能够在低照度下开花的转基因植物的制作方法

专利名称：能够在低照度下开花的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在低照度环境下能够开花的转基因植物、其制备方法、诱导所述植物开花的方法等。更具体地说，本发明涉及通过导入FT基因从而在低照度环境(例如，屋内) 下能够开花的转基因植物、其制备方法、诱导所述植物开花的方法等。
背景技术：
近年来，已知以阿拉伯芥为中心，许多基因与开花调节有关。有报道指出在此开 花调节中，来自阿拉伯芥的被称为FT基因的基因发挥了主要作用，当由该基因编码的FT 蛋白质的表达水平增加时促进开花(W099/53070，Trends in Plant Science (2006) 11 550-558)。还已知FT基因及与此对应的水稻基因Hd3a在叶中合成蛋白质，该蛋白质向 茎顶部移动，在茎顶部诱导花芽分化(Science (2007) 316 :1033-1036)。在制备使FT基因 组成型表达的重组植物时，其植物开花得到了促进(Trends in Plant Science (2006) 11 550-558 非专利文献1)。例如，使FT基因过表达的菊花即使在菊花通常不开花的长日照 条件下的组织培养下也开花(园艺学研究(2007)卷6、别册1，214 非专利文献2)。此外，许多植物具有与FT基因对应的基因。从番茄和毛果杨 (Populustrichocarpa)中得到FT基因的异种同源物，这些异种同源物分别被命名为SFT和 PtFT0相同基因也从温州蜜柑(Citrus unshiu)等中得到。有报道指出使这些基因在植 物中组成型过表达时，可促进阿拉伯芥、水稻、枳(Poncitrustrifoliate)等的开花(Plant Cell Physiol. (2002)43 :1095_1105，TransgenicResearch(2005) 14 :703_712 非专利文 献3)。通常以柑橘类为主的果树等树木从发芽到开花需要数年，而导入FT基因的转基因橙 子在约6个月 一年开花(Transgenic Research (2005) 14，703-712 非专利文献4)。因此，认为FT基因及与其对应的来自其他植物种的基因的功能可超越种的范围 而发挥促进开花的功能。而且，利用FT基因及与来自其他植物的相应基因(本说明书 中统称为FT基因)时，预期代的交替得到促进，缩短品种改良所需要的时间(日本特开 2000-139250 专利文献1)。也就是说，将导入了 FT基因的植物在具有充分照度和温度的 条件下栽培时，预期其比未导入基因的植物提前开花。或者，如果通过组织培养维持植物生 长时，可预期可促进开花，且植物比通常提前开花。以上的原因是，在进行组织培养时通常 添加作为碳源和能源的糖，所以即使植物不进行充分的光合作用也能生长发育。另一方面，为使植物生长和开花，日照的小时数极为重要。晴天时野外的照度为 lOOOOOLux左右。在温室栽培矮牵牛等时，需要lOOOOLux左右的照度。相对于此，通常的室 内(办公室或家庭)的照度为500LUX左右，作为在此条件下能开花的观赏用植物，只知有 道非洲紫罗兰。因将开花的盆栽植物(仙客来、非洲菊等)可置于室内观赏，所以，存在在室内享 受栽花乐趣的需求。为满足此需求，通常销售的是在温室等中使其开花后用于室内观赏的 植物。即使在室内，如果将植物暴露于充足的光照和适合的日长，植物即可开花。开花所需 的照度和每日光照期因植物种和栽培品种的不同而不同。通常，当暴露于例如通过使用荧光灯等给予的约lOOOLux左右的人工照明时，大多数植物均可开花。但是，在不具备充足的 光的条件下，即在通常的室内(例如照度为200 600LuX左右，优选为500LuX左右，更优 选为300LUX左右)，栽培高照度下才能开花的通常的花木植物时，常见的现象是开不了花， 或者即使开花，植物的生长也会出现被抑制、黄化、枯死的现象。这是因为光是植物进行光 合作用所必需的，而光合作用是植物生长发育所必需的。也就是说，尽管需要在低照度下能够开花的植物，但是因为光是植物生长所必需 的能源，所以通常在野外栽培的植物在低照度条件下例如室内是否生长和开花仍是不清楚 的。专利文献1日本专利申请公开第2000-139250号非专利文献ITrends in Plant Science (2006) 11 :550_558非专利文献2园艺学研究(2007)卷6、别册1，214非专禾Ij文献 3Plant Cell Physiol. (2002) 43 1095-1 105, TransgenicResearch(2005) 14 :703_712非专利文献4Transgenic Research (2005) 14 :703_712。

发明内容
