专利名称：：利用微生物发酵生产Ectoine的方法
技术领域：
：本发明属于微生物发酵
技术领域：
，涉及利用微生物发酵生产Ectoine的方法。
背景技术：
：1985年Galinski在嗜盐菌细胞中发现了补偿性溶质Ectoine，即1，4,5,6-四氢-2國甲基國4-嘧啶羧酸(1，4，5,6-tetrahydro隱2-methyl曙4曙pyrimidinecarboxylicacid)。此后的研究发现，Ectoine作为主要的补偿性溶质在中度嗜盐菌中普遍存在。Ectoine能够在高温、冷冻和干燥等逆环境下，对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用。因此，Ectoine在化妆品、生物制剂、酶制剂和制药等领域具有很大的应用价值和广泛的应用前景。过去十几年间，高效生产Ectoine的工艺研究，首先是解决细胞的高密度培养，第一个用于批量生产的技术是Ectoine的"细菌挤奶"工艺(BacterialMilking:Anovelbioprocessforproductionofcompatiblesolutes.Biotechnol.Bioeng.,57，306-313,1998)。//a/omo"ase/o"gatoDSM142丁在较高盐浓度(1.5mol/L)诱导下细胞合成Ectoine，经过分批流加的高密度发酵后，收集细胞，通过低渗胁迫使细胞迅速释放胞内Ectoine(约释放总合成量的64%)，随后，细胞再在含有较高盐浓度的培养基中生长，重新诱导合成胞内Ectoine,再行低渗透压释放，这种渗透压胁迫过程重复循环。一个完整的(含9个循环的)细菌挤奶工艺，Ectoine发酵产率约为3.3g/L/d。还有利用firev^acfen.wwep^ew^DSM20659菌株在较高盐浓度(l.Omol/L)下通过分批流加进行高密度培养后，收集细胞，通过低渗胁迫释放和酒精抽提胞内Ectoine相结合的方法收集Ectoine，收集胞内Ectoine后的细胞不能再重复用于发酵。Ectoine发酵产率为2g/L/d(Optimizationofectoinesynthesisthroughfed-batchfermentationof5rev/6""er/wwep/c/erw/s.Biotechnol.Prog"21，1206-1212,2005)。上述工艺的特点是，菌株合成的Ectoine均存在于细胞内，它们不分泌Ectoine，发酵培养基中不积累Ectoine。当细胞内Ectoine积累量达到一定浓度时，其合成便受到抑制，即Ectoine的合成量受胞内Ectoine浓度阀值的限制。因此人们试图寻找使胞内Ectoine分泌至细胞外的方法。Grammann等在/fe/omo"ase/o"gatoDSM2581T(凡e/o"gatoDSM2581T)中首次发现了一种新型的Ectoine特异性吸收系统TeaABC，该系统能够回收细胞输出和/或泄露至细胞周质或培养基中的Ectoine，包括向培养基中添加的Ectoine。Ectoine通过这种输出/吸收循环，调节细胞Ectoine的合成，达到并维持胞内的Ectoine浓度阈值，因此，在培养基中不积累Ectoine。而TeaABC缺陷的i/.e/o"取toDSM258lT菌株，则向培养基屮分泌Ectoine，从而达到Ectoine的超量(超过胞内的Ectoine浓度阈值)合成的目的(AnewtypeofosmoregulatedsolutetransporteridentifiedinhalophilicmembersoftheBacteriadomain:TRAP画transporterTeaABCmediatestheuptakeofectoineandhydroxyectoineinTfa/omomwe/o"gafaDSM2581T,J.Bacteriol.,184,3078-3085,2002)。利用这种TeaABC缺陷菌株经高密度发酵制备Ectoine,培养基中积累的Ectoine发酵产率约为2.1g/L/d(德国，DE10114189,2002年9月26日)。这项研究虽然解决了Ectoine分泌的问题，但是因为细胞生长缓慢、培养时间较长，约90小时达到生长的最高OD值，而且Ectoine的总合成量低，所以Ectoine发酵产率与非分泌菌株的"细菌挤奶技术"相比并没有得到明显改善。另外Schubert等人构建的合成并分泌Ectoine的基因工程大肠杆菌，Ectoine发酵产率为0.8g/L/d(Continuoussynthesisandexcretionofcompatiblesoluteectoinebyatransgenic,nonhalophilicbacterium.,Appl.Environ.Microbiol"73,3343-3347,2007)，除Ectoine发酵产率较低外，基因工程大肠杆菌培养基中的启动转录诱导物价格口虫卬贝0现有技术中的Ectoine发酵方法的共同缺点是细胞生长缓慢，并且Ectoine合成量低。