专利名称：一种儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感检测产品，具体的说，涉及一种有关儿童药物性耳聋易感基因 检测试剂盒。
背景技术：
药物性耳聋被破坏的不是外耳和中耳的声音传导系统(不是传导性聋)，而是感知声音最 重要又最脆弱的部位耳蜗毛细胞遭致药毒损害。毛细胞是听觉神经的末梢感受器，正常情况 下毛细胞把声能转化成生物电冲动传给听觉神经输入大脑中枢，人才能听到外界的各种声音。 耳毒性药物专门伤害毛细胞，让人感受不到外界的声音。这种聋属于"感音祌经性聋"，难 以治愈。
婴幼儿聋不易识别。
药物性耳聋不疼不痒，外耳道既不红肿也不流脓，孩子不哭不闹，反而变得安静。它具 有很大的隐蔽性，孩子都变哑了，家长还不知是耳聋引起的。儿童药源性耳聋常为双侧性、 永久性损害。特别是幼儿，由于不会诉说或表达不准确，待家长发现时，语言发育已经受损 害，不仅致聋而且致哑，贻误了治疗时机。调查显示在我国众多的耳聋患者中，因药物毒 性作用致聋者约占一半左右。
小心致聋的药物。
目前医学上发现的能引起耳聋的药物有60多种。过去知道的主要有链霉素、卡那霉素、 庆大霉素等，近年来发现还有一些药物也具有耳毒性，抗生素类还有丁胺卡那、新霉素、小 诺霉素、红霉素、氯霉素、四环素、多粘菌素、万古霉素、利福平；其他类药物有保泰松、 阿斯匹林、消炎痛、灭滴灵、心得安、苯巴比妥、乙胺碘呋酮等。
造成耳聋不仅与药量有关。
上海医大曾对4年间用过庆大霉素的175例6个月至8岁的儿童进行电测听检查，发现 都有不同程度的听力损害，严重耳聋121例，2岁以前的损害尤其严重。损害程度与用药总
量、给药途径和疗程长短有密切关系。椎管内给药的危害性最大，其次为静脉给药、肌肉给 药和皮肤损伤后表面给药，口服相对安全。两种或多种耳毒性药物联合应用时，发生损害的 几率增高。
母亲受害可遗传后代。
临床观察发现，有些药物能从母亲的乳汁中分泌出来，损伤婴儿听祌经，引起耳聋。还 有的药物可通过胎盘进入胎儿体内，引起先天性耳聋。近年更进一步发现，有药物性耳聋家
族史的人，对耳毒性药物特别敏感，病人有家族聚集性特点。例如一位病人，仅注射0.5克链霉素，很快听力急速下降，出现耳聋，经追访探明，他家祖孙三代竟有7人因注射该药而 致聋。研究探明，药物性耳聋系由细胞线粒体的遗传基因发生变异引起的，即家族的变异基 因可能通过母亲遗传给她的子孙，使之具有潜在的过敏性，此称"母系遗传"。家族史可看 作是药毒性耳聋的危险因素之一。
由此可见，在对婴幼儿，尤其是有家族遗传史的婴幼儿，特别有必要在用药，尤其是用 一些抗生素之前，获知其是否有药物性耳聋的易感基因的信息。但目前还没有相应的检测方 法应用。
发明内容
本发明提供一种儿童药物性耳聋易感基因分析检测试剂盒，可以以儿童DNA样本为测试
样本，对儿童药物性耳聋易感基因进行检测，从而判断其是否有导致药物性耳聋的基因突变
存在，从而有助于临床用药的参考，减少药物性耳聋的发生率。
该试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。
使用时以被测儿童遗传自母亲的线粒体DNA Mito DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，
使用试剂盒在荧光定量PCR仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。
所述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及儿童药物性耳聋易感基因突变位点的扩
增引物。以及与儿童药物性耳聋相关的线粒体DNAMito基因(MT-DNA)突变位点的扩增引物；
扩增引物为包含突变位点的上游引物和正常的下游引物，序列如下
上游引物FA 5-ACCCCTACGCATTTATATAGAGGTGA-3 26bp， 上游引物FG 5-CCCCTACGCATTTATATAGAGGTGG-3 25bp， 下游引物R 5-AAGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT-3 25bp。
所述的阳性对照品有2个，分别包含如下的序列 SEQ1:
AACTAAAACC CCTACGCATT TATATAGAGG AGACAAGTCG TAACATGGTA
AGTGTACTGG AAAGTGCACT TGGACGAACC AGAGTGTAGC TTAACACAAA
GCACCCAACT TACACTTAGG AGATTTCAAC TTAACTTGAC CGCTCTGAGC
TAAACCTAGC CCCAAACCCA CTCCACCTTA CTACCAGACA AC; SEQ2:
AACTAAAACC CCTACGCATT TATATAGAGG AGGCAAGTCG TAACATGGTA
AGTGTACTGG AAAGTGCACT TGGACGAACC AGAGTGTAGC TTAACACAAA
GCACCCAACT TACACTTAGG AGATTTCAAC TTAACTTGAC CGCTCTGAGC
TAAACCTAGC CCCAAACCCA CTCCACCTTA CTACCAGACA AC。
所述的阴性对照品包含的序列为
SEQ3:TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT
GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC
TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT
GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
本发明的使用简便易行，只需取儿童的DNA样本，比如口腔样本进行测试。操作简便， 有助于快速诊断儿童药物性耳聋的遗传因素。为临床用药提供参考，减少药物性耳聋的发生 率。
图l，图2，图3，为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。各图上方的DeltaRnvsCycle, 是指ARn随循环变化的对数扩增图谱；ARn (DeltaRn)是指在给定的一组PCR条件下所 生成荧光信号的对数值。该图的横坐标表示循环数(CycleNumber),纵坐标表示荧光值(Delta Rn)。横线表示荧光域值，曲线与荧光域值线的交叉点所对应的循环数即为Ct值。
图l、图2、图3中横线3表示荧光域值；曲线1表示为扩增MT-DNA的引物对FA + R， 扩增样本所生成的扩增曲线；曲线2为扩增MT-DNA的引物对FG + R，这对引物扩增样本 所生成的扩增曲线。
图1表示MT-DNA基因AA纯合型样本的产物扩增曲线图曲线1与荧光域值线的交叉 点表示达到域值的Ct循环数值为CI ，曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环 数值为C2。
图2表示MT-DNA基因GG纯合型样本的产物扩增曲线图曲线1与荧光域值线的交叉 点表示达到域值的Ct循环数值为C3，曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环 数值为C4。
图3表示MT-DNA基因AG杂合型样本的产物扩增曲线图曲线2与荧光域值线的交叉 点表示达到域值的Ct循环数值为C5，曲线1与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环 数值为C6。
具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采 用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建 议的步骤和条件。 实施例l:
试剂盒的制备。包括(1)探针的准备；(2) DNA抽提试剂；(3)预混反应液；(4)标准 阳性对照；(5)标准阴性对照。(1)探针的准备；
由通常的核苷酸引物合成仪合成。序列如下.-
上游引物FA 5-ACCCCTACGCATTTATATAGAGGTGA-3 26bp 上游引物FG 5-CCCCTACGCATTTATATAGAGGTGG-3 25bp 下游引物R 5-AAGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT-3 25bp
使用前按每OD引物稀释为100pmol/L (即100pmol/[il)浓度的加水量，开启瓶盖溶解 之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心l分钟，防止开盖时引物散失。使用前，将浓溶
液稀释成工作液10 pmol/ml后进行实验。 (2)DNA抽提试剂
试剂名称成分体积浓度
缓冲液GASDS100 ml0.5 mmol/L
缓冲液GBNAOH100 ml50 mmol/L
缓冲液GD碳酸钠-丙酮100 ml1 mmol/L
缓冲液GW无水乙醇100 ml原液
洗脱液Tris盐50 ml10 mmol/L
(3)预混PCR反应液
预混反应液包括6种，每种内含一对上下游扩增引物，各对应一个基因型。按lml配比 量计算，共同的成分配制为100的dNTP ， 20 pi; 500 U/^lTaq DNA Polymerase 20^1; 2XQuantOne Step SYBR 1300)_il; 10 的上游引物50 pi; 10 的下游引物50 pi; RNase-free ddH20 860 pl。
管l的l对引物为
上游引物FA5-ACCCCTACGCATTTATATAGAGGTGA-3 26bp
下游引物R 5-AAGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT-3 25bp 管2的1对引物为
上游引物FG5-CCCCTACGCATTTATATAGAGGTGG-3 25bp
下游引物R 5-AAGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT-3 25bp
(4)标准阳性对照
标准阳性模板是含有PPARG和PPARA基因中含突变核苷酸片段构成的Pucl8-T重组质 粒，该重组质料转化大肠杆菌DH5ot增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分 光光度计测A260定量并稀释到109 Copy/nl， -20。C保存。贮存存为109Copy4il，使用浓度为 105 Copy4U。
标准阳性模板提供2种，每种浓度为105Copy/^。序列如下
SEQ1:
AACTAAAACC CCTACGCATT TATATAGAGG AGACAAGTCG TAACATGGTA AGTGTACTGG AAAGTGCACT TGGACGAACCAGAGTGTAGC TTAACACAAA
6GCACCCAACT TACACTTAGG AGATTTCAAC 丁TAACTTGAC CGCTCTGAGCTAAACCTAGC CCCAAACCCACTCCACCTTACTACCAGACA ACSEQ2:
AACTAAAACC CCTACGCATT
