含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸的制作方法

专利名称：含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸、JFH-I株与JFH-I株以外 的株(优选属于基因型la、Ib或2a的株)的嵌合丙型肝炎病毒颗粒、用于生产该病毒颗 粒的载体、以及生产该病毒颗粒的细胞。本发明还涉及使用该病毒颗粒来筛选抗HCV药的方法、将该病毒颗粒灭活或减 毒而得到的疫苗、以及将该病毒颗粒作为抗原识别的抗丙型肝炎病毒抗体。
背景技术：
丙型肝炎病毒(以下简称为“HCV” )于1989年由Ch00等人发现并鉴定为非 甲型非乙型肝炎的病因病毒(非专利文献1)。HCV感染是继慢性肝炎后仍持续感染并向 肝硬化、肝癌转变的主要病因，据报道，全球有约1亿7千万HCV感染者，日本就存在 约200万HCV感染者。HCV的主要感染途径是血液感染，自从可以进行输血用血液的 筛选后，虽说我国新的感染者锐减，但认为仍存在许多病毒携带者。目前的疗法主要是给予PEG化干扰素、或者将PEG化干扰素与抗病毒药利巴韦 林结合使用。迄今为止，人们将HCV分为6个基因型，在日本主要是基因型Ib和2a。 特别是关于基因型lb，其现实状况是即使给予干扰素和利巴韦林，也无法从体内完全 除去病毒，治疗效果也不充分。鉴于上述情况，人们希望开发以预防发病或排除病毒为 目的的新型抗病毒药或疫苗。进行HCV治疗药的开发时，除黑猩猩外，再无反映病毒感染的有效动物， 也不存在有效的体外病毒培养系统，这都成为阻碍。近年来，人们开发了可以评价 HCV-RNA的复制的HCV复制子(非专利文献2)，其作为与抑制病毒复制有关的HCV抑 制剂的筛选系统取得了重大的进步。HCV是基因组全长约9.6kb的正链的单链RNA病毒，翻译后经蛋白酶的剪切， 具有编码作为10种病毒蛋白(核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)的前体蛋白的基因。复制子系统是将HCV的结构蛋白的翻译区重组到耐药性 基因中，再在其下游插入EMCV(脑心肌炎病毒)的IRES而得到的系统，在导入有该重 组RNA的细胞内确认到RNA复制。但是，即使将含有HCV的结构蛋白的全长基因组 RNA导入细胞中，也没有确认到病毒颗粒释放到培养液中(非专利文献3)。近年来，由Wakita等人发现了从重症肝炎患者中分离的、属于基因型2a的HCV 株JFH1，明确了其以感染性病毒颗粒的形式被释放到Huh-7细胞(肝癌细胞株)培养液 中(专利文献1、非专利文献4)。该感染性HCV颗粒的体外培养系统被期待着在抗HCV 药开发中能够成为有用的筛选工具、同时在HCV疫苗的制作中也能成为有效的方法，进 行了在体外培养系统中产生HCV颗粒的研究，判明可以产生病毒颗粒的HCV基因组是 JFH-I株与JFH-I株以外的HCV的嵌合HCV。该嵌合HCV可以通过将JFH-I基因组的 结构基因、即核心、El、E2和p7蛋白编码部分与其他HCV株的结构基因重组来制作。作为JFH-I株以外的HCV株与JFH-I株的嵌合HCV，已知有J6CF株(基因型2a)与JFH-I株的嵌合HCV (非专利文献5)、H77株(基因型la)与JFH-I株的嵌合 HCV (专利文献2、非专利文献6)、以及S52株(基因型3a)与JFH-I株的嵌合HCV (非 专利文献7)。非专利文献8中显示包含J6CF的结构基因和JFH-I的非结构基因的嵌合HCV 的病毒产量最高，而作为基因型Ib的Conl株与JFH-I株的嵌合HCV的感染性HCV颗 粒的产量为1/10以下。作为其他基因型Ib株与JFH-I株的嵌合HCV，专利文献3中记 载着制作将编码TH株的结构蛋白的区与JFH-I基因组重组、并在其编码基因上游插 入耐药性基因的基因组(全长基因组复制子RNA)，将其导入Huh-7细胞中后获得耐药性 株，从而在其培养上清中产生感染性HCV颗粒，但没有阐明其生产性。鉴于上述状况，人们需要开发可以使对现有疗法的见效性差、而且具有患者人 数多的基因型Ib结构的感染性HCV颗粒高产、并且可以在持续感染系统中培养的HCV 颗粒生产法。专利文献1 国际公开W005080575A1专利文献2 国际公开W006096459A2专利文献3 国际公开W006022422A1非专利文献1: Choo，QL 等人，Science，244 359-362，1989非专利文献2: Lohmann, V.等人，Science.，285 110-113，1999非专利文献3: Pietschmann, T.等人，J.Virol.，76: 4008-4021，2002非专利文献4: Wakita, T.等人，Nat.Med.，11: 791-796，2005非专利文献5: Lindenbach, B.D.等人，Science，309 623-626，2005非专利文献6: MinKyung, Y.等人，J.Virol.，81: 629-638，2007非专利文献7: Gottwein, JM 等人，Gastroenterology 133 1614-1626，2007非专利文献8 Pietschmann, T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 103 7408-7413， 200
发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于提供高效制作具有属于基因型la、Ib或2a的JFH-I株以外 的HCV株的结构蛋白的HCV颗粒的方法、以及使用所制作的HCV颗粒的疫苗等。解决课题的方法本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，对HCV颗粒在细胞培养中的生 产性进行了研究，发现了HCV增殖时出现的适应性突变(adaptivemutation)。明确了 通 过导入该适应性突变，与突变导入前的野生型相比，可以显著提高HCV颗粒的生产性， 利用持续感染系统可以制作具有属于基因型la、Ib或2a的HCV株的结构蛋白的HCV颗 粒，从而完成了本发明。BP,本发明涉及以下⑴ (22)。(1)核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来 自JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自上述 JFH-I株或上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白或来自上述JFH-I株的NS2蛋白与来自上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白的嵌合NS2蛋白、以及来自 上述JFH-I株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各区按 照该顺序从5’侧向3’侧配置而形成的，从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的脯氨酸残基被取代成脯 氨酸残基以外的氨基酸残基。(2)上述(1)所述的核酸，其中，在编码上述核心蛋白的区的5’侧含有上述 JFH-I株的5’非翻译区，在编码上述NS5B蛋白的区的3’侧含有上述JFH-I株的3’