通过髙密度发酵，尽管可以达到较高的细胞密度，然而由于细胞生长缓慢和合成量低，发酵产率仍然无法显著提高。本发明的发明人尝试通过控制代谢流来提高细胞的生长速率和Ectoine合成量，并促进Ectoine分泌，以解决上述现有技术中存在的问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种微生物发酵生产Ectoine的方法，相比于现有技术，该方法能提高Ectoine的发酵产率，并提高Ectoine总合成量中分泌Ectoine所占比例。本发明的技术方案是将盐单胞菌属(Halomonas)细菌在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵体系中回收Ectoine;其中所述的盐单胞菌属(Halomonas)细菌是//a/o附o""sa//"aDSM5928(//^//"aDSM5928)，i/a/omowosve"组aDSM4743(i/.ve"wstoDSM4743)，T^/owowos/jfl/ocfemYr折ca朋DSM735(H/wr/o(iew",c<msDSM735)，i/a/omoMoyvewtoraeDSM15911DSM15911)，ifo/o附owospac折cflDSM4742pac诉caDSM4742)或W"/omowosa//we"/07^aDSM15356a/z.wewfaWaDSM15356)。此技术方案的提出基于发明人在对盐单胞菌属(Halomonas)细菌的研究过程中的发现，B卩在一定条件下，该属的一些菌株将合成的Ectoine部分分泌至胞外培养基中，这是首次发现的野生型菌株分泌Ectoine的现象。其中尤以DSM5928能够大量合成和分泌Ectoine。因此，本发明的技术方案优选将//.^//""DSM5928在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵液中回收Ectoine。研究同时还发现培养基碳源种类对Esa//""DSM5928的生长和Ectoine的合成量有非常大的影响。使用现有技术中常用于Ectoine诱导合成的培养基，如葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基(Osmoregulationinfocfer/c/z/flco//byaccumulationoforganicosmolytes:betaines,glutamicacid,andtrehalose.,Arch.Microbiol"147,1-7,1987;BacterialMilking:Anovelbioprocessforproductionofcompatiblesolutes,Biotechnol.Bioeng.，57，306-313,1998)，或者以蛋白胨和酵母臂为主要成分的培养基(SupplementationeffectsofhydroxyectoineonprolineuptakeofdownshockedBreW6acte/7'謂sp.JCM6894.,J.Biosci.Bioeng.，101,178-184,2006)，if.^//waDSM5928生长缓慢，Ectoine合成量也不高，发酵产率《2.0g/L/d(6L发酵罐数据)，而且合成的Ectoine仅在细胞内积累，培养基中没有Ectoine。卜.述本发明的生产方法中，促进H^/f"flDSM5928旺盛生长、大量合成并分泌Ectoine的重要条件是所使用的培养基，其基本特征之一是以谷氨酸单钠为唯一的碳氮源。谷氨酸促进细胞生长和Ectoine合成并分泌的原因，可能与谷氨酸强化Ectoine的合成流和三羧酸循环、促进了/f.sa//""DSM5928在盐胁迫下的生长代谢有关。Ectoine的合成途径是草酰乙酸经过天冬氨酸、天冬氨酸-P-磷酸、天冬氨酸-(3-半醛、L-2，4-二氨基丁酸、Ny-乙酰二氨基丁酸，最后转变为Ectoine。Ectoine的合成由来自三羧酸循环的草酰乙酸起始，而谷氨酸通过脱氨基生成(x-酮戊二酸后直接进入三羧酸循环，然后经过若干步骤转化为草酰乙酸，谷氨酸为合成天冬氨酸提供了底物草酰乙酸。草酰乙酸转变为天冬氨酸以及从天冬氨酸-卩-半醛转变为L-2，4-二氨基丁酸的反应，均是需要谷氨酸脱氨提供氨基的反应。可见，谷氨酸对Ectoine的合成流中的原料天冬氨酸的供应具有推动作用，另外在Ectoine合成流中的分支点处(天冬氨酸-p-半醛是进一步合成Ectoine、赖氨酸、通过高丝氨酸进一步合成苏氨酸和蛋氨酸等的共同底物)，谷氨酸对天冬氨酸-P-半醛向Ectoine支路合成具有拉动作用。结果，谷氨酸通过对三羧酸循环和Ectoine合成流的强化，促进Ectoine的合成，导致细胞在盐的诱导下生长速度快、代谢旺盛，Ectoine合成量显著超过其胞内浓度阈值，而超过其浓度阈值的部分，被分泌至细胞外，解除了胞内Ectoine浓度阈值对Ectoine合成的限制作用。