在如上所述的情况下，需要在低照度环境下能够开花的转基因植物及其制备方法寸。本发明的发明人将FT基因导入显花植物中并进行了各种实验，结果完成了本发 明。更具体而言，本发明涉及如下所述的包括将FT基因导入显花植物的步骤的在低照度环 境下能够开花的转基因显花植物的制备方法、以上述性状为特征的显花植物及包含所述显 花植物的试剂盒。(1) 一种在低照度环境下能够开花的转基因植物的制备方法，所述方法包括将FT 基因导入显花植物中。(2)根据上述⑴所述的方法，包括将FT基因导入显花植物中使所述FT基因高表 达。(3)根据上述(2)所述的方法，包括将FT基因导入显花植物中使所述FT基因组成 型过表达。(4)根据上述⑴ (3)中任一项所述的方法，其中，所述FT基因来自阿拉伯芥。(5)根据上述⑷所述的方法，其中，所述FT基因是保持了促进开花功能的变体。(6)根据上述⑴ (5)中任一项所述的方法，其中，所述FT基因的组成型表达被 来自植物病毒的启动子诱导。(7)根据上述(1) (6)中任一项所述的方法，其中，所述显花植物为玄参科的蓝 猪耳(torenia)、茄科的矮牵牛(petunia)、茄科的赛亚麻(Nierembergia)、马鞭草科的马 鞭草(verbena)、蔷薇科的蔷薇属植物(rose)或石竹科的康乃馨(carnation)。(8)根据上述(1) (7)中任一项所述的方法，其中，所述低照度环境是在未导入 FT基因的同种植物中不引起开花的照明条件下的栽培环境。(9)根据上述(8)所述的方法，其中，所述低照度环境为50 lOOOLux的照度。(10) 一种转基因植物，其是根据上述(1) (9)中任一项所述的方法制备的。
(11) 一种在低照度环境下诱导植物开花的方法，所述方法包括在与未导入FT基 因的同种非重组显花植物的照度环境相比较低的照度环境下栽培导入了 FT基因的转基因 显花植物。(12)根据上述(11)所述的方法，所述较低的照度环境是在未导入FT基因的同种 植物中不引起开花的照明条件下的栽培环境。(13)根据上述(12)所述的方法，其中，所述较低的照度环境具有50 lOOOLux的照度。(14)根据上述(11) (13)中任一项所述的方法，其中，栽培所述转基因植物的条 件是组织培养或土壤栽培条件。(14a)根据上述⑴ (14)中任一项所述的方法，其中，所述植物至少到开花时为 止没有降低其商品价值的任何变化。(14b)根据上述(1) (14)中任一项所述的方法，其中，降低其商品价值的变化为 叶色和/或花色的变化、黄化或枯死。(14c)根据上述(1) (14)中任一项所述的方法，其中所述植物能够在比通常高 度矮的状态下开花。(15) 一种通过上述(11) (14)中任一项所述的方法制备的转基因植物，其中，所 述显花植物为玄参科的蓝猪耳、茄科的矮牵牛、茄科的赛亚麻、马鞭草科的马鞭草、蔷薇科 的蔷薇属植物或石竹科的康乃馨。(16) 一种在低照度环境下能够开花的转基因植物试剂盒，其包含导入了 FT基因 的转基因显花植物。(17)根据上述(16)所述的试剂盒，其中，所述转化体植物为种子或开花前的苗木 (seedling)状态的植物。根据本发明，通过导入FT基因，可使通常在与室内环境类似的低照度下不能开花 的植物即使在低照度环境下也能开花。因为此种能够在低照度下开花的植物容易在屋内栽 培，所以，这些植物不仅在商业栽培者进行栽培时，而且一般消费者在屋内栽培时也能容易 地开花。另外，通过组成型表达FT基因，显花植物用比通常短的时间能够开花，甚至在低 照度环境下显花植物用比通常短的时间也能够开花。而且，根据本发明的方法在低照度环境下栽培显花植物能够使其开花。因此，本发 明的方法还具有可使能量的消耗量显著减少的优点。序列表(TEXT文本)SEQ ID NO 1 拟南芥(Arabidopsis thaliana)FT基因序列及蛋白质序列SEQ ID NO 2 拟南芥FT蛋白质序列SEQ IDNO :3:引物SEQ IDNO :4:引物
具体实施例方式以下，对本发明中使用的FT基因、其编码的多肽、用于使FT基因表达的载体、转化 体的制备、转化体向植物体的组织培养方法、栽培等进行详细地说明。
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1.本发明的转基因植物及其制备方法1 · 1本发明中使用的FT基因 首先，本发明提供在低照度环境下能够开花的转基因显花植物的制备方法，所述 方法包括将FT基因导入显花植物中。在该方法中，优选将以上描述的FT基因导入显花植 物中，以使其高表达。进一步优选将所述FT基因导入显花植物中，以使其组成型过表达。在本说明书中使用时，“FT基因”是指但不限于编码来自阿拉伯芥(拟南芥)的FT 蛋白质(SEQ ID NO 2)的基因(SEQ ID NO :1，Genbank登录号AB027504)，并且也可以是显 示FT蛋白质的促进开花活性且属于与FT相同家族的异种同源蛋白质的基因。属于与FT 相同家族的蛋白质在许多植物中均有发现，并且在整个家族内高度保守。作为与FT相同家 族的蛋白质，可例举拟南芥的FT蛋白质、TSF蛋白质、MFT蛋白质，温州蜜柑CiFT蛋白质，以 及水稻的Hd3a蛋白质、RFTl蛋白质、AL662946蛋白质、AP003079蛋白质、AP002882蛋白质 等。在此，AL662946蛋白质、AP003079蛋白质及AP002882蛋白质的编号为来自水稻的EST 的注册号。在本说明书中使用时，术语“多核苷酸”可与“基因”、“核酸”或“核酸分子，，互换 使用，指核苷酸的聚合体。在本说明书中使用时，术语“碱基序列”可与“核酸序列，，或“核 苷酸序列”互换使用，作为脱氧核糖核苷酸(省略为A、G、C及T)的序列表示。另外，“包含 SEQ ID NO 1的碱基序列的多核苷酸或其片段”是指包含SEQ ID NO=I的由各脱氧核苷酸 A、G、C和/或T表示的序列的多核苷酸或其片段部分。根据本发明的多核苷酸可以以RNA(例如mRNA)或DNA的形式(例如cDNA或基因 组DNA)存在。DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链(也称作正义链) 或其也可以是非编码链(也称作反义链)。