非翻译区。(3)上述⑴或⑵所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株是 属于基因型la、Ib或2a的株。(4)上述(1) (3)中任一项所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎 病毒株选自TH株、Conl株、Jl株和它们的衍生株。(5)上述(1) (4)中任一项所述的核酸，其中，上述脯氨酸残基以外的氨基酸 残基选自 Ala、Leu、lie、VaL Thr 和 Ser。(6)上述(1) (5)中任一项所述的核酸，其中，上述核酸是包含序列表的 SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列 的DNA、或者是包含序列表的SEQ ID NO : 3所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有 90%以上同源性的核苷酸序列的RNA。(7)上述(1) (5)中任一项所述的核酸，其中，上述核酸是包含序列表的 SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列 的DNA、或者是包含序列表的SEQ ID NO : 4所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有 90%以上同源性的核苷酸序列的RNA。(8)载体，该载体含有上述(1) (7)中任一项所述的核酸。(9)嵌合丙型肝炎病毒颗粒，其中含有上述⑴ (7)中任一项所述的核酸作为
病毒基因组。(10)细胞，该细胞生产上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒。(11)上述(10)所述的细胞，其中，上述细胞为Huh-7或其衍生株。(12)筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括在被检物质的存在下培养 下述(a)或(b)的细胞，之后检测所得培养物中的来自上述核酸的复制子RNA或病毒颗 粒(a)上述(10)或(11)所述的细胞、或(b)上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒敏感细胞。(13)丙型肝炎病毒疫苗，其中含有上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒。(14)上述(13)所述的丙型肝炎病毒疫苗，其中，上述嵌合丙型肝炎病毒颗粒被 灭活或减毒。(15)抗丙型肝炎病毒抗体，该抗体将上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒作 为抗原识别。(16)上述(4)所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株为TH株 或其衍生株。
5
(17)上述(5)所述的核酸，其中，上述脯氨酸残基以外的氨基酸残基为Ala或 Thr。(18)嵌合丙型肝炎病毒颗粒的制作方法，该方法包括下述步骤培养上述(10)或(11)所述的细胞的步骤；以及回收上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒的步骤。(19)丙型肝炎病毒疫苗的制造方法，该方法包括下述步骤将上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒灭活或减毒，制备灭活或减毒的嵌合 丙型肝炎病毒颗粒的步骤；以及将上述灭活或减毒的嵌合丙型肝炎病毒颗粒制成丙型肝炎病毒疫苗形式的制剂 的步骤。(20)抗丙型肝炎病毒抗体的制作方法，该方法包括下述步骤用已进行或未进行灭活或减毒的上述(9)所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒对动物 (人除外)进行免疫的步骤。(21)上述(20)所述的制作方法，其中，上述抗丙型肝炎病毒抗体为多克隆或单 克隆抗体。(22)上述(20)所述的制作方法，其中，上述抗丙型肝炎病毒抗体为人源化抗体。发明效果本发明的含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸可用于生产产生性显著高于 野生型HCV颗粒的嵌合HCV颗粒。此外，本发明的嵌合HCV颗粒与野生型HCV颗粒 相比，具有以下优点具有显著高的生产性和对细胞的高感染性，因此其作为HCV的预 防或治疗用疫苗、以及作为诱导抗HCV抗体的工具，利用价值均高。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2008-116193号的说 明书和/或附图中记载的内容。


图1显示pTH/JFHl质粒的制作方法。在pJFHl的序列中，将以JFH-1的核心
蛋白的氨基酸序列N末端的氨基酸残基为第1位时编码第1位氨基酸残基 第846位氨基 酸残基的核苷酸序列重组到以TH株的核心蛋白的氨基酸序列N末端的氨基酸残基为第1 位时编码第1位氨基酸残基 第843位氨基酸残基的核苷酸序列中。图2显示将根据pTH/JFHl合成的RNA导入Huh_7细胞中后，反复进行传代培 养，在每次进行该传代培养时测定的培养上清中HCV核心蛋白的浓度变化。培养上清中 的核心蛋白直至第23天都在减少，但此后增加，第34天以后显示恒定的高值。图3A显示pTH/JFHl (PA)质粒的制作方法。图3B显示pTH/JFHl (PT)质粒的制作方法。图4 显示将根据 pTH/JFHl、pTH/JFHl (PA)和 pTH/JFHl (PT)合成的 RNA 导入 Huh-7细胞中后，反复进行传代培养，在每次进行该传代培养时测定的培养上清中HCV 核心蛋白的浓度变化。与图2—样，TH/JFH-I在导入后直至第29天都在减少，但此后 增加。另一方面，在TH/JFH_1(PA)和TH/JFH_1(PT)中，导入后从初期起在培养上清中确认到高的核心蛋白，与TH/JFH-1相比，在任何情况下均维持高值。图5A显示将根据pTH/JFHl和pTH/JFHl (PA)合成的RNA导入Huh_7细胞中 后，直至96小时后的培养上清中HCV核心蛋白的浓度变化。与TH/JFH-1相比，在TH/ JFH-I (PA)的培养上清中，从导入RNA 48小时后起核心蛋白的产量变高。图5B显示将图5A中得到的各培养上清接种在未感染Huh_7细胞中时的感染效 价。与TH/JFH-1相比，在TH/JFH-1 (PA)的培养上清中，从导入RNA 48小时后起感 染效价高。图6所示的表是定量图5所示的实验中得到的培养上清的HCV核心蛋白浓度和 对Huh-7细胞的感染效价、以及此时细胞内的HCV核心蛋白浓度而制成的表。96小时 后的核心蛋白与4小时后的细胞内核心蛋白之比表示TH/JFH-1和TH/JFH-1 (PA) RNA在 细胞内的自主复制的程度。HCV核心分泌效率是HCV颗粒向培养上清中的分泌效率的指 标，该效率通过用(96小时后培养上清中的核心蛋白量)除以(96小时后培养上清中的核 心蛋白量+96小时后细胞内的核心蛋白量)来计算。与TH/JFH-1相比，在导入了 TH/ JFH-I (PA)RNA的细胞中，HCV颗粒向培养上清中的分泌效率上升。
具体实施例方式本发明的核酸，通常以含有编码JFH-I株的非结构蛋白的核苷酸序列和编码 JFH-I株以外的HCV株的结构蛋白的核苷酸序列的HCV的嵌合基因为特征，除此之外， 其特征还在于含有编码具有特定的氨基酸突变的El蛋白的核苷酸序列。具体而言，本发明的核酸涉及下述(1)、(2)所述的内容(1)含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来自JFH-I株以 外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自上述JFH-I株或上 述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白或来自上述JFH-I株的NS2蛋白与来自上 述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白的嵌合NS2蛋白、以及来自上述JFH-I株 的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各区按照该顺序从5’ 侧向3’侧配置而形成的；(2)含有编码复合蛋白(前体蛋白)的核苷酸序列，所述复合蛋白中，以上述核 心蛋白的N末端的氨基酸残基即甲硫氨酸残基为第1位时，第328位(或者以El蛋白的 N末端的氨基酸残基为第1位时，第137位)的氨基酸残基从脯氨酸残基取代成脯氨酸残 基以外的氨基酸残基。在本发明的核酸中，NS2蛋白可以来自JFH-I株，也可以来自JFH-1株以外 的HCV株，或者，可以是包含来自JFH-I株以外的HCV株的NS2蛋白的一部分和来自 JFH-I株的NS2蛋白的剩余部分的嵌合蛋白，此时，该嵌合蛋白与野生型NS2蛋白具有 同样的功能，例如，当来自JFH-I株以外的HCV株的NS2蛋白的一部分包含NS2蛋白 的N末端 33位的氨基酸序列时，来自JFH-I株的NS2蛋白的剩余部分包含34位 C 末端的氨基酸序列。另外，作为上述来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，可以例示例如包含序列表的 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的第341位 第9433位核苷酸的DNA、或包含序列表 的SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的第341位 第9433位核苷酸的RNA。
