专利名称：一种酵母基因工程菌及β-甘露聚糖酶制剂和甘露低聚糖的生产方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程菌，特别是一种高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌及β-甘露聚糖酶制剂和β-甘露聚糖酶水解制备甘露低聚糖的生产方法。
背景技术：
植物是自然界主要的可再生有机资源，其主要成分是纤维素，半纤维素和木质素。其中纤维素占植物干重的35％，异甘露聚糖作为半纤维素的第二组份，广泛分布在植物之中。豆科植物种子的胚乳，一些植物胶(如角豆胶、瓜儿胶、田菁角胶等)、椰肉粉、咖啡豆、莴苣、银合欢、观凰木、繁缕等含有丰富的半乳甘露聚糖，魔芋球茎、澳大利亚蒲葵、独尾草根等含有丰富的葡萄甘露聚糖(Marga F.，Ghki C.et aI.AppI.Environ.MicroboI.1996，62(12)4656-4658.)。正是因为有丰富的甘露聚糖资源，才为β-甘露聚糖酶的研究应用带来广阔的前景。甘露聚糖经甘露聚糖酶的酶解可以转化成人们大量需要的低聚糖。低聚糖是指二至十个单糖单位通过糖苷键连接起来形成直链或分支链的一类糖，它具有低热、稳定、安全无毒等良好生理特性，还具有使肠内有益菌增加，有害菌减少的生理功能。在食品生产和药品生产中有着广泛的前景。
近年来，国内外关于低聚糖的生产与应用方面的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入了工业生产并应用于保健食品中。但目前投放市场的绝大多数功能性低聚糖产品均属于普通级的低聚糖，即产品干基中仅含有30％----50％的有效成分，因此，开发高纯度的功能性低聚糖，成为科技工作者急需解决的课题。在日本，高纯度的低聚糖的价格是普通级的5----10倍。到目前为止，制备高纯度低聚糖的方法主要有凝胶过滤色谱法、纳米滤膜法、发酵法、离子交换色普法、葡萄糖异构酶转换法、多酶法(葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶偶联)及聚糖酶酶解魔芋精粉法。这些方法成本过高，或者产品难以提纯，或者工艺复杂，大多不适合工业化大规模生产。
目前，国内有关科研单位，如中科院微生物研究所、南开大学等广泛进行了甘露聚糖酶及其相关内容的研究，但所报道的发酵酶活低，酶解产物纯度低、生产成本高，尤其是碱性菌种在生产过程中还易造成环境污染等，因而难以进行工业化开发。
发明内容
本发明的目的是通过基因工程的手段构建能高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌，并从其中培养分离纯化制取β-甘露聚糖酶，从而能高效、经济地转化制备甘露低聚糖。
使用的微生物本发明涉及的酵母基因工程菌Pichia pastorisGS115/HBM047，它具有高效表达β-甘露聚糖酶的特性，该菌株于2003年4月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NoM203026(以下简称HBM047)。
HBM047菌株的菌学特性a、形态特征毕赤酵母的的无性生殖为芽殖，有时有假菌丝。有性生殖产生子囊内含有1----4枚光滑圆形、礼帽形或土星子囊孢子。
b、生理生化特性毕赤酵母能利用特殊的物质为原料生长，如石油、甲醇、氨态氮、有机酸等。HBM047菌株具有毕赤酵母的生理生化特性，同时因插入了β-甘露聚糖酶基因，具有高效表达β-甘露聚糖酶基因的特性。
本发明是这样实现的。酵母基因工程菌HBM047(Pichia pastoris)是通过构建环境基因组文库的方法及PCR技术，从环境微生物中筛选出β-甘露聚糖酶基因，将上述β-甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母整合表达载体中，然后得到的含β-甘露聚糖酶基因表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌HBM047菌株。
具体做法是，抽取环境微生物的总DNA，用限制性内切酶对其进行部分酶切，回收4----10kb的片段，克隆到克隆载体中，转化大肠杆菌，通过以魔芋粉作底物，用平板筛选法筛选出目的基因，并进行测序。根据测序得到克隆β-甘露聚糖酶基因序列，再应用PCR方法，用环境基因组文库中筛选的阳性克隆的质粒DNA为模板，扩增出1.7KB的DNA片段，将其插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)整合表达载体中，再通过化学转化导入到毕赤酵母宿主GS115中，再从中筛选出高效表达β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌HBM047菌株来。
将高效表达的β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌HBM047，在以甲醇为碳源的培养基中，温度28℃----30℃，经24----168小时诱导培养(每隔一定时间测酶活，168小时停止诱导培养)，将完成诱导培养的酵母基因工程菌经高速离心除去菌体，收集上清液，即粗酶液，经过滤浓缩即得β-甘露聚糖酶产品。
应用上述的β-甘露聚糖酶粗酶液水解制备甘露低聚糖的方法，其步骤为1)、将一级魔芋粉用蒸馏水配制成浓度为10％----20％的魔芋水溶液，溶胀一小时
2)、按每10----20g魔芋粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃----55℃、时间1----4小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为甘露低聚糖成品。
将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥后称重，降解物纯度达到85％。
本发明应用HBM047酵母工程菌发酵生产β-甘露聚糖酶，由于该酶活力高(酶活性达1080u/ml)且在酶系中占据绝对优势地位，因此，其酶解产物的纯度可高达85％以上。而且应用该酶生产出的甘露低聚糖(Mannooligosaccharibes，简称MOS)纯度高、生产成本低，是功能性低聚糖中的极品。
本发明的β-甘露聚糖酶酵母工程菌与传统的选育技术得到的菌株相比，既有极高的产酶水平和较低的生产成本，又能适宜多种水解多糖的可变条件。
具体实施例方式
抽取环境微生物的总DNA，用限制性内切酶对其进行部分酶切，回收4----10kb的片段，克隆到克隆载体中，转化大肠杆菌，通过以魔芋粉作底物，用平板筛选法筛选出目的基因，并进行测序。根据测序得到克隆β-甘露聚糖酶基因序列，再应用PCR等方法，将上述基因插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)整合表达载体上，再通过化学转化导入到毕赤酵母宿主GS115中，并对得到的若干转化子进行PCR鉴定。
实施例1鉴定确证导入了β-甘露聚糖酶酵母基因的GS115转化子若干(如8----10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0----6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于28℃----30℃诱导培养。诱导培养24小时，每隔8小时取样，对所取样进行SDS-PAGE电泳分析。