作为用以获得根据本发明的多核苷酸的供给源，无特别限定，但优选包含FT基因 或其异种同源物的生物材料。在本说明书中使用时，术语“生物材料”指生物学样品(从生 物体中得到的组织样品或细胞样品)。在下述实施例中，作为生物体使用矮牵牛、蓝猪耳、赛 亚麻，但不限定于此。在一种实施方式中，根据本发明的多核苷酸也可以是突变体，其中编码具有FT蛋 白质活性的多肽的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、插入、取代或添加。突 变体可在编码区或非编码区发生突变或者在这两个区均发生突变。编码区中的突变可产生 保守或非保守的氨基酸的缺失、插入、取代和/或添加。在本说明书中使用时，“FT基因”包 括编码SEQ ID NO :2的氨基酸序列的基因或者编码在所述氨基酸序列中1个或多个(例如， 1 40个、1 20个、1 15个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、1 5 个、1 4个、1 3个、1 2个、1个等)或1个或数个氨基酸被缺失、取代或添加的氨基 酸序列的基因。多肽的氨基酸序列中的一些氨基酸对该多肽的结构或功能无显著影响，可被容易 地改造是该领域众所周知的。而且，不仅可人为地对其改造，在天然的蛋白质中，存在不使 该蛋白质的结构或功能发生显著变化的突变体也是众所周知的。本领域技术人员使用众所周知的技术，可容易地对多肽的氨基酸序列中1个或多 个氨基酸进行改造。例如，按照公知的定点诱变法，可对编码多肽的多核苷酸的任意的碱基 进行改造。另外，也可设计对应于编码多肽的多核苷酸的任意位点的引物，制备缺失突变体或添加突变体。而且，使用本说明书中所记载的方法，即可容易地测定所制备的变体是否具 有所需活性。优选的变体具有保守性或非保守性的氨基酸取代、缺失或添加。优选沉默性取代、 添加及缺失，特别优选保守性取代。这些均不使根据本发明的多肽活性发生变化。保守性取代的代表性实例是脂肪族氨基酸Ala、Val, Leu及Ile中的1个氨基酸 取代为另一个氨基酸；羟基残基Ser及Thr的交换，酸性残基Asp及Glu的交换，酰胺残基 Asn及Gln之间的取代，碱基性残基Lys及Arg的交换，以及芳香族残基Phe及Tyr之间的 取代。如以上详示，涉及何种氨基酸的变化为表型沉默的(即是否不具有对功能显著有 害的效果)的进一步的指导可在 Bowie，J. U.等 “Deciphering theMessage in Protein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science247 1306-1310(1990) (在本说明书中作为参考引用)中找到。只要使用上述所例举的根据本发明的多核苷酸，即可在转化体或细胞中合成具有 FT蛋白质功能的多肽。表达载体本发明提供包括将FT基因导入显花植物中使FT基因高表达的方法。此外，本发 明还提供包括将FT基因导入显花植物中使FT基因组成型过表达的方法。本说明书中，“高表达”是指可表达地整合的基因在由于受到比原来情况下更强的 表达诱导或在细胞内更长时间地积累，从而使其在每个细胞中发挥更强的功能。该原因不 限于上述原因。“组成型过表达”是指基因表达等不依赖于外界刺激和生长条件等而基本为 一定量地过表达。“可表达地整合”的基因是指，为使其可在被导入的细胞内表达而整合进 载体的基因。“在(载体中)可表达地整合的基因”可通过将调控该基因表达的适合的启动 子等的表达调控因子配置在可调控该载体中的该基因表达的位置(例如该基因的上游)上 来实现。在本说明书中使用时，“在植物内可表达地整合的FT基因构建体”是指通过公知的 基因导入法以可导入植物的形式(例如质粒载体)插入FT基因的构建体，并意欲指可表达 由FT基因编码的FT蛋白质的构建体。作为可导入植物中的形式的FT基因构建体包括，例 如插入FT蛋白质的cDNA的重组表达载体等。重组表达载体的制备方法包括但不限于本领 域技术人员公知的方法的使用质粒、噬菌体或黏粒等的方法。载体的具体种类无特别限定，可适当选择可在宿主细胞中表达的载体。根据宿主 细胞的种类，选择适当的启动子序列以确保FT蛋白质的表达，并且通过将该启动子序列与 FT基因导入一定类型的质粒中所制备的载体可作为表达载体使用。载体优选含有至少1个选择性标记。用于植物细胞培养的选择性标记的实例包括 那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和Basta抗性基因，用于大肠杆菌(E. coli)及其他细菌 的培养的选择性标记的实例包括四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基 因、卡那霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等。使用选择性标记，选择在含 有上述抗生素的培养基中生长的植物体，从而容易地选择出转基因植物体及细菌。质粒的表达启动子可以是进行组成型表达诱导的启动子，也可以是可从外部调控 的诱导型启动子。作为在本发明中使用的进行组成型表达诱导的启动子，可优选花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、肌动蛋白启动子、胭脂碱合成酶的启动子、烟草raia基因启 动子、番茄核酮糖1，5-二磷酸羧化酶氧化酶小亚基启动子等。