7
在本发明的实施方式中，本发明的核酸可以进一步在编码上述核心蛋白的区的 5’侧含有上述JFH-I株的5’非翻译区、在编码上述NS5B蛋白的区的3’侧含有上述 JFH-I株的3’非翻译区。在本发明的实施方式中，上述JFH-I株以外的HCV株是属于基因型la、Ib或2a 的株。属于基因型Ib的株包括例如TH株、Conl株、Jl株以及它们的衍生株。属于 基因型Ia的株包括例如H77株。属于基因型2a的株包括例如J6CF株等。优选的 株是属于基因型Ib的上述例示的株，进一步优选为TH株或其衍生株。在本发明中，从 来自例示的株的上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的氨基酸残基必需突 变成脯氨酸残基以外的氨基酸残基。在本发明的另一实施方式中，脯氨酸残基以外的其他氨基酸残基例如是Ala、 Leu、lie、VaL Thr 或 Ser，优选为 Ala 或 Thr。在本发明的实施方式中，上述核酸为包含SEQ ID NO : 1所示的核苷酸序列的 DNA、或包含SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列的RNA。或者，在又一实施方式中，上 述核酸为包含SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列的DNA、或包含SEQ ID NO 4所示的 核苷酸序列的RNA。这些核酸是来自JFH-I株和TH株的嵌合核酸，SEQ IDNO 1或 SEQ IDNO 3的核酸包含从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起第328位的氨基酸 残基为Ala的密码子(第1322位 第1324位的核苷酸)，而SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的核酸除了包含从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起第328位的氨基酸残 基为Thr的密码子(第1322位 第1324位的核苷酸)以外，还包含各自相同的核苷酸序 列。此外，由相当于SEQ ID NO: 1所示的DNA的ORF的核苷酸序列编码的氨基 酸序列(核心的N末端 NS5B的C末端的序列)见SEQID NO 6，由相当于SEQ ID NO 2所示的DNA的ORF的核苷酸序列编码的氨基酸序列(核心的N末端 NS5B的 C末端的序列)见SEQ IDNO 7。本发明的上述核苷酸序列可以由与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID
NO: 3或SEQ ID NO: 4的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选98 99%以上同源性的核苷酸序列构成，但这种情况下，从SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO: 4的核苷酸序列的5’末端的核苷酸数起，第1322位 第1324位的核苷酸编码脯氨酸以外的氨基酸残基(参照上述)。另外，本发明的上述氨基酸序列可以由与SEQIDNO 5或SEQ IDNO 6的氨
基酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选98 99%以上同源性的氨基酸序列 构成，但这种情况下，从核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的氨基酸残基编 码脯氨酸残基以外的氨基酸残基(参照上述)。其原因在于如已知作为RNA病毒的HCV存在几种基因型一样，结构区、非 结构区和/或(5’或3’)非翻译区容易发生突然突变。在本发明中，上述“从核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起第328位的氨基酸 残基”，是指在包含对序列表的SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 6或SEQ ID NO 7所示 的氨基酸序列(核心的N末端 NS5B的C末端的序列)进行排比的HCV的核心的N 末端 NS5B的C末端的氨基酸序列中，与序列表的SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7的第328位的氨基酸残基被排比在同一位置的氨基酸残基。此外，在本发 明中，“从核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的脯氨酸残基被取代成脯氨 酸残基以外的氨基酸残基”，是指如上操作，与序列表的SEQ ID NO: 5的第328位的脯 氨酸残基排比在同一位置的、预定的氨基酸序列中的氨基酸残基为脯氨酸残基以外的氨 基酸残基。本说明书中使用的、两个序列间的“％同源性”，是指核苷酸序列或氨基酸序 列所共有的位置的数的函数，通过导入或不导入缺口使两个序列进行比对时，同源位置 的数占位置总数的百分比。“％同源性”可以通过利用BLASTN、BLASTX、Gapped BLAST 等数学算法(Karlin和 Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90: 5873-5877，1993 ； Altschul 等人，NucleicAcids Res.，25: 3389-3402，1997 等)来确定。本发明提供含有上述核酸的载体或嵌合HCV颗粒。该嵌合HCV颗粒与野生型 相比，具有以下特征在细胞培养系统中可以高效率地生产，并具有高感染性。该高效 率生产或高感染性这样的效果起因于从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第 328位的氨基酸残基突变成Pro以外的氨基酸残基(优选Ala或Thr)，这由图4和图5所 示的结果可以明确。制作本发明的核酸、载体和嵌合HCV颗粒时，可以使用处于本领域的技术范围 内的分子生物学、病毒学等现有技术。这样的技术记载在学术文献、专利文献、专业书 籍等中，例如包括Sambrook 等人、MolecularCloning: A Laboratory Manual (第 3 版， 2001，CSHL PRESS) ； Mahy 等人、Virology: a practical approach (1985, IRL PRESS)； Ausubel 等人、Current Protocols in Molecular Biology (第 3 版，1995, John Wiley&Sons)； 美国专利第 4,683,202 号(Cetus Corporation ； PCR 法)等。为了生产本发明的核酸或感染性HCV颗粒，以将来自JFH-I株或JFH-I株以 外的HCV株的基因组RNA的cDNA克隆化得到的载体为模板，通过使用由该cDNA的 序列设计的正向和反向引物进行聚合酶链反应(PCR)，可以扩增目标的序列部分。具 体而言，如图1或图3所示，合成多个彼此具有重复序列的不同的PCR产物，混合这些 PCR产物，以其为模板，通过使用含有目标核酸的5’端的正向引物和含有该核酸的互 补链的5’端的反向引物进行PCR，可以扩增该目标核酸。