经过优化，本发明屮所述的生产方法屮述及的培养基屮谷氨酸单钠浓度优选3080g/L，更优选6080g/L。本发明的技术方案中，培养基屮不使用酵母膏等含有渗透压补偿性溶质组分，而现有技术屮，盐单胞菌属(Halomonas)细菌在高盐度环境下诱导Ectoine合成时，为了使菌体较好生长，通常采取外源性补给渗透压补偿溶质的做法。发明人为此特别考察了酵母膏对Ectoine分泌的影响，但发现添加酵母膏等不利于Ectoine的合成和分泌，Ectoine的总合成量和分泌量均随酵母膏的浓度增加而减少(实施例3)。因此，本发明培养基屮不添加外源性渗透压补偿溶质。另一方面，发明人还考察了NaCl浓度对Ectoine分泌量的影响，发现菌株HDSM5928的胞内Ectoine浓度阈值随盐浓度的升高而升高，而Ectoine的分泌量则随NaCl浓度的降低而增加，较低的盐浓度有利于Ectoine的分泌(实施例4)。然而当NaCl浓度低于15g/L时菌体生长不良。基于此，上述本发明的微生物发酵生产Ectoine的方法中，所述培养基中NaCl浓度优选2060g/L，最优选2030g/L。尽管对培养基中的其他小量/微量组分的选定可以参考现有技术中的技术方案，如参考文献"Optimizationofectoinesynthesisthroughfed-batchfermentationof5rev/^ctenwwe/^ew^.Biotechnol.Prog.,21,1206-1212,2005"中所描述的内容，本发明还是对培养基中小量及微量组分进行了优化，除了上文所述的培养基中提及组分L-谷氨酸单钠和NaCl，其他加入的组分优选是KH2P042.53.5g/L，K2HP04810g/L,MgS04.7H200.30.5g/L及MnS044H200.01g/L;培养基优选去离子水配制，pH7.2。上述培养基中添加组分的更优选的添加量分别是KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04'7H200.4g/L，MnS044H200.01g/L，NaCl2030g/L。对上文所述各种培养基,最为优选的是:L-谷氨酸单钠6080g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04.7H200.4g/L，MnS04.4H200.01g/L，NaCl2030g/L，pH7.2。对于发酵培养的其他条件，比如接种量、培养温度、压力等，本领域的技术人员可以参考现有技术中对盐单胞菌属(Halomonas)细菌的培养方法选择，较为优选的此类培养条件也可以通过有限次数的实验考察得之，此非本发明的主要发明点所在，本说明书不再赘述。上述本发明的利用微生物发酵生产Ectoine的方法选用具有Ectoine分泌特性的H^"""DSM5"S菌株，采用以谷氨酸单钠为唯一碳氮源的培养基，并选用较低的NaCl浓度进行发酵，使Ectoine发酵产率达到了6.47.9g/L/d，是现有技术的2.12.4倍；所产生的Ectoine大部分分泌到培养基中，生产者既可以选择从培养体系高效率地回收Ectoine，也可以选择从培养基中回收Ectoine,当然后者更为推荐，因其不仅简化了产物回收工序，还可以实现菌体的连续发酵培养；此外，培养基中NaCl浓度比现有技术降低了l/22/3，大大降低了培养基盐浓度，能够减轻设备腐蚀，并有利于降低下游加工成本。本发明附图3幅，图1是不同添加量的酵母膏对Esa//""DSM5928合成及分泌Ectoine的影响(实施例3);图2是不同浓度的NaCl对//.sa/z'"aDSM5928合成及分泌Ectoine的影响(实施例4);图3是实施例5发酵罐培养过程中，/f.^//w"DSM5928合成及分泌Ectoine的情况。具体实施例方式以下通过实施例的方式对木发明的内容做进一步的说明。如无特殊说明，采用下述产物测定的方法(1)细胞内Ectoine浓度测定取发酵液1mL，4°C，12000rpm离心15分钟，NaCl-KpiBuffer(100mmol/L，pH7.2，NaC160g/L)洗涤(4°C，12000rpm离心15分钟)，弃上清液，离心沉淀中加入lmL80。/。乙醇，悬浮，室温静置过夜4。C，12000rpm离心15分钟，取上清液用于高效液相色谱(HPLC)领!j定。HPLC观!j定参照文献(AccumulationofectoineinthehalotolerantBreW^cfeWwwsp.JCM6894.，J.Biosci.Bioeng"91，288-293,2001)进行。(2)发酵液中Ectoine浓度测定取发酵液1mL，4°C，12000rpm离心15分钟，取上清液，去离子水稀释10倍后用于HPLC测定。HPLC测定同(1)。由于本发明中第一次发现野生型菌株分泌Ectoine的现象，因此还使用色质谱联用(LC-MS及核磁共振(NMR)对分泌产物进行了分子量和结构鉴定，具体方法为(3)分泌Ectoine的)LC-MS鉴定取对数生长期的发酵液4。