其中，可更优选使用花椰菜 花叶病毒35S启动子或肌动蛋白启动子。通过使用上述任何启动子，当给定基因导入植物 细胞中时，所述基因能够在所获得的重组表达载体中强表达。此外，可从外部调控的启动子 的实例包括金属硫蛋白启动子、热休克启动子等，但不限于此。 本发明中，诱导型启动子与DNA结合结构域特异性结合时，受转录活化结构域的 作用，激活其调控下的结构基因的转录。本发明中，诱导型启动子可根据作为编码所述DNA 结合结构域的DNA序列而使用的序列来进行适宜地选择。例如，编码小鼠AhR的DNA结合 结构域(氨基酸1 82)的DNA序列作为编码DNA结合结构域的DNA序列使用时，优选使 用来自大肠杆菌的6 X XRE序列(将6个小鼠XRE序列串联连接的序列)，此外，编码大肠杆 菌的阻遏蛋白LexA的DNA结合结构域的DNA序列作为编码DNA结合结构域的DNA序列使 用时，优选使用8XLexA-46-P序列(在花椰菜花叶病毒的35S启动子的操作子区(转录开 始点开始46个碱基上游)上将LexA结合序列重复8次的序列)。在优选的实施方式中，本发明的载体可进一步包含1个或多个所需基因。所述基 因的实例包括抗药基因(例如NPTII (新霉素磷酸转移酶II)等。这些基因优选配置于适 合的启动子(例如胭脂碱合成酶启动子或Mac启动子)的调控下。本发明的载体通常含有表达调控区例如适合的启动子和终止子以及复制起点，这 取决于应导入所述载体的宿主的种类。例如，为使基因在植物细胞内表达，制备这样的DNA 分子(表达盒)，使其以可发挥功能的形式具有(1)可在植物细胞内发挥功能的启动子、(2) 基因及(3)可在植物细胞内发挥功能的终止子，并将其导入植物细胞内。此种DNA分子不 仅包含启动子，还可包含用于使转录进一步增强的DNA序列，例如增强子序列。所使用的 启动子无特别限制，只要能够是在植物细胞内发挥功能的启动子，例如35S(Shcell，J. S.， 1987，Science,237 :1176_1183)、Nos(Schell, J.S.，1987，Science,237 :1176_1183)、 rbcS(Benefy,P. N.及 Ν_Η· Chua, 1989, Science, 244 174-181)、PRla(0hshima，M.等、1990、 Plant Cell，2 :95-106)、ADH(Benefy，P. N.及 Ν_Η· Chua，1989，Science，244 174-181)、 patatin(Benefy, P. N. R N-H. Chua, 1989, Science, 244 :174—181)、Cab (Benefy, P. N. R N-H. Chua，1989，Science, 244 :174-181)及 PAL(Lian，X.等，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 9284-9288)等。终止子无特别限定，只要其具有作为转录终止位点的功能，并且可以是公知的一 个终止子。可优选使用的终止子的具体实例包括胭脂碱合成酶基因的转录终止区(Nos终 止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。其中，可更优选使用Nos 终止子。作为用于提高翻译效率的碱基序列包括例如来自烟草花叶病毒的omega序列。通 过将该omega序列配置于启动子的非翻译区(5’ UTR)，可提高目的基因的翻译效率。如上 所述，在所述转基因载体中可根据其目的而含有各种DNA片段。有关上述重组表达载体的构建方法无特别限定。将上述启动子、编码转录因子的 基因、转录抑制转换多核苷酸以及根据需要的其他DNA片段按预定顺序导入适当选择的作 为母体的载体中。例如，将编码转录因子的基因与转录抑制转换多核苷酸连接而构建嵌合 基因。然后，将该嵌合基因与启动子(以及根据需要的终止子等)连接以构建表达盒，并将该盒导入载体中。在嵌合基因及表达盒的构建中，例如，将各DNA片段的切割位点作为彼此互补的 突出末端，通过连接酶使其反应，即可规定该DNA片段的顺序。在表达盒中含有终止子的情 况下，以从上游开始的顺序，可包含启动子、上述嵌合基因和终止子。此外，对于用于构建重 组表达载体的试剂例如限制性内切酶和连接酶等的种类无特别限定，并可适当选择市售品 使用。1.3转基因植物的制备本发明提供如上所述的转基因显花植物。在本说明书中使用时，术语“显花植物”统指所有开花的植物。但优选为观赏用园 艺植物、更优选观赏用花卉植物。所述显花植物可以是被子植物或裸子植物。本说明书中，“转基因植物”可与“转化的植物”互换使用。作为公知的基因导入法包括但不限于土壤杆菌介导的方法、基因枪法、病毒载体 法、电穿孔法、聚乙二醇法、显微注射法、脂质体法等。本领域技术人员可根据导入的植物种 类选择优选的基因导入法。如上所述的载体的构建可使用公知的限制性内切酶等，根据通常方法进行。例如， 使用土壤杆菌时，可使用PBI121等的双元载体，使用基因枪时，可使用PUC19等的大肠杆菌 载体。而且，使用标记基因例如抗生素抗性基因等选择用所述载体转化的植物细胞并使用 适合的植物激素或其他条件进行再分化，可得到用目的基因转化的植物体。载体导入植物细胞可使用本领域技术人员众所周知的各种方法进行。例如，可使 用利用根癌农杆菌、发根土壤杆菌的间接导入法(Heiei，Y.