用限制酶切断已合成的核酸 的各末端，将其连接在用相同的酶切断的质粒pJFHl(Wakita，Τ.等人，Nat.Med.，11: 791-796，2005 ；国际公开W02004/104198)上。这种操作的基本技术也记载在例如 W004104198A1、W006022422A1、Wakita, T.等人，Nat.Med.，11: 791-796，2005 和 Lindenbach, B.D.等人，Science，309 623-626，2005 中。PCR反应非限定性地包括下述操作条件在模板、弓I物、dNTPs、耐热性聚合 酶、含Mg2+缓冲液的存在下，以包含94 98°C约10 60秒、55 58°C约10 60秒、 72°C约30 60秒的步骤作为1个循环，进行20 40个循环。HCV基因组通常是包含5’非翻译区、核心蛋白编码区、El蛋白编码区、E2 蛋白编码区、p7蛋白编码区、NS2蛋白编码区、NS3蛋白编码区、NS4A蛋白编码区、 NS4B蛋白编码区、NS5A蛋白编码区、NS5B蛋白编码区和3’非翻译区的RNA。相对 于此，可以生成感染性HCV颗粒的本发明的核酸由2种或2种以上HCV株的病毒基因组 RNA或编码该RNA的DNA构成。
本发明的核酸中，例如，5’非翻译区、编码一部分NS2蛋白的区、NS3蛋白编 码区、NS4A蛋白编码区、NS4B蛋白编码区、NS5A蛋白编码区、NS5B蛋白编码区和 3’非翻译区来自JFH-I株，而核心蛋白编码区、El蛋白编码区、E2蛋白编码区、p7蛋 白编码区和编码NS2蛋白的剩余部分的区来自JFH-I株以外的HCV株。其中，5’非 翻译区可以来自JFH-I株以外的HCV株。或者，在本发明的嵌合核酸的另一例子中，5’非翻译区、核心蛋白编码区、 El蛋白编码区、E2蛋白编码区、p7蛋白编码区和NS2蛋白编码区来自JFH-I株以外的 HCV株，而NS3蛋白编码区、NS4A蛋白编码区、NS4B蛋白编码区、NS5A蛋白编码 区、NS5B蛋白编码区和3’非翻译区来自JFH-I株。或者，在本发明的核酸的又一例子中，5’非翻译区来自JFH-I株，而核心蛋白 编码区、El蛋白编码区、E2蛋白编码区、p7蛋白编码区和编码一部分NS2蛋白的区来自 TH株，编码NS2蛋白的剩余部分的区、NS3蛋白编码区、NS4A蛋白编码区、NS4B蛋 白编码区、NS5A蛋白编码区、NS5B蛋白编码区和3’非翻译区来自JFH-I株，但是， 核心蛋白编码区、El蛋白编码区、E2蛋白编码区、p7蛋白编码区只要来自TH株即可， 并不限于该嵌合核酸。以下，进一步对本发明的载体、感染性HCV颗粒、产生HCV颗粒的细胞、 HCV颗粒的应用进行详细说明。(1)载体的制作丙型肝炎病毒(HCV)的基因组是全长约9600个核苷酸的正链的单链RNA。该 基因组RNA包含5’非翻译区(也记作5’ NTR或5’ UTR)、由结构区和非结构区构 成的翻译区、以及3’非翻译区(也记作3’ NTR或3’ UTR)。在其结构区中，HCV 的结构蛋白被编码；而在非结构区中，多个非结构蛋白被编码。这样的HCV的结构蛋白(核心、El、E2和p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)由翻译区以一系列多蛋白复合蛋白(前体蛋白)的形式 被翻译，之后在感染细胞内经蛋白酶的限定分解而游离、生成。这些结构蛋白和非结构 蛋白(即HCV的病毒蛋白)中，已知Core(核心)是核心蛋白，El和E2是包膜蛋白。 非结构蛋白是参与病毒自身复制的蛋白，NS2具有金属蛋白酶活性、NS3具有丝氨酸蛋 白酶活性(N末端侧的三分之一)和解旋酶活性(C末端侧的三分之二)。并且，还有报 道称NS4A是抗NS3的蛋白酶活性的辅因子，而NS5B具有RNA依赖性RNA聚合酶活 性。HCV由被称作包膜的被膜包覆。包膜包含来自宿主细胞膜的成分和来自病毒的 蛋白。构成HCV的包膜的蛋白包含包膜蛋白1(称作El)、包膜蛋白2(称作E2)和p7。 特别是El和E2在其C末端具有跨膜区，经由该跨膜区被锚定在HCV的膜上。因此， HCV的El和E2蛋白面向外界，HCV经由El禾Π /或Ε2粘附在细胞上进行感染。按照使用HCV株的核苷酸序列的系统分析法，HCV被分为基因型1 基因型6 这6种类型，上述各类型又被进一步分成若干亚型。而且，关于HCV的多个基因型，其 基因组全长的核苷酸序列也被确定(Simmonds，P.等人，Hepatology，10 1321-1324， 1994 ；以及 Choo，Q.L.等人，Science，244 359-362, 1989 ； Okamoto，H.等人， J.Gen.Virol., 73 73-679，1992 ； Mori, S.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.183 334-342，1992)。具体而言，作为基因型Ia的HCV株，已知有H77株(GenBank检索 号AF011751)；作为遗传型Ib型的HCV株，已知有Jl株(GenBank检索号D89815)、 Conl 株(GenBank 检索号 AJ238799，有时也称作 Con-Ι 株、conl 株)和 TH 株(Wakita， Τ.等人，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994、日本特开 2004-179)；作为基因型 2a 的HCV株，已知有JFH-I株(GenBank检索号AB047639，有时也称作JFHl株)、J6CF 株(GenBank 检索号 AF177036)、JCH-1 (GenBank 检索号 AB047640)、JCH-2 (GenBank 检索号 AB047641)、JCH-3 (GenBank 检索号 AB047642)、JCH-4 (GenBank 检索号 AB047643)、JCH-5 (GenBank 检索号 AB047644)和 JCH-6 (GenBank 检索号 AB047645)。 并且，作为基因型2b的HCV株，已知有HC-J8株(GenBank检索号D01221)等；作为基 因型3a的HCV株，已知有NZLl株(GenBank检索号D17763)、S52 (GenBank检索号) 等；作为基因型3b的HCV株，已知有Tr-Kj (GenBank检索号D49374)等，作为基因型4a 的HCV株，已知有ED43 (GenBank检索号)等。关于其他株，已经报道了 GenBank检索 号的列表(Tokita，Τ.等人，J.Gen.Virol.，79: 1847-1857，1998、Cristina, J.&Colina， R.，Virol.J., 3 1-8, 2006)。本发明中记载的JFH-I株和JFH-I株以外的HCV株的基因组核苷酸序列可以从 上述文献或GenBank中获取，另外，JFH-I株以外的HCV株可以从上述基因型中选择， 但优选的基因型为属于la、Ib或2a的株。嵌合HCV基因可以如下制作以将各HCV基因组RNA的cDNA克隆化得到的 载体为模板，以合成DNA为引物进行PCR，扩增各HCV基因的必需区并连接起来，由 此制作嵌合HCV基因。进一步将嵌合HCV 基因 cDNA 与质粒 pJFHl (Wakita，Τ.等人，Nat.Med.，11: 791-796，2005、国际公开W02004/104198)的T7启动子等启动子下游的适当的限制位
点连接，可以制作用于合成HCV基因组RNA的载体。若将由该载体转录的RNA导入 Huh-7等细胞中，则引起病毒的复制和组装，可以产生感染性HCV颗粒。(2) HCV颗粒的制作由在启动子的控制下克隆化的HCV cDNA合成RNA，将该RNA导入细胞中，
