Belgium商购的未涂布的无装饰聚碳酸酯CDs)制备了本发明的官能化基片，用绕线棒刮涂器将它们涂布一层本文描述的配制品表层，它在基片上淀积10μm厚的未固化配制品膜。还可应用的其它合适的基片有商品化涂布的聚碳酸酯CDs(可从ISP，Belgium商购)和/或A4尺寸的1mm厚聚碳酸酯片(可从GeneralElectric，USA商购)。然后，按公知的标准方法和阐述本发明的显微阵列特性的方案(例如，丙烯酸酯浓度对接枝能力的影响-见图1)测试本发明的官能化基片。
涂料配方试验了三种配方。两种基于聚合物骨架(辐射固化和热固化)，而一种基于硅烷化学。
辐射固化的配方在下表1中描述了本发明的UV固化配方(实施例3&4)。固化的涂料的游离丙烯酸酯含量来自UV辐射后存在的未反应的不饱和基。下表1中的配方是通过以20m/min的速率穿过80W/cm中压汞灯四次而UV固化的。表1中除光敏引发剂以外的所有组分都以商品名(如果括号中指出)得自UCB Chemicals。
表1
热固化的配方可按本文所述配制宽范围本发明的热固化配方，因为最终基片中所需的游离丙烯酸酯浓度可通过增大或减小配方中的羟基官能氨基甲酸酯丙烯酸酯(例如，实施例1)的浓度来调节。例如，实施例1的氨基甲酸酯丙烯酸酯上两个丙烯酸酯基不参与热引发的聚合反应(交联)而在交联后仍存在。下表2中的配方(实施例5～8)都是在60℃烘箱中热固化3小时。表2中的配方包含9wt％可从Bayer以商品名Desmodur N3300商购的聚脂族异氰酸酯；(91-X)％实施例2的多元醇以及X％实施例1的氨基甲酸酯丙烯酸酯；其中，X的值给出于表2中。
表2
基于硅烷的体系具有活化不饱和部分的表面的活化可通过硅烷化进行。首先在室温下将玻璃载片放入1∶1甲醇∶盐酸溶液中30min清洁载片。然后，用去离子水漂洗载片直到观察不到流层线。清洁后，将载片活化。这是通过将载片浸入(3-丙烯酰氧基丙基)硅烷的10-3摩尔无水甲苯溶液达1小时而完成的。随后将样品浸入新鲜甲苯中在剧烈搅拌下清洗以除去过量的物理吸附的分子，接着在120℃的烘箱中干燥10min。
生物芯片的制备DNA捕获探针的制备用来制备用作本文所述试验中捕获探针的核苷酸的模板DNA序列是巨细胞病毒的那些序列，它们是按Zammateo等在分析生物化学(Analytic Biochem)253，pp180～189(1997)中描述的方法和方案合成的。这样应用的MIE4引物在它的5′端包含一个氨基，扩增子长度为257个碱基对。应用PCR按常规方法扩增DNA序列，然后通过色谱法用高纯PCR产品纯化盒(可从Mannheim，Germany商购)将它们与未结合的核苷酸和引物分离。DNA浓度通过它在260nm处的吸光度测定。将这样获得的胺化DNA捕获探针加到缓冲液中而将探针上的大部分氨基保持在它们的未质子化状态(即，作为NH2)。如下所述将包含DNA探针的缓冲液(本文也称为印刷缓冲液)淀积在显微阵列上。本文应用的不同印刷缓冲液中每一种中的DNA探针浓度都是100nM。
标记的靶DNA的制备还将巨细胞病毒DNA序列(按前述文献中所述制备的)用作靶DNA生产的模板。该靶DNA长度为437个碱基对，在PCR扩增中以1∶1的DNA对标记的摩尔比用生物素-16-dUTP标记该靶DNA。DNA浓度通过它在260nm处的吸光度测定。
制备生物芯片利用显微阵列(可从WOW，Belgium商购)将印刷缓冲液中的DNA捕获探针分散到本发明的官能化树脂基片上。通过合适的方法(例如，喷墨印刷)将该印刷缓冲液的液滴淀积在芯片上而得直径约400μm的点，它们彼此间隔约800μm。在23℃下将生物芯片(即，载有DNA捕获探针的基片)保温一小时，随后用0.2wt％十二烷基硫酸钠(本文也称为SDS，可从Merck商购)水溶液洗涤一次，然后用水洗涤两次。将所述生物芯片在沸水中又保温3分钟以保证单链核苷酸序列牢固地连接到表面。