等，PlantJ.，6，271-282，1994、 Takaiwa, F.等，Plant Sci. 111，39-49，1995)，以电穿孔法(Tada, Y.等，Theor. Appl. Genet，80，475，1990)、聚乙二醇法(Datta, S. K.等，PlantMol Biol.，20，619-629，1992)、 基因枪法(Christou, P.等，Plant J. 2，275-281，1992，Fromm, Μ. Ε.，Bio/Technology, 8, 833-839,1990)等为代表的直接导入法。本发明中作为进行基因导入的植物细胞，只要可再 生成植物体，无特别限制。植物细胞的实例包括悬浮培养细胞和能够形成愈伤组织、原生质 体、叶切片等的细胞。经转化的植物细胞可通过使其再生而产生植物体。参照Ueyama等，Plant Biotechnology, 23 19-24,2006 ；Tamura 等，Plant Cell Reports，21，459-466，2002 ； Aida 等，Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 48,294-Transgenic Crops III (Y. P. S. Bajaj 编著)Springer-Verlag Berlin Heidelberg2001 ；Horsh 等的方法 (Science. 1985 ；227 :1229_1231)；以及Hazama等的方法(Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 48, Transgenic Crops III, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001)等的文献。本发明提供用上述方法制备的转基因植物。用如上所述的本发明的方法转化的 优选植物种包括显花植物种。更优选能够获得转化体的植物种。此种植物种的实例是矮 牵牛、蓝猪耳、马鞭草、烟草、蔷薇属植物、菊花、康乃馨、金魚草、仙客来、兰花、洋桔梗、小苍 兰、非洲菊、唐菖蒲、霞草、长寿花、百合、天竺葵属(Pelargonium)、老鹳草属(Geranium)、 郁金香、万寿菊、赛亚麻、牵牛花等。例如，参照Chandler等、In Vitro Cellular andDevelopmental Biology Plant, 41 :591_601, 2005 ;Tanaka等，Geneticengineering infloriculture, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80，1_24，2005。 根据本发明的转基因植物是通过导入FT基因而在不超过照射量为lOOOLux (优选
IOOLux或以下的屋内低照度条件)的栽培环境下能够开花的转基因植物。通过将本发明的载体导入植物体而改造的植物体以及由所述植物体的繁殖材料 (例如种子、后代、切花、块根、块茎、果实、切穗等)得到的植物体都包含在本发明的技术范 围内。在根据本发明的植物体的生产方法中，将上述基因导入植物体中，从而由该植物 体通过有性生殖或无性生殖得到只是含量减少的子孙。此外，由该植物体及其子孙能够得 到植物细胞或种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、切穗、块等繁殖材料，从而大量生产该植物 体。因此，根据本发明的植物体的制备方法中可包含在选择后繁殖植物体的繁殖步骤(大
量生产)。在本发明中，所述植物体包括已生长发育的植物体、植物细胞、植物组织、愈伤组 织、种子中的至少一个。也就是说，在本发明中，只要是最终可生长发育成植物个体的植物 体均视为植物体。另外，上述植物细胞包括各种形态的植物细胞。作为所涉及的植物细胞， 例如，包括悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过使这些植物细胞生长和分化可获得 植物体。而且，由植物细胞进行的植物体的再生可根据植物细胞的种类，使用以往公知的方 法进行。因此，在根据本发明的植物体的生产方法中，也可包括由植物细胞再生植物体的再 生步骤。2.诱导本发明的转基因植物开花的方法接下来，本发明还涉及在低照度环境下诱导植物开花的方法，所述方法包括在与 未导入FT基因的同种非重组显花植物的照度环境相比较低的照度环境下栽培导入了 FT基 因的转基因显花植物。在此所述的“低照度环境”是指在未导入FT基因的同种植物中不引起开花的照 明条件下的栽培环境。所述环境包括，例如作为开花前的总照明量，与作为同种植物的未 导入FT基因的非重组显花植物相比，照明量减少10 70 %、照明量减少10 50 %、照 明量减少10 40%、照明量减少10 30%的环境。在此，“作为开花前的总照明量，与 作为同种植物的未导入FT基因的非重组显花植物相比照明量减少10%”是指，例如，其 非重组显花植物开花时，平均需要10，000LuX(光照期10小时)、10天(10,000X10X10 =1，000, OOOLux ·小时)，而重组体只用9，OOOLux (光照期10小时)、10天的照明量 (9，000X10X10 = 900，OOOLux ·小时)即足够。更具体地说，根据本发明的优选实施方式，使通常只在屋外开花的观赏用显花植 物即使在如屋内的暗的照明条件下也能开花。此种低照度环境因植物的种类、导入的FT基因的种类、使用的启动子、载体等的 种类、包括温度等的栽培条件不同而不同，但是通常为以下条件。组织培养条件或通常的土壤栽培条件下的日照条件包括例如在10 35°C的温度 下、50 IOOOLux的光照期10 18小时，更优选为100 500Lux的光照期10 18小时 的栽培环境。优选的栽培和照明条件因显花植物的种类不同而不同。蓝猪耳、矮牵牛、赛亚麻为 长日照植物，并且类似的条件可适用于这些植物。所述条件如下。