从而可以制作嵌合HCV颗粒。S卩，嵌合HCV颗粒可以通过包括以下步骤的方法来制作培养生产该HCV颗 粒的细胞的步骤；以及回收该HCV颗粒的步骤。其中，生产HCV颗粒的细胞可以通过 使本发明的嵌合HCV颗粒感染HCV敏感细胞(即、允许HCV颗粒形成的细胞)而得到。对启动子没有限定，可以列举T7启动子、SP6启动子、T3启动子等，但优选 T7启动子。以在T7启动子的控制下将HCV cDNA克隆化得到的核酸为模板，在体外制作 RNA,该方法例如可以使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion社)来实施。导入RNA的细胞只要是允许HCV颗粒形成的细胞即可，可以列举Huh_7细 胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293、293T细胞或它们的衍生株，进一步 优选列举Huh-7细胞或作为其衍生株的Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞等。另外，还可以 列举使CD81基因和/或Claudin-I基因在Huh_7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、 HeLa细胞、293或293T细胞中表达而得到的细胞(Lindenbach，B.D.等人，Science,
11309 623-626，2005 ； Evans, M.J.等人，Nature，446 801-805，2007 ； Akazawa, D.等人，J.Virol.，81 5036-5045，2007)。作为导入RNA的方法，可以列举磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转 染法、微量注射法、电穿孔法，优选脂质转染法和电穿孔法，进一步优选为电穿孔法。另外，导入cDNA时，可以使HCVcDNA在使用RNA聚合酶I启动子和终止子 的系统(W027037428A1)中表达。细胞的病毒颗粒产生能力可以使用抗构成释放到培养液中的HCV病毒颗粒的、 例如核心蛋白、El蛋白或E2蛋白的抗体来检测。另外，利用使用特异性引物的RT-PCR 法扩增培养液中的HCV病毒颗粒所含有的HCV基因组RNA并检测，从而也可间接检测 HCV病毒颗粒的存在。所制作的病毒是否具有感染能力，这可以如下判断培养导入有HCVRNA的 细胞，使所得的上清与HCV容许性细胞(例如Huh-7或其衍生株)接触，例如在48小 时后用抗核心抗体对细胞进行免疫染色，以计算感染细胞数，或者，使细胞提取物在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，利用蛋白质印迹法检测核心蛋白，由此可以判断。(3)获取产生颗粒的细胞株研究显示为了进行HCV基因组的有效复制，必需在基因组的核苷酸序列中发 生突变(Lohmann，V.等人，J.Virol.，75: 1437-1449，2001)，将提高复制的突变称作适 应性突变(adaptive mutation)。通过对上述(2)制作的、导入有HCV基因组RNA的细胞
进行传代培养，可以得到持续生产HCV颗粒的细胞株。通过如此地继续培养，在HCV 基因组中发生适应性突变，有时会显著提高HCV颗粒生产。利用这种现象的典型例子为将嵌合HCV的基因组RNA导入细胞中，选择病 毒生产性提高的突变体的方法。这样的突变的例子有H77株与JFH-I株的嵌合HCV 颗粒中的允许突变(MinKyungY等人，JVirol.，81 629-638, 2007)。允许突变根据病 毒株、嵌合HCV基因组的设计(构建物)、实验条件随机发生。因此，该突变在基因型 Ib中也不具有适合的必然性，所以必须对每个所期望的构建物进行实验，获得允许突变 体。通过1个氨基酸残基的突变，复制能力或HCV颗粒生产性发生很大变化，突变 根据HCV的基因型、培养中使用的细胞的种类、实验而各不相同。另外，由于利用杂交 技术无法检测1个氨基酸残基发生突变所必需的核酸的突变，所以为了检测这些突变， 必须测定HCV的基因序列。因此，从这样的细胞中分离HCV基因组RNA，确定其核苷酸序列，从而可以明 确能够高产HCV颗粒的HCV基因组序列。并且，为了确认这些突变是否与HCV复制能力或HCV颗粒生产性有关，必需 向原始的HCV基因组中导入突变，以确认HCV复制能力或HCV颗粒生产性是否再现。 向原始的HCV基因组中导入突变时，可以使用PCR法或市售的突变导入试剂盒(例如东 洋纺社制的KOD-Plus-诱变试剂盒等)。另外，有关该突变是否对使用的HCV基因组具有特异性、或者对其他HCV基因 组也有效，可以向没有突变的HCV基因组中再次导入突变来确认。在本发明中，以TH/JFH-1 (后述实施例1)的核心蛋白N末端的氨基酸残基为第1位时，确认第328位氨基酸残基(或者，以El蛋白N末端的氨基酸残基为第1位 时，第137位氨基酸残基)、即脯氨酸残基突变成丙氨酸残基或苏氨酸残基。此外，还 暗示从上述核心蛋白N末端的氨基酸残基起第328位氨基酸残基不仅与TH株共通，还 与基因型 Ib 的 Conl 株(GenBank 检索号 AJ238799)、Jl 株(GenBank 检索号 D89815)、 基因型Ia的H77株(GenBank检索号AFOl 1751)、基因型2a的JFH-1株(GenBank检索 号AB047639)、J6CF株(GenBank检索号AF177036)共通，由脯氨酸残基突变成其他氨 基酸残基、优选丙氨酸残基或苏氨酸残基不仅对TH株有效，对具有脯氨酸残基作为从核 心蛋白N末端的氨基酸残基起第328位氨基酸残基的任意HCV株均有效。(4) HCV颗粒的应用HCV颗粒适合于作为疫苗的用途、作为用于制作抗HCV抗体的抗原的用途。具体而言，还可以将HCV颗粒直接用作疫苗，但也可以利用该领域中已知的方 法将其减毒或灭活后使用。病毒的灭活可以通过将福尔马林、丙内酯、戊二醛等灭 活剂例如添加混合到病毒悬浮液中，使其与病毒反应而达成(Appaiahgari，M.B.&Vrati, S., Vaccine, 22: 3669-3675，2004)。此外，认为减毒疫苗可以通过使嵌合HCV颗粒 感染培养动物细胞或动物(人除外)，并反复进行传代培养以极度减弱病原性而得到，或 者，通过基因操作将与HCV的增殖性或感染性有关的区、例如核心-NS5B区改变成负的 (negative),从而也可以减弱病原性。这样，本发明的HCV疫苗可以通过包括下述步骤的方法来制造将本发明的上 述嵌合HCV颗粒灭活或减毒，制备灭活或减毒的嵌合HCV颗粒的步骤；以及将该灭活 或减毒的嵌合HCV颗粒制成HCV疫苗形式的制剂的步骤。本发明的疫苗例如可以制成溶液或悬浮液中的任一种给药形式的制剂。或者， 可以以适于溶解或悬浮于液体中的固体(例如冻干制品)的形式来制备，使之在临用前可 以重新构成。或者，可以将这样的固体或制品在药用表面活性剂的存在下乳浊，或者可 以胶囊化成脂质体。HCV颗粒等活性免疫原性成分通常可以和药学上可接受且适合于活性成分的赋 形剂常常混合在一起。适当的赋形剂包括例如水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇 等、以及它们的混合物。并且，根据需要，疫苗中可以含有少量辅助剂(例如加湿剂或乳化剂)、pH缓 冲剂和/或提高疫苗效能的佐剂。对能够起效的佐剂的例子没有限定，包含氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏 氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰_L_丙氨酰_D_异谷氨酰胺 (也称作CGP11637、nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨 酸-2-(1，-2，- 二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)_乙胺(也称作CGP19835A、 MTP-PE)和RIBI。 其中，RIBI在2%角鲨烯/Tween(注册商标)80乳剂中可以 含有从细菌中提取的3种成分、即单磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架 (HPL+TDM+CWS) ο佐剂的效能可以通过给予哺乳动物由HCV颗粒构成的疫苗，测定产生的抗体量 来确定。本发明的疫苗通常通过胃肠外给药、例如皮下注射或肌肉内注射这样的注射进行给药。作为适于其他给药方式的其他处方，例如有栓剂、以及某些场合会使用的口服 处方药。