杂交配制了杂交溶液，它包含溶于0.35M含4％SDS的pH7磷酸盐缓冲液(例如，可从AAT，Belgium商购的缓冲液)浓度为10nM的标记靶DNA(按上述那样制备的)。将该杂交溶液(70μl)加到杂交室(可从MJResearch，MA，USA商购)中。将该室框在显微阵列上，利用盖片密封而使溶液与生物芯片接触，然后加热到50℃达2小时。随后用洗涤液(10mM含0.1％Tween的pH7.5马来酸盐缓冲液)洗涤所述生物芯片四次，接着与链霉抗生物素-金缀合物(可从Sigma，MO，USA商购)一起保温45分钟。然后用相同的洗涤液将生物芯片再洗涤五次，最后在另一保温溶液(可从AAT，Belgium以商品名Silver Blue Solution商购)中保温10分钟。
结果按下述公知的标准方法和方案进行了如本文所述制备的本发明显微阵列的评估，示于图1&2。
图1测试了从本文实施例5～8制备的本发明的官能化基片以阐述丙烯酸酯浓度对接枝能力的影响。将这些结果给出于本文图1中并阐述游离丙烯酸酯含量如何影响DNA接枝效率。
图1的横坐标以meq/g为单位表示分别用实施例5～8中制备的树脂试验的涂料配方中游离丙烯酸酯官能度的浓度。
图1的纵坐标表示以相对DNA表面浓度量度的相对接枝效率。这是通过将各情况下测定的信号强度与关于具有最高游离丙烯酸酯含量(0.98meq/g)的最浓缩的DNA分散液(200nM，实施例8)测定的值进行比较而计算的。所以，纵坐标值被归一化了而无单位。
图1中的三条线相应于关于不同浓度的NH2-DNA探针进行的试验25nM(底线，数据以▲表示)，50nM(中线，数据以◇表示)，以及200nM(上线，数据以■表示)。
这些结果清楚地说明，对于本发明的基片来说，增大游离丙烯酸酯浓度的效果是引起基片接枝效率的相应增大。
图2对A4尺寸的1mm厚聚碳酸酯片(例如，可从General Electric，USA商购的那些)进行了一系列试验，用本文实施例4的配制品涂布聚碳酸酯片(在各不同印刷缓冲液中淀积)。图2示出了从比色显微阵列读出器(可从WOW Belgium商购)获得的显微阵列的图，其中，探针组合物的印刷缓冲液成分和pH如本文所述那样变化。各试验是按标准方法和如本文描述的那样进行的。根据各试验的作用不同地解释了图2中的结果。
在图2中，数字指示的行表示不同的印刷缓冲液，其中“1”表示pH为8的0.1M硼酸盐缓冲液；“2”表示pH为8的0.1M硼酸盐缓冲液，含1M NaCl和1％SDS；“3”表示pH为9的0.1M碳酸盐缓冲液，含0.1％SDS；“4”表示pH为8的0.1M硼酸盐缓冲液，含0.1％SDS；以及“5”表示pH为7的0.1M碳酸盐缓冲液，含0.1％SDS。
在图2中，字母指示的列表示试验的作用，其中“A”(x2)表示固定化对照；“B”(x2)表示负杂交对照；而“C”(x2)表示正杂交控制。下文更详细地描述了这些试验。
得自HIV的DNA序列被用于这些试验。用来制备HIV衍生的捕获探针的引物相应于序列NH2-GAGGAAGCTGCAGAATGGG；以及GGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTG。这些扩增子都是通过利用常规方式的PCR扩增来自HIV的“GAG”基因的247个碱基的DNA而获得的。然后，用“High Pure PCR”纯化盒纯化扩增子并在琼脂糖凝胶上定量分析。随后以在不同印刷缓冲液中300nM的浓度(如本文所述)在本发明的基片上以点的形式淀积捕获探针。
固定化控制(A)设计了该试验而孤立固定化步骤并确定捕获探针已固定在基片上。应用具有生物素标记的捕获探针制备了不同的印刷缓冲液(如本文所述)。正响应在显微阵列上显示为黑点，并且说明标记的捕获探针的存在。
正杂交控制(B)按标准显微阵列操作方法进行了该试验以验证整个系统有效。正响应显示为显微阵列上的黑点，并且说明未标记的捕获探针已连接到基片上，随后通过它们的互补标记的靶序列杂交了。
负杂交控制(C)进行了该试验以检测试验A或B中是否有假的正结果。将与杂交溶液中存在的靶序列都不相应的捕获探针配制入印刷缓冲液，然后通过合适的工具(例如，喷墨印刷机)以点的形式将缓冲液印刷到基片上。该试验完成后，在所述点上不会发生杂交，所以，黑点应当说明有问题，例如，标记的靶序列非特异性结合到设计得差的基片上。