选择、诱导、培养高效表达β-甘露聚糖酶的菌株HBM047(GS115+β-甘露聚糖酶)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达300u/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含β-甘露聚糖酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为300u/ml。
实施例2鉴定确证导入了β-甘露聚糖酶基因GS115转化子若干(如8----10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0----6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于28℃----30℃诱导培养。诱导培养72小时，其间前48小时，每隔8小时取样，48小时后，每间隔12小时取样，对所取样进行SDS-PAGE电泳分析。
选择、诱导、培养高效表达β-甘露聚糖酶的菌株HBM047(GS115+β-甘露聚糖酶)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达960u/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含β-甘露聚糖酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为960u/ml。
实施例3鉴定确证导入了β-甘露聚糖酶基因的GS115转化子若干(如8----10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0----6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于28℃----30℃诱导培养。诱导培养168小时，其间前48小时，每隔8小时取样，48小时后，每间隔24小时取样，对所取样进行SDS-PAGE电泳分析。
选择、诱导、培养高效表达β-甘露聚糖酶效果的菌株HBM047(GS115+β-甘露聚糖酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达1080u/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含β-甘露聚糖酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为1080u/ml。
实施例4应用上述的β-甘露聚糖酶粗酶液水解制备甘露低聚糖的方法，其步骤为1)、将一级魔芋粉100g用蒸馏水配制成浓度为10％的魔芋水溶液，溶胀一小时；2)、按每10g魔芋粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃、时间1小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为H-甘露低聚糖成品。
实施例51)、将一级魔芋粉100g用蒸馏水配制成浓度为15％的魔芋水溶液，溶胀一小时；2)、按每15g魔芋粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在52℃、时间3小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为H-甘露低聚糖成品。
实施例6
1)、将一级魔芋粉100g用蒸馏水配制成浓度为20％的魔芋水溶液，溶胀一小时；2)、按每20g魔芋粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在55℃、时间4小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为H-甘露低聚糖成品。
将上述水解物进行离心去残渣，将上清液依次微滤、超滤、真空干燥后称重，计算收率为85％，取部分干燥物重新按一定比例溶于蒸馏水中，进行薄层层析或质谱鉴定表明5----10糖的甘露低聚糖含量大于60％。
权利要求
1.一种β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌(Pichia pastoris GS115/HBM047)是通过构建环境基因组文库的方法及PCR技术，其特征在于从环境微生物中筛选出β-甘露聚糖酶基因，将上述β-甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母整合表达载体中，然后得到的含β-甘露聚糖酶基因表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌HBM047菌株。
2.根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌，其特征在于抽取环境微生物的总DNA，用限制性内切酶对其进行部分酶切，回收4----10kb的片段，克隆到克隆载体中，转化大肠杆菌，通过以魔芋粉作底物，用平板筛选法筛选出目的基因，并进行测序，根据测序得到克隆β-甘露聚糖酶基因序列，再应用PCR方法，用环境基因组文库中筛选的阳性克隆的质粒DNA为模板，扩增出1.7KB的DNA片段，将其插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)整合表达载体中，再通过化学转化导入到毕赤酵母宿主GS115中，再从中筛选出高效表达β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌HBM047菌株。
3.按权利要求1或2的酵母基因工程菌制备的β-甘露聚糖酶，其特征在于将高效表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌，在以甲醇为碳源的培养基中，温度28℃--30℃，经24----168小时诱导培养(每隔一定时间测酶活，酶活性达300-1080u/ml时停止诱导培养)，将完成诱导培养的酵母基因工程菌经高速离心去除菌体，收集上清液，即粗酶液，经过滤浓缩即得β-甘露聚糖酶产品。
4.按权利要求3所述的β-甘露聚糖酶水解制备甘露低聚糖的方法，其特征在于其步骤为1)、将一级魔芋粉用蒸馏水配制成浓度为10％---20％的魔芋水溶液，溶胀一小时；2)、按每10----20g魔芋粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃----55℃、时间1----4小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为甘露低聚糖成品。
全文摘要
本发明提出了一种β－甘露聚糖酶酵母基因工程菌(Pichia pastoris GS115/HBMO47)是通过构建环境基因组文库的方法及PCR技术，从环境微生物中筛选出β－甘露聚糖酶基因，将上述β－甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母整合表达载体中，然后得到的含β－甘露聚糖酶基因表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达β－甘露聚糖酶的酵母基因工程菌。用该酵母基因工程菌制备的β－甘露聚糖酶，其酶活可达1000u/ml以上，用其水解甘露聚糖反应时间短，转化效率高，从而能高效、经济地生产纯度高性能好的甘露低聚糖。
文档编号C12N15/31GK1478887SQ0311898
公开日2004年3月3日 申请日期2003年4月22日 优先权日2003年4月22日
发明者王华伟, 李静 申请人:湖北大学