根据需要，可以在HCV疫苗中加入1种以上具有佐剂活性的化合物。佐剂是该 免疫系统的非特异性刺激因子。它们增强宿主对HCV疫苗的免疫应答。该技术领域中 公知的佐剂的具体例子有弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞 壁酰二肽、皂角苷、矿物油、植物油和CarbopoK卡波普)。特别适合粘膜使用的佐剂例 如有大肠杆菌(Exoli)易热性毒素(LT)或霍乱毒素(CT)。其他适当的佐剂例如有 氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油性乳剂(例如Bayol (注册商标)或Marcol 52 (注册商标) 的乳剂)、皂角苷或维生素E增溶剂。因此，在优选方式中，本发明的疫苗含有佐剂。例如，在进行皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药的注射剂中，可以将本发明的 HCV疫苗与医药上可接受的载体或稀释剂的其他具体例子、例如稳定化剂、碳水化合物 (例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血 清或脱脂乳等含蛋白的物质以及缓冲液(例如磷酸缓冲液)等一同给药。栓剂所使用的、现有的粘合剂和载体可以包含例如聚亚烷基二醇或三甘油。 这样的栓剂可以由以重量百分比计含有0.5% 50%的范围、优选 20%的范围的活 性成分的混合物形成。口服处方药含有通常使用的赋形剂。作为该赋形剂，例如有药用 级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。将本发明的疫苗制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释处方药或粉末 剂的形式，以重量百分比计含有10% 95%、优选25% 70%的活性成分(病毒颗粒或 其一部分)。本发明的疫苗按照适合于给药剂型的方法、以及具有预防和/或治疗效果的量 进行给药。给药的适合量通常为每次给予O.Olyg 100,OOOyg范围的抗原，这取决 于所处置的患者、该患者的免疫系统中的抗体合成能力、以及所期望的防御程度，还取 决于口服、皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药途径等给药途径。本发明的疫苗可以按照单独给药方案进行给药，或者优选按照复合给药方案进 行给药。按照复合给药方案给药时，在开始接种的时期进行1 10的个别给药，然后可 以按照维持和/或强化免疫应答所必需的时间间隔进行另一次给药，例如在1 4个月后 进行第2次给药。根据需要，数个月后可以接着进行给药。给药的概要也至少部分根据 个体的必要性来决定，依赖于医生的判断。并且，本发明的含有HCV颗粒的疫苗可以和其他免疫控制剂(例如免疫球蛋白)
一同给药。并且，通过本发明还提供下述方法通过将本发明的HCV颗粒疫苗给予健康 人，在健康人中诱导对HCV的免疫应答，用于预防新的HCV感染。本发明还提供用作 治疗性疫苗的方法将本发明的HCV颗粒疫苗给予已感染HCV的患者，在体内诱导对 HCV的强免疫反应，从而排除HCV。本发明的HCV颗粒作为用于制作抗体的抗原也有效。识别用作抗原的本发明 的HCV颗粒的抗体作为被动免疫剂，可用于HCV感染的预防或治疗。对抗体种类没有 限定，可以例示例如多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、上 述抗体的片段(Fe、Fab、(Fab’)2等)、单链抗体(scFv等)、骆驼抗体、多价抗体(二价、三价抗体等)等。抗体可以是任意种类、例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgY, 其类别(class)包括例如IgGl IgG4、IgAl IgA2等。并且，抗体可以包含糖苷化、 PEG化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化等化学修饰。可以按照包括下述步骤的方法制作抗HCV抗体将本发明的已进行或未进行灭 活或减毒的上述嵌合HCV颗粒给予动物(人除外)、优选哺乳类或鸟类的步骤。作为哺乳类动物，包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰 驼、双峰驼、美国骆驼等。单峰驼、双峰驼和美国骆驼适合制作只包含H链的抗体。鸟 类动物例如有鸡、鹅、鸵鸟等。采集给予了本发明HCV颗粒的动物的血清，按照已知方法(例如包括硫酸铵分 级分离、离子交换层析法、蛋白A或蛋白G结合亲和性层析法、凝胶过滤层析法等)可 以获得抗体。并且，使用用本发明的HCV颗粒进行了免疫的动物的细胞或组织(B细胞、脾 细胞、淋巴结)和骨髓瘤细胞(来自小鼠、大鼠等)，可以制作产生单克隆抗体产生细胞 的杂交瘤。制造杂交瘤的方法众所周知，可以采用Antibodies A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ；富山和安东编、单克隆抗体实验指南、讲谈社、1987
等)中记载的方法。产生单克隆抗体的细胞可以通过细胞融合而生成，也可以通过癌基因DNA的导 入或Epstein-Barr病毒的感染使B淋巴细胞无限增殖等的其他方法来生成。人源化抗体或人抗体可以通过利用噬菌体展示法(Brinkman等人，J.Immunol. Methods, 182 41-50，1995 ； Ames 等人，J.Immunol.Methods，184 177-186，1995 ； 国际公开W098/46645 ；国际公开W098/50433 ；国际公开W098/24893等)、或人抗 体产生小鼠(KM小鼠(矢U > 7 7 — ■^社)、Xeno小鼠(Abgenix/Amgen社)等)来制 作。通过上述方法得到的单克隆抗体、多克隆抗体和人抗体或人源化抗体对HCV的 诊断、治疗、预防有效。使用本发明的HCV颗粒制作的抗体，与医药上可接受的溶解剂、添加剂、稳定 剂、缓冲液等一同给药。给药途径可以是任何给药途径，但优选为皮下、皮内、肌肉内 给药，更优选静脉内给药。使用本发明的HCV颗粒制作的抗体的优选例子有识别本发明的嵌合HCV(丙 型肝炎病毒)颗粒(即、含有本发明的上述核酸作为病毒基因组的嵌合HCV颗粒)作为 抗原的抗丙型肝炎病毒抗体。该抗丙型肝炎病毒抗体可以是针对本发明的嵌合HCV颗粒 而生成的抗体，不管其生成过程如何，其不仅与本发明的嵌合HCV颗粒结合(反应)， 还与其他广泛的丙型肝炎病毒颗粒结合(反应)，可以阻碍其功能。本发明的HCV颗粒(嵌合HCV颗粒)或生成该颗粒的细胞可以进一步用于筛选 抗HCV物质。用于筛选抗HCV物质的方法具体包括以下步骤在被检物质的存在下，培养下 述(a)或(b)的细胞，之后检测所得培养物中的、来自本发明的嵌合HCV颗粒所含有的 上述核酸的复制子RNA或病毒颗粒(a)生成嵌合HCV颗粒的细胞；或
(b)嵌合HCV颗粒和丙型肝炎病毒敏感细胞。按照上述方法，抗HCV物质作为可以抑制病毒感染或增殖的物质而被选择。本 发明中，“复制子RNA”主要是指改变HCV病毒基因组而制作的、具有自主复制能力 的RNA。在本发明中，“自主复制能力”是指，象质粒DNA那样，可以在细胞内自 主地再生(即复制)核酸自身的拷贝的能力。以往公知的亚基因组复制子RNA的例子 有将HCV的结构蛋白翻译区重组到耐药性基因中，进一步在其下游插入EMCV(脑心 肌炎病毒)的IRES而制作的重组RNA，在导入有该重组RNA的细胞内确认到RNA复 制。另一方面，全长基因组复制子RNA是指可以自身复制来自导入到细胞中的HCV的 全长基因组的RNA的RNA，典型例子有在来自HCV全长基因组的RNA中，在其5’ 非翻译区和编码HCV核心蛋白的基因之间插入有耐药性基因(或报道基因)和IRES的 重组RNA。在上述方法中，“来自上述核酸的复制子RNA”是指由该核酸转录的复制 子RNA。作为丙型肝炎病毒敏感细胞，并不限于以下细胞，但可以列举在上述“(2) HCV颗粒的制作”中作为导入来自HCV的RNA的细胞而列举的细胞、例如Huh_7、 HepG2、IMY-N9、HeLa、293或293T细胞或它们的衍生株。