AGTGTACTGG AAAGTGCACT
GCACCCAACT TACACTTAGG
TAAACCTAGC CCCAAACCCA
(5)标准阴性对照
标准阴性模板是含有拟南芥基因片断180个核苷酸构成的Pucl8-T重组质粒。该重组质料转化大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到109Copy/VI, .2(TC保存。贮存存为109Copy4U，使用浓度为105Copy4d。序列如下SEQ3:
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTTGCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGCTAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTATGTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC
实施例2:试剂盒的使用U)样本的制备
取样方式使用棉签在面颊内擦拭IO次。
注意为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。
a) 处理材料将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400^1缓冲液GA。
b) 加入20pl蛋白酶K溶液，涡旋IO秒混匀，56'C放置60分钟，其间每15分钟涡旋混匀数次。
c) 加入400^1缓冲液GB，充分颠倒混匀，7(TC放置10分钟，此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
d) 力口 200^无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
e) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12,000 rpm( 13，400xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
f) 向吸附柱CR中加入500 W缓沖液GD， 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
g) 向吸附柱CR中加入700pl漂洗液PW， 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。
h) 向吸附柱CR中加入500 ^1漂洗液PW， 12,000 rpm( 13,400xg)离心30秒，倒掉收集
TATATAGAGGTGGACGAACCAGATTTCAACCTCCACCTTA
AGGCAAGTCGAGAGTGTAGCTTAACTTGACCTACCAGACA
TAACATGGTATTAACACAAACGCTCTGAGCAC管中的废液。
i) 将吸附柱CR放回收集管中，12,000 rpm 。13，400xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附
柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗。j)将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 pl洗脱缓冲
液TB，室温放置2-5分钟，12,000 rpm( 13,400xg)离心2分钟。重复一次。
(2) 实验过程
a) 按样品数n (样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液每管23 pl分装于反应管中。
b) 将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照(务必振荡混匀数秒)各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应。
c) PCR条件95 °C 10 sec
(95°C 15 sec, 60°C 60 sec)X40个循环
(3) 结果分析与判断
a)定量检测SNP的判断标准
两曲线的Ct值之差的绝对值记为IACtl，当IACtl《1，判断为杂合型；当IACtl^5 ，判断为纯合型。
如图，图1中IACtl》5，表示该样本为MT-DNA基因AA纯合型样本。图2中，| A Ct|》5，表示该样本为MT-DNA基因GG纯合型样本。图3中，| A Ct|《l,表示该样本为MT-DNA
基因AG杂合型样本。b)结果分析
基因型诊断结果
MT-DNA GG基因检测结果显示儿童药物性耳聋发生的机率比较大。
MT-DNA AG基因检测结果显示儿童药物性耳聋发生的机率较小。
MT-DNA AA基因检测结果显示可能发生儿童药物性耳聋，需要结合其他的检 查手段。
8序列表
<110>上海裕隆生物科技有限公司〈120〉一种儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒<160〉 6
〈210〉 1〈211〉 26<212〉腿<213〉人工序列<220>
<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物FA。〈400〉 1
acccctacgc atttatatag aggtga 26
<210〉 2<211〉 25<212〉 DNA<213〉人工序列〈220〉
