专利名称：猿猴亚家族C腺病毒SAdV-40、-31和-34及其应用的制作方法
猿猴亚家族C腺病毒SAdV-40、-31和-34及其应用
背景技术：
腺病毒是双链DNA病毒，基因组大小约为36千碱基(1Λ)，由于能够在多种靶组织 中实现高效基因转移以及较大的转基因容量，它被广泛用于基因转移应用。通常，腺病毒的 El基因缺失，被取代为由所选启动子、感兴趣基因cDNA序列和聚A信号组成的转基因盒，产 生复制缺陷型重组病毒。腺病毒的形态特征是由三种主要蛋白和许多群体小蛋白VI、VIII、IX、IIIa和 Iva2组成的二十面体衣壳，这三种主要蛋白是六邻体(II)、五邻体基质(III)和突结尾丝 (knobbed fibre)(IV)[W. C. Russell, J.Gen Virol.，81 :2573-3704(2000 年 11 月)]。病 毒基因组为线性双链DNA，末端蛋白共价连接于含有末端反向重复(ITR)的5’末端。病毒 DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX(之前称为mu)密切相连。另一种蛋白V与此DNA-蛋白 复合物包装在一起，并通过蛋白VI提供与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白 酶，这种蛋白酶是加工某些结构蛋白以产生成熟的感染性病毒所必需的。已经开发了一种对包括人、猿猴、牛、马、猪、羊、犬和负鼠腺病毒在内的哺乳动物 腺病毒家族进行分类的方法。这种分类方法的开发基础是该家族内的腺病毒序列凝集红 血细胞的能力不同。结果得到了六个亚组，现在称为亚组A、B、C、D、E和F。参见T. Sienk φ, Adenoviridae =The Viruses and theirR印Iication (腺病毒科病毒及其复制)，第 67章，选自FIELD' S VIROLOGY(菲尔德病毒学)，第6版，B. N Fields等编，(LR出版社 (Lippincott Raven Publishers)，费城，1996)，第 111-2112 页。已报道可使用重组腺病毒将异源分子递送至宿主细胞。参见美国专利6，083，716， 它描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。猿猴腺病毒C5、C6和C7已经描述于美国专利 7，247, 472，它可用作疫苗载体。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093，可用于制造腺
病毒疫苗载体。本领域需要能有效递送分子到靶点并尽可能降低人群中已有的免疫力对所选腺 病毒血清型的影响的载体。发明概述本文提供了亚家族C中三种新型猿猴腺病毒的分离的核酸序列和氨基酸序列以 及含有这些序列的载体。还提供了许多使用本发明所述载体和细胞的方法。这些腺病毒包 括 SAdV-40、SAdV-31和 SAdV-34。本文所述方法包括通过给予本发明所述载体将一种或多种所选异源基因递送到 哺乳动物患者。用本文所述组合物进行接种能够呈递所选抗原从而引发保护性免疫反应。 基于这些猿猴腺病毒的载体也可用于在体外制造异源基因产物。这种基因产物本身可用于 各种目的，例如本文所述的。本文将更加详细地描述本发明的这些和其他实施方式以及优点。
具体实施例方式本发明提供了全部分离自黑猩猩排泄物的猿猴腺病毒40、SAdV-31和SAdV_34的新的核酸和氨基酸序列。还提供了新型腺病毒载体和产生基于这些序列的载体的包装细胞系，用于在体外 产生重组蛋白质或片段或其它制剂。本发明还提供了用于递送治疗或疫苗目的的异源分子 的组合物。这些治疗性或疫苗组合物含有携带插入的异源分子的腺病毒载体。此外，所述 新型SAdV序列可用于提供产生重组腺相关病毒(AAV)载体所必需的辅助功能。因此，提供 了在此种产生方法中利用这些序列的辅助构建物、方法和细胞系。由于这些病毒来自亚组C，可将腺病毒亚组C衣壳递送给对象从而将这些病毒的 衣壳(任选完整的或重组的病毒颗粒或空衣壳)用于诱导免疫调节效应或增强的免疫应答 的方法。SAdV-40、SAdV-31或-34衣壳可单独递送或与活性剂组合递送以增强其免疫应答。 在另一方面，提供了在有此需要的对象中诱导产生干扰素α的方法，包括递送SAdV-40、 SAdV-31或SAdV-34衣壳到对象。再在另一个方面，提供了在培养物中产生一种或多种细胞 因子的方法。该方法包括在适合产生包括干扰素α等在内的细胞因子/趋化因子的条件 下培养含有树突细胞和本文所述SAdV衣壳的培养物。术语“基本上同源”或“基本上相似”指核酸或其片段时，表示当任选地将含相应核 苷酸插入或缺失的序列与另一核酸(或其互补链)排列对比时，对比的序列至少约95-99% 核苷酸序列相同。