实施例以下，列举实施例以进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实 施例。另外，在实施例中，例示TH株作为JHF-I株以外的HCV株，但该特定株以外的 株也可以同样来制作。实施例1 TH/JFH-1质粒的构建作为HCV基因组RNA的cDNA，制作TH/JFH-1嵌合的cDNA，其中，5，UTR 为基因型 2a 的 JFH-I 株(GenBank 检索号 AB047639、Kato, T.等人，Gastroenterology， 125 1808-1817，2003)，核心蛋白 NS2蛋白的N末端33氨基酸残基为基因型Ib的TH 株(Wakita，Τ.等人，J.Biol.Chem.，269 14205-14210，1994、Moradpour, D.等人， Biochem.Biophys.Res.Commun., 246 920-924，1998 和国际公开 W02006/022422)， NS2的N末端的34氨基酸残基 3’ UTR为基因型2a株的JFH-I株。TH/JFH-1编码的蛋白的氨基酸序列见SEQ IDNO 5。这些质粒的制作方法见 图1。具体而言，使用pJFHl (Wakita，Τ.等人，Nat.Med.，11 791-796, 2005、国 际公开W02004/104198)和包含从肝炎患者体内分离的病毒基因组TH株的一部分的 pTH(国际公开W02006/022422)，所述pJFHl是通过将来自JFH-I株的基因组RNA全 区所对应的cDNA克隆到pUC19质粒中而构建的质粒DNA。以 pJFHl 为模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶试剂盒(FINNZYMES 社)中附带的、10μ15Χ缓冲液、Ιμ IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 10 μ M的弓| 物21M13(SEQ ID NO 8)禾Π MS98 (SEQ IDNO 9)，最后加入去离子水，使总量达到 49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ IPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进行PCR反应。
PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 45秒的步骤作为1个 循环，进行30个循环。所得PCR产物作为PCR产物no.l。接下来，以pTH为模板，加入Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒
16(FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5 X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 ΙΟμΜ 的引物 MS97(SEQIDNO 10)和 MS96 (SEQ ID NO 11)，最后加入去离子水， 使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进行 PCR反应。PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 45秒的 步骤为1个循环，进行30个循环。所得PCR产物作为PCR产物no.2。接下来，以ρJFH1为模板，加入Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒 (FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 ΙΟμΜ 的引物 MS99 (SEQ IDNO 12)和 MS89 (SEQ ID NO 13)，最后加入去离子水， 使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进行 PCR反应。PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 45秒的 步骤作为1个循环，进行30个循环。以所得PCR产物作为PCR产物肌3。利用琼脂糖凝胶纯化各PCR产物，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN 社)，用附带的50 μ IEB缓冲液洗脱。混合各Ιμ 的PCR产物no.l、PCR产物no.2 和PCR产物no.3的DNA，以其为模板，加入Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒 (FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5 X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 ΙΟμΜ 的引物 21Μ13 (SEQ IDNO 8)和 MS89 (SEQ ID NO 13)，最后加入去离子水， 使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进行 PCR0 PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 2分钟的步骤 作为1各循环，进行30各循环。所得PCR产物作为PCR产物no.4。用限制酶EcoRI和SpeI消化pJFHl和已纯化的PCR产物no.4，通过琼脂糖凝 胶电泳分离各DNA片段，进行纯化。将这2个DNA片段与Ligation high (New England Biolabs社)混合，连接这2个DNA片段。将该载体命名为pTH/JFHl。该pTH/JFHl 是编码包含来自JFH-I株的5’非翻译区；来自TH株的核心、El、E2、p7、NS2蛋白 区的N末端33氨基酸残基为止；JFH-I株的NS2蛋白区的N末端34氨基酸残基开始、 NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白区和3，非翻译区的嵌合基因的核苷酸序列。实施例2 体外RNA合成以及将其导入细胞内用XbaI切断pTH/JFHl，进行苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀。接着，对该XbaI切
断片段进行绿豆核酸酶处理，除去来自XbaI识别序列的3’末端的剩余的核苷酸序列。 再进行蛋白酶K处理、苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀，纯化DNA片段。以该切断的质粒为 模板，使用MEGAscriptT7试剂盒(Ambion社)，使之在37°C下反应3小时，进行HCV RNA的合成。反应后的合成RNA在进行DNaseI处理后，用酸性苯酚提取，进行乙醇沉