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例如，在加入了含有 3g/l 结冷胶(Gellan Gum, Kanto Chemical)、30g/l 蔗糖 禾口 4· 4g/l 的 Murashige—Skoog(Murashige and SkoogBasal Medium containing vitamins, Duchefa Biochemie公司)的培养基的容器中放入植物体,可通过 在IOOOLux左右(例如100 1200Lux、优选为200 lOOOLux)的照度(使用荧光灯，16 小时光照期和8小时黑暗期)下、约22°C下的栽培进行组织培养。此外，也可在通常的园艺用土壤中栽植植物，在屋外栽培。在屋外时，最好最低气 温为10 15°C或以上，最高气温为35°C或以下，日照时间为10 12小时或以上。在室内栽 培时，比起土壤，消费者有更喜好人工栽培土如EC0PAF、Hydro Ball、环保轻石(supersol) 等的趋势，但也可以使用园艺用土壤。本发明中，“土壤栽培”是指使用天然土壤或人工土壤 进行栽培。土壤栽培包括例如露地栽培、温室栽培、塑料大棚栽培等的培养形式。本发明中使用的栽培条件不限定于上述条件。 3.在低照度环境下能够开花的转基因植物试剂盒本发明还进一步提供包含导入了 FT基因的重组显花植物的可在低照度环境下开 花的转基因植物试剂盒。此转基因植物试剂盒包括上述转基因植物为种子或开花前的苗木 状态。作为适用于根据本发明的植物试剂盒的植物，优选观赏用的显花植物。作为可在 本发明中使用的显花植物，只要可适用转化技术，可为任何植物，本领域技术人员可容易地 选择可容易地适用转化技术的观赏用显花植物。优选本发明的转基因显花植物是在育种中 将稳定的性状传递给子孙并维持的植物。根据本发明的试剂盒优选具备记载有适合栽培本发明的转基因显花植物的条件 的说明书、栽培中使用的肥料等。作为特别优选的照度条件，为屋内照明条件即足够的照度。只要是使用根据本发明的植物试剂盒，一般消费者均可在自家、办公室等内栽培， 并使其在低照度的环境下容易地开花。本说明书中所列举的所有文件均在本说明书中作为参考引用。本发明参照特定的 优选实施方式进行了记载，但可在不脱离本发明的本质的前提下来进行改造，这一点应该 理解。此种改造包含于专利权利要求书中。以下使用实施例更进一步具体地说明本发明，但本发明的范围不限定于这些实施 例。实施例在以下的实施例中，除非特别指出，分子生物学的方法根据WogeAssoo或 Molecular Cloning (Sambrook et AL (1989)Cold Spring Harbour LaboratoryPress)中 所记载的进行。实施例1 表达载体的构建基于W099/53070中记载的FT基因合成以下2个引物FT-F 5，-CCTCTAGAATGTCTATAAATATAAGAGACCC-3，(SEQ ID NO 3),FT-R 5，-CTCTGAGCTAAAGTCTTCTTCCTCCGC-3，(SEQ ID NO :4)。从在长日照条件下栽培的阿拉伯芥中得到mRNA，以其为模板，使用上述2个引物， 通过RT-PCR合成FT cDNA。RT-PCR使用KOD-Taq(Toyobo)，用制造者推荐的条件进行。将合成的 cDNA 用 XbaI 酶切。另一方面，将 p35S_GFP Plant Vector(CLONTECH)用 BamHI 和 SacI酶切后，使用末端平滑化试剂盒(TaKaRa Bio)进行末端平滑化后进行自身环化。将所 得到的质粒用XbaI酶切后，插入上述的XbaI酶切后的FT cDNA。选择FT cDNA的起始密码 子向靠近P35S-GFP的花椰菜花叶病毒35S启动子的方向插入的质粒。将该质粒用Hindi11 和EcoRI酶切，将酶切后的DNA片段中包含花椰菜花叶病毒35S启动子、FT基因和胭脂碱合 成酶终止子的DNA片段导入用HindIII和EcoRI酶切后的pBinPlus (Trangenic Research, 1995，4，288-290)中。将所得到的质粒命名为pSPB3137。预期在pSPB3137中，FTcDNA被 花椰菜花叶病毒35S启动子调控，并在植物中组成型表达。实施例2 重组矮牵牛的培育和评价转化方法按照Horsh等的方法(Science，1985 ;227 1229-1231)。即在矮牵牛 (Petunia hybrida)品禾中Surfinia Purple Mini (Suntory Flowers,Ltd.)中通过使用叶片 的土壤杆菌法导入实施例1中构建的双元载体的T-DNA部分。通过将转化细胞用卡那霉素 筛选后使其再分化，得到重组矮牵牛。在重组矮牵牛中，在照度5000LuX(光照期16小时、 黑暗期8小时)、温度23°C下进行离体培养时具有开花的个体，而未导入基因的矮牵牛及导 入了其他基因的重组矮牵牛在相同条件下均未开花。