术语“基本上同源”或“基本上相似”指氨基酸或其片段时，表示当任选地将含相 应氨基酸插入或缺失的序列与另一氨基酸(或其互补链)排列对比时，对比的序列至少约 95-99 %的氨基酸序列相同。优选在全长序列，或其蛋白，或其至少8个氨基酸、或更理想至 少15个氨基酸长度的片段上具有上述同源性。本文描述了合适片段的实例。本文核酸序列所用术语“序列同一性百分率”或“相同”指当作最大排列对比时两 个序列中的残基相同。当将一个序列与另一个序列进行比对需要缺口时，根据没有缺口罚 分的较长序列计算评分程度。保留多核苷酸或由其编码的多肽的功能的序列最相同。序列 同一性比较的长度需要是基因组全长(例如，约361Λρ)、基因的开放读框的全长、蛋白、亚 基、或酶[参见，例如提供腺病毒编码区域的表]、或至少约500到5000个核苷酸的片段。 然而，也可能要求较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20到M个 核苷酸、至少约观到32个核苷酸、至少约36或更多核苷酸的片段。类似地，蛋白全长或其 片段的氨基酸序列的“序列同一性百分比”可容易地确定。适宜的是，片段长度至少为大约 8个氨基酸，也可长达大约700个氨基酸。本文描述了合适片段的实例。同一性可使用文中所述用默认设置的算法和计算机程序来容易地确定。优选在蛋 白质、酶、亚基的全长或至少约8个氨基酸长度的片段上具有这种同一性。然而，这种同一 性可基于较短的区域，适合产生相同的基因产物的区域。如本文所述，用各种从公共渠道获得或购得的多序列比对程序 (MultipleSequence Alignment Programs)进行比对，例如可通过互联网Web服务器 获得的“Clustal W”} 1Z20DDifef^A或者，也可使用载体NTI 实用程序[英杰公司 (InVitrogen)].还有许多本领域已知的算法也可用于测量核苷酸序列同一性，包括包含在 上述程序中的算法。作为另一个实例，可使用GCG 6. 1版中的程序i^asta 来比较多核苷酸 序列。hsta 可得出查询序列与检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6. 1版提供的i^asta 及默认参数(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系 数)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比，该程序此处引用作为参考。可采用相似程 序进行氨基酸比对。虽然本领域技术人员可视需要改变设置，但通常这些程序都以默认设 置使用。或者，本领域技术人员也可采用能够象上述算法和程序一样得出同一性水平或进 行比对的其他算法和计算机程序。“重组”用于多核苷酸时表示该多核苷酸是克隆、限制或连接步骤以及产生不同于 天然发现的多核苷酸的构建物的其他过程的不同组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷 酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建物的复制物以及原始病毒构建物的子 代。“异源”表示衍生自一种与其所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体。例 如，通过遗传工程技术引入来源于不同物种的质粒或载体的多核苷酸是异源多核苷酸。从 其天然编码序列上取下并操作性连接于天然情况下不连接的编码序列的启动子是异源启 动子。已被克隆入病毒基因组或病毒载体中的位点特异性重组位点是异源重组位点，其中 所述病毒基因组在天然情况下不含该位点。当具有重组酶编码序列的多核苷酸被用于遗 传改变正常情况下不表达该重组酶的细胞时，多核苷酸和重组酶对于该细胞而言都是异源 的。如本说明书和权利要求书中所用的术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包 括”等其它形式指包含其它组分、元素、数值、步骤等。术语“由…组成”不包括其它组分、元 件、整数、步骤等。I.猿猴腺病毒序列本发明描述了分离自与腺病毒天然相关的其它材料的猿猴腺病毒40(SAdV_40)、 SAdV-31或SAdV-34的核酸序列和氨基酸序列。A.核酸序列本发明的SAdV-40核酸序列包括SEQ ID NO 1的核苷酸1-37718。本发明的 SAdV-31核酸序列包括SEQ ID NO 32的核苷酸1-37828。本发明的SAdV-34核酸序列包括 SEQ ID NO :63的核苷酸1-37799。见纳入本文参考文献中的序列表。一实施方式中，所述核酸序列还包括分别与SEQ ID NO :1、32或63的序列互补的 链，以及与以下序列和它们的互补链的序列相对应的RNA和cDNA序列。在另一个实施方式 中，所述核酸序列还包括与序列表有98. 5%以上，更优选约99%以上同一性的序列。一个 实施方式中还包括SEQ ID NO :1、32或63中所提供序列以及它们互补链的天然变体和工程 构建修饰物。例如，这种修饰包括本领域已知的标记、甲基化、以及用简并核苷酸取代一个 或多个天然产生的核苷酸。