C下，12000rpm离心15分钟，取上清液，加入99.5%乙醇(发酵液乙醇=1:9)，4°C下静置30分钟，使发酵液中残留的谷氨酸单钠结晶析出，取其上清液用于LC-MS测定。LC-MS分析使用HPLC(Waters2695separationmodule)和质谱仪(QuattroMicroWaters公司，美国)。HPLC条件色谱柱XterraMSC18，5pm(2.1xlSomm)，流动相为甲醇水溶液(甲醇水=4:1)，柱温35。C，流速0.2mL/min，紫外检测器，检测波长210nm。质谱条件电喷雾电离，电离方式ES+，源温度120。C，检测器Waters2996photodiodearraydetector。单级质谱和串联质谱电离电压分别为25V和20V。(4)分泌Ectoine的NMR鉴定取对数生长期的发酵液20mL，4°C，12000rpm离心15分钟，取上清液，加入99.5%乙醇(发酵液乙醇=1:9)，4。C下静置30分钟，使发酵液中残留的谷氨酸单钠结晶析出，取其上清液3(TC减压蒸发至结晶，加入0.5mLD2O溶解，供NMR分析使用。NMR测定在核磁共振仪(VarianINOVA400MNMR,Varian公司，美国)上进行，四甲基硅烷(TMS)为内标物，400MHz下记录&-核磁共振。H-NMR)波谱。测定样品与Ectoine标准品同时进行^-NMR的测定。本发明实施例所使用的菌种均购自德国DSMZ公司(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)。Ectoine标准品购自德国Biomol公司。菌种保存方法菌株在装有5mL本发明所述培养基的试管中3(TC、摇床(120rpm)培养24小时后，取菌液0.5mL与0.5mL60%灭菌甘油混合，装入菌种冻存管中，-S(TC低温冷冻保存。实施例l菌株Hra/z'朋DSM5928;培养基L-谷氨酸单钠30g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L,MgS04'7H200.4g/L，MnS04'4H200.01g/L，NaCl60g/L，pH7.2,0.2过滤灭菌；培养方法菌株在装有5mL上述培养基的试管中30°C、摇床(120rpm)培养24小时后，按1%(体积)接菌量转接至中30mL的上述培养基中(300mL三角瓶)，30°C、摇床120rpm培养，36小时取样测定胞内外Ectoine浓度；结果经分子量和结构鉴定及分析，培养基中有分泌的Ectoine;细胞内Ectoine浓度为0.56g/L，培养基中Ectoine浓度为0.68g/L，分泌率55%。实施例2菌株盐单胞菌属(Halomonas)其他几种微生物，见表1;培养基条件及培养方法如实施例l;实验结果如表l示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(续表l)菌株Ectoine浓度(mg/L)Ectoine分泌率胞外胞内(%)^pac诉cflDSM4742115.6±4.6126.6±5.851.6±2.2//^//附e咖n'"DSM1535695.1±1.4103.4±3.147.9±0.4//:e/o，,aDSM2581T0601.2±9.30F-附a"力aDSM47410283.6±6.10由表1结果可见，在同样的培养条件下，并非所有的Ectoine合成菌株都能分泌Ectoine。实施例3本实施例考察添加酵母膏对H>$"//aDSM5928合成及分泌Ectoine的影响。本实施例在实施例1基础上，向培养基中添加010g/L的酵母膏，并按照实施例1的培养条件进行Ectoine诱导合成，并测定Ectoine总合成量(胞内Ectoine量与分泌Ectoine量之和)和分泌量，结果见附图1所示。可见Ectoine的总合成量和分泌量均随酵母膏的浓度增加而减少，特别是当酵母膏浓度达到10g/L时，i/.DSM5928仅分泌微量的Ectoine。实施例4菌株//.ra/z'""DSM5928;培养基除NaCl浓度分别设定为30、60、90及120g/L外，其余与实施例1相同；培养方法同实施例1;结果如附图2所示，其中，Ectoine分泌量和细胞内Ectoine量以每克干细胞的Ectoine的毫克数计算；由附图2可见，细胞内Ectoine量随NaCl浓度的增加而增加，而Ectoine分泌量却随NaCl浓度的降低而增加。30g/LNaCl浓度下Ectoine分泌量最高为196.4mg/g，分泌率为80.1%;当NaCl浓度升高至120g/L时，Ectoine分泌量降低为31.6mg/g，分泌率降低为13.2%;需要注意的是，本发酵条件下，NaCl浓度《15g/L时，细胞生长不良，Ectoine合成量显著降低。实施例5菌株if.sa/Z""DSM5928;培养基L-谷氨酸单钠60g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L,MgS04'7H200.4g/L，MnS04-4H200.01g/L，NaCl30g/L，pH7.2，121°C、15分钟灭菌；培养方法发酵罐培养，反应器10L，装6L的培养基；最大通风量为10L/min，最大转速1000rpm，保持溶解氧水平在30%以上，用极性氧分压电极检测。