将导入了 FT基因的转化矮牵牛栽入装有BMl(泥炭土)赤玉土 珍珠岩= 2:2: 1的混合物的直径IOcm的塑料盆中，在封闭式温室中进行栽培。从各转化矮牵牛 的叶中提取RNA，通过RT-PCR法分析FT转录物的有无，筛选转录了 FT基因的株系。用于 检测FT mRNA所使用的引物与实施例相同。从检测有FT mRNA的株系中各取4个插穗，在 BMl (泥炭土)赤玉土 珍珠岩=2 2 1的混合物中进行扦插。在封闭式温室中继 续栽培时，导入了 FT的转化矮牵牛在25天 48天开花，而未导入的非转基因矮牵牛在64 天 79天后开花。以上结果说明，通过FT基因的过表达，无论是组织培养条件还是通常的土壤栽培 均能够促进矮牵牛开花。实施例3 重组蓝猪耳的育出和评价蓝猪耳的转化方法按照间等的方法(Biotechnology in Agriculture andForestry, Vol 48, Transgenic Crops III, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001)。即在蓝猪耳(Torenia hybrida)品种 Summer Wave Blue (Suntory Flowers, Ltd.) 中导入实施例1构建的双元载体的T-DNA部分。通过将转化细胞用卡那霉素筛选后使其再 分化，获得重组蓝猪耳。在重组蓝猪耳中，在照度5，000LuX(光照期16小时、黑暗期8小 时)、温度23°C下进行离体培养时有开花的个体，而未导入基因的蓝猪耳及导入了其他基 因的重组蓝猪耳在相同条件下均未开花。从导入了 FT基因的蓝猪耳40株系的叶中提取RNA，通过RT-PCR法分析FT转录物 的有无，筛选转录了 FT基因的株系。将转化蓝猪耳植入装有BMl 赤玉珍珠岩=2:2:1的混合物的直径IOcm 的塑料盆后，在封闭式温室中进行栽培。导入了 FT的转化蓝猪耳在上盆后33天 48天开 花，而未导入的蓝猪耳在60天 63天后才开花。此外，还观察到转化矮牵牛的节间缩短， 株型变得紧凑的趋势。以上结果说明，通过使FT基因组成型表达、使FT蛋白质过表达，无论是通过组织
12培养的栽培还是土壤栽培均能够促进蓝猪耳开花。实施例4 重组蓝猪耳在低照度下的开花将转化蓝猪耳及宿主蓝猪耳的茎扦插在Puffcal (Suntory Ltd.，在W02004/112461中记载)中。将这些扦插苗放入有孔的泡沫塑料中，漂浮于含有稀释后的 液肥(例如，VIGOR LIFE (Suntory Flowers, Ltd.)的1000倍稀释物)的水中。将这些蓝 猪耳在照度300Lux(光照期16小时、黑暗期8小时)、温度23°C的条件下栽培3个月。在 此条件下，虽观察到了宿主蓝猪耳有新叶展开等的生长，但花芽未能形成，未达到开花的程 度。另一方面，导入了 FT基因的重组蓝猪耳在第25天 第60天花芽形成，在第52天 第 70天开花。此时，未观察到叶和花的颜色或形态有异常，但如实施例3所述，节间比宿主缩 短，呈现紧凑的株型，开花后的样子非常强健可爱。在暴露于充足的光照且供给蔗糖作为碳源的体外条件下植物均可开花，但在光线 不充足、碳源被限定的室内条件下也可开花的植物则很有限。推测即使加入用于促进开花 的信号(例如FT基因的过表达)，仍需要用于充分进行通常使植物开花的光合作用的光照。 因此，还不能预测只导入FT基因植物能否在室内开花。不过，在实施例4中，令人意想不到 的是，转基因蓝猪耳在低照度条件下开了花，并且具有在商业中极具魅力的形态。实施例5 重组赛亚麻的育出和评价FairyBell Patioblue (Suntory Flowers, Ltd. ) Φ, jiffi Ueyama φ 的方法(Plant Biotechnology 23，19-24，2006)导入实施例1中构建的双元载体的T-DNA 部分，获得重组赛亚麻。宿主从驯化到开花需要约2个月，但却发现重组赛亚麻与其相比， 有很多提前7天 10天左右开花。上述结果说明，通过使FT基因组成型表达以使FT蛋白 质过表达能够促进赛亚麻的开花。实施例6 =FT导入基因重组蓝猪耳的通过水培的评价在室内进行植物栽培时，经常进行水培(在底部无孔的容器中盛水栽培植物的 方法)，为栽培植物，可使用Hydro Ball代替土壤。本实施例中，作为Hydro Ball使用 Neocoal (Toyo Denka Kogyo Co.，Ltd.的注册商标)。将发根后的蓝猪耳插穗移植到装 有20ml左右的Neocoal的30ml管中开始栽培。在Neocoal干燥时，每次提供VIG0RLIFE V(Suntory Flowers, Ltd.的注册商标)的2000倍稀释液。在实施例4的日照条件下，导 入了 FT基因的蓝猪耳在1个月 6星期时花芽形成，但未观察到宿主蓝猪耳的花芽形成。 这些植物生长后，茎长度达5cm左右时进行一次修剪。之后继续栽培时，在1个月左右重组 蓝猪耳即开花，其后在生长的同时不断开花，而宿主蓝猪耳则完全未开花。实施例7 蔷薇属植物中的FT基因导入使用导入了 pSPB3137的土壤杆菌，在蔷薇属植物品种薰衣草(Lavande)中导 入FT基因。有关蔷薇属植物的转化已报导了许多方法(例如Firoozababyet al. Bio/ Technology 12 :883_888 (1994)，US 5480789、US 5792927、EP 536327A1 以及 US 20010007157A1)，可根据上述方法进行转化。具体地说，在导入了pSPB3137 的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AglO 株(Lazo等，Bio/Technology 9 =963-967,1991)的菌液中，将由无菌苗的叶诱导的蔷薇属 植物的愈伤组织浸入5分钟，用灭菌滤纸拭去多余菌液后，移植到继代用培养基中进行2天 暗处共生培养。