权利要求
1.一种腺病毒，其具有包含选自下组的衣壳蛋白的衣壳(a)SAdV-40的六邻体蛋白，SEQID NO :11的氨基酸1-960 ;SAdV_31的六邻体蛋白，SEQ ID NO 42的氨基酸1-954 ；SAdV-34的六邻体蛋白，SEQ IDNO 73的氨基酸1-958 ；(b)SAdV-40的五邻体蛋白，SEQ ID NO 6的氨基酸1-593 ；SAdV-31的五邻体蛋白，SEQ ID NO 37的氨基酸1-589 ；SAdV-34的五邻体蛋白，SEQ ID NO 68的氨基酸1-617 ；禾口(c)SAdV-40的尾丝蛋白，SEQ ID NO 20的氨基酸1-543 ；SAdV-31的尾丝蛋白，SEQ ID NO 51的氨基酸1-596 ；SAdV-34的尾丝蛋白，SEQ ID NO 82的氨基酸1-596 ；和所述衣壳将携带操作性连接于指导其在宿主细胞内转录、翻译和/或表达的表达控制 序列的异源分子衣壳化。
2.如权利要求1所述的腺病毒，其特征在于，还包含复制和衣壳化必需的5’和3’腺病 毒顺式元件。
3.如权利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒缺乏所有或部分El基因。
4.如权利要求3所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是复制缺陷型的。
5.如权利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述病毒具有杂交衣壳。
6.如权利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述载体包含选自SAdV-40、SAdV-31和 SAdV-34中多于一种的衣壳蛋白。
7.—种重组腺病毒，其具有含六邻体的衣壳和SAdV的异源核酸序列，所述六邻体含 有猿猴腺病毒六邻体蛋白片段，其中所述SAdV六邻体蛋白片段是具有长约50个氨基酸的 N-末端或C-末端截短的SEQ ID NO: 11、42或73所示的SAdV六邻体蛋白，或选自下组SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸残基 125-443 ；SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸残基 138-441 ；SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸残基 138-163 ；SEQ ID NO :11、42或73的氨基酸残基170-176 ；和SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸残基 404-430。
8.如权利要求7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述衣壳还包含SAdV-40、SAdV-31或 SAdV-34尾丝蛋白。
9.如权利要求7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述衣壳还包含SAdV-40、SAdV-31或 SAdV-34五邻体蛋白。
10.如权利要求7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是包含复制和衣壳化必 需的5’和3’腺病毒顺式元件的假型腺病毒，所述顺式元件包含腺病毒5’末端反向重复和 腺病毒3’末端反向重复。
11.如权利要求7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒包含编码产物的核酸序 列，所述核酸序列操作性连接于指导所述产物在宿主细胞内表达的序列。
12.如权利要求7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒包含一个或多个腺 病毒基因。
13.如权利要求7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是复制缺陷型的。
14.如权利要求13所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒的腺病毒El缺失。
15.一种组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的病毒和药学上可接受的载体。