<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物FG 。
〈400〉 2
cccctacgca tttatataga ggtgg 25
<210> 3〈211> 25〈212> ■<213>人工序列<220>
〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物R。〈400〉 3
aagtgtaagt tgggtgcttt gtgtt 25
〈210〉 4〈211〉 192〈212〉 DNA<213〉人属(Homo)
9〈400〉 4aac taaaac caaagtgcactagatttcaacctaccagaca
cctacgcatttggacgaaccttaacttgac
tatatagagg agacaagtcg taacatggta agtgtactggagagtgtagc ttaacacaaa gcacccaact tacacttaggcgctctgagc taaacctagc cccaaaccca ctccacctta
60120180192
<210> 5<211〉 192〈212〉腿<213〉人属<400〉 5aac taaaac caaagtgcactagatttcaacctaccagaca
(Homo)
cctacgcatttggacgaaccttaacttgac
3C
tatatagagg aggcaagtcg taacatggta agtgtactgg观sgtgtagc tta^cacaaa gcacccaact tacacttaggcgctctgagc taaacctagc cccaaaccca ctccacctta
60120180192
〈210〉 6〈211〉 180〈212〉 DNA
<213〉拟南芥(Arabidopsis thaliana)〈400〉 6
ttcgttattg aatcttgttt tggttctctt gtgtggaatg cattgttctt gcttctctgg 60aacttgggat atgatgacaa已aatacgata tctxtaaggc taattgctgt gcggatgaaa 120tatatttgca cgtcagtctg atcccattat gtatataaca ttaggagttg gtgcatgctc 180
权利要求
1.一种儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒，其特征在于由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成；所述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及与儿童药物性耳聋相关的线粒体DNA Mito基因突变位点的扩增引物；扩增引物为包含突变位点的上游引物和正常的下游引物，序列如下上游引物FA5-ACCCCTACGCATTTATATAGAGGTGA-3 26bp，上游引物FG5-CCCCTACGCATTTATATAGAGGTGG-325bp，下游引物R 5-AAGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT-325bp。
2.如权利要求l所述的儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品有2个，分别包含如下的序列 SEQ1:AACTAAAACC AGTGTACTGG GCACCCAACT TAAACCTAGC SEQ2:AACTAAAACC AGTGTACTGG GCACCCAACT TAAACCTAGCCCTACGCATT AAAGTGCACT TACACTTAGG CCCAAACCCACCTACGCATT AAAGTGCACTTACACTTAGG CCCAAACCCATATATAGAGG TGGACGAACCAGATTTCAAC CTCCACCTTATATATAGAGG TGGACGAACC AGATTTCAAC CTCCACCTTAAGACAAGTCG AGAGTGTAGC TTAACTTGAC CTACCAGACAAGGCAAGTCG AGAGTGTAGC TTAACTTGAC CTACCAGACATAACATGGTA TTAACACAAA CGCTCTGAGC AC;TAACATGGTA TTAACACAAA CGCTCTGAGCAC。
3.如权利要求1或2所述的儿童药物性耳聋易感基因检测试剂盒，其特征在于所述的阴性 对照品包含的序列为 SEQ3:TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
全文摘要
本发明公开了一种用于儿童药物性耳聋易感基因检测分析试剂盒。本试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，针对线粒体DNA Mito基因突变进行检测，使用试剂盒在荧光定量PCR仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。本发明提供的儿童药物性耳聋易感基因检测方法简便易行，能快速检测出儿童药物性耳聋易感基因的情况，从而判断其是否有导致药物性耳聋的基因突变存在，从而有助于临床用药的参考，有效减少药物性耳聋的发生率。
文档编号C12Q1/68GK101684494SQ200810200589
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者汪宁梅, 穆海东, 飒 黎 申请人:上海裕隆生物科技有限公司