结果的解释从表2中可见，不论印刷缓冲液组成如何(表2中“1”～“5”行)，固定化控制(A)和正杂交控制(B)试验都给出正结果(即，相关栏中的黑点)。所以，涂布了实施例4的基片确实结合了胺化DNA捕获探针而适当地给出起作用的显微阵列(生物芯片)。负杂交控制试验(C)在所有情况下都给出负结果(即，在C栏中没有黑点)，说明涂布了实施例4的官能化基片在该试验中没有给出任何假的正结果。
从图2可见，由于应用的印刷缓冲液不同而引起一些差异，因为出现正结果的黑点形状和尺寸有些变化。这是重要的，因为图像分析软件通常用于读出结果，而点几何结构的变化会改变读出结果。不想受任何机理的限制，我们认为这种变化可能是由于因涂布而导致的表面能的差异。我们认为这可以这样补偿以大致不影响试验的方式改变印刷缓冲液从而避免本发明的显微阵列产生不同形状的点。
本文图1&2给出的结果表明，本文制备的配制品(实施例4～8)可涂在任意合适的基片上而适当地生产起作用显微阵列。
权利要求
1.制备一种在其上具有对分子探针活性基呈活性的位点的基片的方法，该方法包括如下步骤，对所述基片表面施用一种物质，该物质包含一个或多个式I的具有活化乙烯基不饱和双键的活性位点 式I其中，如果n＝0，m＝1，X3是碳且X1是氮，它们之间的键就是三键，而且R4不存在；如果n＝1，m＝1，X3是碳且X1是氧或硫，它们之间的键就是双键，而且X1是被一个有机取代基取代的氧或硫或氮；如果n＝1，m＝1或2，X3是硫且X1是氧，它们之间的键就是双键，而且X1是被一个有机取代基取代的氮；R1，R2各自独立表示氢、羟基或有机基，R3和R4各自独立表示氢或有机基，最终含一个硅原子，R1和R2不与R4连接。随后，在又一步中，将分子探针的活性基共价结合到具有式I的活性位点的活化乙烯基不饱和双键。
2.权利要求1的方法，其中，式I的物质选自下组物质丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯基磺酰胺、乙烯基砜、乙烯基亚砜和C1-4烷基硅烷的丙烯酸酯。
3.前述权利要求任一项的方法，其中，所述基片选自下组材料尼龙、聚苯乙烯、玻璃、硅片、胶乳、聚丙烯、聚碳酸酯和聚酯。
4.前述权利要求任一项的方法，其中，所述分子探针选自下组物质DNA、RNA、生物素、毒素、除草剂、杀虫剂、碳水化合物、药物靶、抗生素、细胞毒物、类固醇、肽、核苷酸、肽核酸、结合配偶体、蛋白质和半抗原。
5.前述权利要求任一项的方法，其中，所述与活性位点的双键反应的分子探针的活性基是氨基。
6.前述权利要求任一项的方法，其中，通过加热或者通过辐射基片使式I的活性位点聚合，以便留下未反应的活化不饱和双键，它们将通过分子探针的活性基进一步反应。
7.前述权利要求任一项的方法，其中，使一种聚合物母体在基片上聚合留下未反应的官能团，使这些官能团与具有可与其反应的基团的式I的活性位点反应而不是与活化不饱和双键反应，所述活化不饱和双键与分子探针的活性基进一步反应。
8.权利要求7的方法，其中，在与分子探针反应以前，所述聚合物选自下列物质聚氨酯(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸(甲基)丙烯酸酯，聚酯(甲基)丙烯酸酯，环氧(甲基)丙烯酸酯，树枝状和/或超支化聚酯(甲基)丙烯酸酯和/或聚氨酯丙烯酸酯，聚硅氧烷(甲基)丙烯酸酯和/或(甲基)丙烯酸酯化的胺。
9.前述权利要求任一项的方法，其中，式I的活性基通过它们与式I的烃基卤代硅烷丙烯酸酯的卤代硅烷基反应而直接连接到携带羟基的基片上，所述活化不饱和双键进一步与分子探针的活性基反应。
10.前述权利要求任一项的制备显微阵列的方法，其中，该显微阵列负载在选自下组的材料上膜、微孔、离心管、胶片和载片。
全文摘要
公开了制备基片I的方法。制备在其上具有对分子探针活性基呈活性的位点的基片的方法，该方法包括如下步骤，对所述基片表面施用一种物质，该物质包含一个或多个式I的具有活化乙烯基不饱和双键的活性位点其中，如果n＝0，m＝1，X
文档编号C12N15/09GK1505544SQ02809106
公开日2004年6月16日 申请日期2002年3月20日 优先权日2001年3月30日
发明者L·林德肯斯, L 林德肯斯, M·泰勒曼斯, 章, S·凯普勒, 绽, J·利麦科勒, 罂评, B·德贝克尔, 纯硕 申请人:Ucb公司