16.一种靶向具有腺病毒受体的细胞的方法，所述方法包括给对象递送如权利要求1-14中任一项所述的病毒。
17.一种选自下组的分离的猿猴腺病毒核酸SEQ ID NO 1的猿猴腺病毒40核酸1-37718及其互补序列； SEQ ID NO 32的猿猴腺病毒31核酸1_37拟8及其互补序列；和 SEQ ID NO 63的猿猴腺病毒34核酸1-37799及其互补序列。
18.—种载体，其包含选自下组中一个或多个的猿猴腺病毒核酸序列猿猴腺病毒 40，SEQ ID NO 1 ； SAdV-31, SEQ ID NO :32 ；SAdV-34, SEQID NO :63 的(a)5，末端反向重复(ITR)序列；(b)腺病毒Ela区；(c)腺病毒Elb区，或其选自下组的片段小T、大T和IX区的开放读框；(d)E2b区，包括pTP、聚合酶和IVa区的开放读框；(e)Ll区，或其选自下组的片段52/55kD蛋白和IIIa蛋白的开放读框；(f)L2区，或其选自下组的片段五邻体、VII、VI和pX蛋白的开放读框；(g)L3区，或其选自下组的片段VI、六邻体和内切蛋白酶的开放读框；(h)Eh蛋白，包括DNA结合蛋白(DBP)的开放读框；(i)L4区，或其选自下组的片段100kD蛋白、33kD同源物、22kD同源物和VIII的开放 读框；(j)E3 区，或其选自下组的片段12. 5K、CRl-α、gpl9K、CRl-β、CRli、RID-α、 RID-β和14. 7Κ的开放读框；(k)L5区，或其选自下组的片段尾丝蛋白的开放读框；(1)E4 区，或其选自下组的片段E40RF6/7、E40RF6、E40RF4、E40RF3、E40RF2 和 E40RF1 的开放读框；和 (m)3’ ITR0
19.一种由权利要求18所述核酸序列编码的猿猴腺病毒蛋白。
20.一种组合物，其包含选自下组的一种或多种猿猴腺病毒蛋白 Ela，选自SEQ ID NO :29、60和91所示氨基酸序列；Elb，小T/19K，选自SEQ ID NO 22、53和64所示氨基酸序列； Elb，大T/55K，选自SEQ ID NO :2、33和84所示氨基酸序列； IX，选自SEQ ID NO 3,34和65所示氨基酸序列； 52/55D，选自SEQ IDNO :4、35和66所示氨基酸序列； Illa，选自SEQ ID NO :5、36和67所示氨基酸序列； 五邻体，选自SEQ ID NO 6,37和68所示氨基酸序列； VII，选自SEQ ID NO :7、38和69所示氨基酸序列； V，选自SEQ ID NO 8,39和70所示氨基酸序列； pX，选自SEQ ID NO 9,40和71所示氨基酸序列； VI，选自SEQ ID NO 10,41和72所示氨基酸序列； 六邻体，选自SEQ ID NO 11,42和73所示氨基酸序列； 内切蛋白酶，选自SEQ ID N0:12、43和74所示氨基酸序列； IOOkD,选自SEQ ID NO 13、44和86所示氨基酸序列；33kD，选自SEQ ID NO :31、62和93所示氨基酸序列； 22kD，选自SEQ ID NO :24、55和75所示氨基酸序列； VIII，选自SEQ ID NO :14、45和76所示氨基酸序列; 12. 5K，选自SEQ ID NO :15、46和77所示氨基酸序列； CRl-α，选自SEQ ID NO :25、56和87所示氨基酸序列； gpl9K，选自SEQ ID NO :16、47和78所示氨基酸序列； CRl-β，选自SEQ ID NO :17、48和79所示氨基酸序列； CRl-γ，选自SEQ ID NO :26、57和88所示氨基酸序列； RID-α，选自SEQ ID NO :18、49和80所示氨基酸序列； RID-β，选自SEQ ID NO 19、50和81所示氨基酸序列； 14. 7Κ，选自SEQ ID NO :27、58和89所示氨基酸序列；和 尾丝，选自SEQ ID NO :20、51和82所示氨基酸序列；
21. —种靶向具有腺病毒受体的细胞的方法，所述方法包括给对象递送如权利要求 20所述的组合物，所述组合物包含一种或多种选自六邻体、五邻体或尾丝的猿猴腺病毒 SAdV-40、-31 和-34 蛋白。
全文摘要
一种包含猿猴腺病毒SAdV-40、SAdV-31或SAdV-34序列以及受调节序列控制的异源基因的重组载体。还公开了表达猿猴腺病毒SAdV-40、SAdV-31或SAdV-34基因的细胞系。提供了使用所述载体和细胞系的方法。
文档编号C12N7/00GK102131920SQ200880118582
公开日2011年7月20日 申请日期2008年11月24日 优先权日2007年11月28日
发明者J·M·威尔森, L·H·范登伯格, S·罗伊 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会