玻璃pH电极检测并控制添加6MHC1，维持pH7.2;添加消泡剂(泡敌，中国旅顺化工厂)0.015%避免起泡；发酵罐中接种300mL//.sa/z'"aDSM5928培养液(500mL三角瓶，30°C、摇床120rpm.培养24小时的培养液)；培养过程定时取发酵液，按实施例1的方法测定分泌Ectoine浓度和细胞内Ectoine浓度，结果见附图3。由附图3可见，在细胞生长的对数生长期和平衡期中，Ectoine的合成量和分泌量均随发酵时间的延长而增加，其最大值呈现在平衡期的末期(21小时)，最大分泌量为4.3g/L，最大总合成量为6.9g/L，Ectoine合成体积效率为7.9g/L/d。实施例6菌株Hra/z'"aDSM5928;培养基L-谷氨酸单钠80g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04'7H200.4g/L，MnS04'4H200.01g/L，NaCl30g/L，pH7.2，121°C、15分钟灭菌；培养方法同实施例5;结果平衡期末期(27小时)时测定，最大分泌量为5.4g/L，最大总合成量为7.2g/L，Ectoine合成体积效率为6.4g/L/d。权利要求1、一种利用微生物发酵生产Ectoine的方法，是将盐单胞菌属(Halomonas)细菌在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15～120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵体系中回收Ectoine；其中所述的盐单胞菌属(Halomonas)细菌是HalomonassalinaDSM5928，HalomonasvenustaDSM4743，HalomonashalodenitrificansDSM735，HalomonasventosaeDSM15911，HalomonaspacififcaDSM4742或HalomonasalimentariaDSM15356。2、根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的盐单胞菌属(Halomonas)细菌是DSM5928。3、根据权利要求1或2所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的谷氨酸单钠浓度为3080g/L。4、根据权利要求3所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的谷氨酸单钠浓度为6080g/L。5、根据权利要求1、2或4中任一权利要求所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基中NaCl浓度为2060g/L。6、根据权利要求5所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基中NaCl浓度为2030g/L。7、根据权利要求1或2所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基为L-谷氨酸单钠3080g/L，KH2P042.53.5g/L，K2HP04810g/L，MgS07H200.30.5g/L，MnS04.4H200.01g/L，NaCl20120g/L，去离子水配制，pH7.2。8、根据权利要求7所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基为L-谷氨酸单钠6080g/L，KH2P043g/L，K2HP049g/L，MgS04'7H200.4g/L，MnS04'4H200.01g/L，NaCl2030g/L，去离子水配制，pH7.2。全文摘要一种利用微生物发酵生产Ectoine的方法，属于微生物发酵工程领域。该方法是将盐单胞菌属(Halomonas)一些具有Ectoine分泌特性的菌株在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15～120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵体系中回收Ectoine。上述方法使Ectoine发酵产率达到了6.4～7.9g/L/d，是现有技术的2.1～2.4倍，并且产物大部分分泌至培养基中，简化了产物回收工序，有利于实现连续培养；培养基NaCl浓度比现有技术降低了1/2～2/3，有利于减轻设备腐蚀，并降低下游加工成本。文档编号C12P17/12GK101314785SQ20081001246公开日2008年12月3日申请日期2008年7月22日优先权日2008年7月22日发明者张苓花,郎亚军申请人:大连海事大学