而后，用加有400mg/l羧苄青霉素的MS液体培养基洗涤，从继代用培养基向加有50mg/l卡那霉素和200mg/l羧苄青霉素的筛选/除菌用培养基移植。反复进行在筛选培养 基上生长发育未受抑制的正常增殖部分的移植和培养后，筛选卡那霉素抗性愈伤组织。实施例8 康乃馨中的FT基因导入回收将上述质粒pSPB3137用AscI和PacI酶切后得到的含有FT基因的片段。将 该片段与用AscI和PacI酶切的双元载体pCGP1988(W02004-020637中记载)连接，将所得 到的质粒作为PSPB3432。该双元载体作为植物的转化标记，含有SurB基因。使用在康乃馨品种Vega中导入了 pSPB3432的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) AglO株以导入FT基因。有关向康乃馨中导入基因的方法，如PCT/AU94/00265 以及 Bio/Technology 9,864-868(1991)等中所记载。根据本发明，通过导入促进开花的FT基因，能够开发出在室内开花的植物。这在 屋内开花的事业，例如室内栽培事业上很有意义。此外，因可通过使室内观赏用植物更具魅 力而来吸引消费者，所以在室内观赏用植物的商业中也很有价值。
权利要求
一种在低照度环境下能够开花的转基因植物的制备方法，所述方法包括将FT基因导入显花植物中。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括将FT基因导入显花植物中使所述FT基因高表 达的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其包括将FT基因导入显花植物中使所述FT基因组成 型过表达的步骤。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述FT基因来自阿拉伯芥。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述FT基因是保持了促进开花功能的变体。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，所述FT基因的组成型表达被来自 植物病毒的启动子诱导。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述显花植物为玄参科的蓝猪耳、 茄科的矮牵牛、茄科的赛亚麻、马鞭草科的马鞭草、蔷薇科的蔷薇属植物或石竹科的康乃 馨。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，所述低照度环境是不引起未导入 FT基因的同种植物开花的照明条件下的栽培环境。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述低照度环境为50 lOOOLux的照度。
10.一种转基因植物，其是根据权利要求1 9中任一项所述的方法制备的。
11.一种在低照度环境下诱导植物开花的方法，所述方法包括在与栽培未导入FT基因 的同种非重组显花植物的照度环境相比较低的照度环境下栽培导入了 FT基因的转基因显 花植物的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，所述较低的照度环境是在未导入FT基因的同种植物 中不引起开花的照明条件下的栽培环境。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述较低的照度环境为50 lOOOLux的照度。
14.根据权利要求11 13中任一项所述的方法，其中，栽培所述转基因植物的条件是 组织培养或土壤栽培条件。
15.一种通过权利要求11 14中任一项所述的方法诱导显花的转基因植物，其中，所 述显花植物为玄参科的蓝猪耳、茄科的矮牵牛、茄科的赛亚麻、马鞭草科的马鞭草、蔷薇科 的蔷薇属植物或石竹科的康乃馨。
16.一种在低照度环境下能够开花的转基因植物试剂盒，其包含导入了 FT基因的转基 因显花植物。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述转基因植物为种子或开花前的苗木状 态的植物。
全文摘要
本发明提供在低照度下开花的显花植物的制备方法。具体地说，本发明涉及在低照度环境下能开花的转基因植物、所述转基因植物的制备方法、使所述植物开花的方法等。更具体地说，本发明涉及通过将FT基因导入植物中从而在低照度环境(例如屋内)下开花的工程化的转基因植物、所述转基因植物的制备方法、使所述其植物开花的方法等。
文档编号C12N15/09GK101888774SQ20088011941
公开日2010年11月17日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月7日
发明者田中良和 申请人:三得利控股株式会社