淀，将其纯化。将3 X IO6 个 Huh7 细胞和 IOyg HCV RNA 悬浮于 400 μ 1 Cytomix 溶液(120mM KCL 0.15mM CaCl2> IOmM K2HP04/KH2P04> 25mMHepes> 2mM EGTA> 5mM MgCl2> 20mMATP、50mM谷胱甘肽)中，移至4mm的比色皿(Cuvettes)中，之后使用Gene Pulser (BioRad社)，以260V、950 μ F进行电穿孔。之后，将导入有HCV RNA的细胞接 种在IOcm2培养皿中，进行传代培养。实施例3 导入有TH/JFH-1RNA的细胞产生HCV颗粒进行导入有TH/JFH-1RNA的细胞的传代时，使用HCV抗原ELISA实验试剂盒(才一〃社)定量培养上清中所含的HCV核心蛋白，确认HCV颗粒的产生。其结果， 直至导入后第23天培养上清中的HCV核心量都随时间而减少，但从导入起经过26天 时，HCV核心量开始上升，经过34天时显示出恒定高的产量(图2)。由此认为TH/ JFH-IRNA在导入Huh7细胞中的当初不具有高的病毒产生能力，但之后向病毒基因组内 导入了病毒产生所必需的适应性突变，使TH/JFH-1RNA具有高的病毒产生能力。实施例4 重复传代的TH/JFH-1病毒感染细胞内的HCV基因组序列分析为了研究TH/JFH-1病毒具有高产量所必需的适应性突变，提取导入RNA起第 34天的感染细胞内的总RNA，进行其中所含的HCV基因组的序列分析。使用Trizol (Invitrogen社)来提取总RNA，进行转录反应生成cDNA。通过PCR 将该cDNA分成5个DNA片段，与pGEM_T Easy载体(Promega社)连接，之后转化到 大肠杆菌DH5a中，得到菌落。使用QIAprep Mini试剂盒(QIAGEN社)，从各10个菌 落中提取质粒，确认各DNA片段的核苷酸序列。其结果，TH株的El区的脯氨酸￡OI(P)被取代成丙氨酸ΔΟ (Α)或苏氨 酸 fiOI(T)。需要说明的是，以 TH 株(Wakita，Τ.等人，J.Biol.Chem.，269(1994)第 I42O5-I42IO 页、Moradpour等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(I998)第 92O-924 页、以及国际公开W02006/022422)的核心蛋白的N末端氨基酸残基即甲硫氨酸残基为 第1位数起，与第328位氨基酸残基对应；或者，以El蛋白的N末端的氨基酸残基为第 1位数起，与第137位的氨基酸残基对应。TH/JFH-I (PA)的氨基酸序列见 SEQIDNO 6，TH/JFH-1 (PT)的氨基酸序列 见 SEQIDNO 7。实施例5 TH/JFH-1突变质粒的构建构建实施例4所示的、具备TH/JFH-1病毒具有高产量所必需的适应性突变的质 粒。质粒的制作方法见图3。具体而言，以pTH/JFHl为模板，添加Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒 (FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 10 μ M 的引物 MS 151 (SEQ ID NO 14)和 MS165 (SEQ ID NO 15)，最后加入去离子 水，使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ IPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进 行PCR反应。PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 1分 钟的步骤为1个循环，进行30个循环。所得PCR产物作为PCR产物no.5。接下来，以pTH/JFHl为模板，加入Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒 (FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 ΙΟμΜ 的引物 MS164(SEQ IDNO 16)和 MS156 (SEQ ID NO 17)，最后加入去离子 水，使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进 行PCR反应。PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 1分 钟的步骤作为1个循环，进行30个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.6。利用琼脂糖凝胶纯化各PCR产物，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN 社)，用附带的50 μ 1 EB缓冲液洗脱。混合各1 μ 1的PCR产物no.5和PCR产物no.6 的DNA，以其为模板，力卩入PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES 社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 10 μ M的引物
18MS151(SEQ ID NO 14)和MS156 (SEQ ID NO 17)，最后加入去离子水，使总量达到 49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进行PCR反应。 PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 1分30秒的步骤为1 个循环，进行30个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.7(图3A)。接下来，以pTH/JFHl为模板，加入Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒 (FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 ΙΟμΜ 的引物 MS151(SEQ IDNO 14)禾Π MS163 (SEQ ID NO 18)，最后加入去离子 水，使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进 行PCR反应。PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 1分 钟的步骤作为1个循环，进行30个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.8。接下来，以pTH/JFHl为模板，加入Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒 (FINNZYMES社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 ΙΟμΜ 的引物 MS162(SEQ ID NO 19)和 MS 156 (SEQ ID NO 17)，最后加入去离子 水，使总量达到49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ IPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进 行PCR反应。PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 1分 钟的步骤作为1个循环，进行30个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.9。利用琼脂糖凝胶纯化各PCR产物，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN 社)，用附带的50 μ 1 EB缓冲液洗脱。混合各1 μ 1的PCR产物no.8和PCR产物no.9 的DNA，以其为模板，力卩入PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES 社)中附带的、10 μ 1 5X缓冲液、1 μ 1 IOmM的dNTP混合液、各2.5 μ 1 10 μ M的引物 MS151(SEQ ID NO 14)和MS156 (SEQ ID NO 17)，最后加入去离子水，使总量达到 49.5 μ 1。之后，加入0.5 μ 1 Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES社)后进行PCR反应。 PCR反应按照下述条件进行以包含98°C 10秒、58°C 30秒、72°C 1分30秒的步骤作为 1个循环，进行30个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.10 (图3B)。用限制酶Acc65I消化pTH/JFHl和已纯化的PCR产物no.7，利用琼脂糖凝胶 电泳分离各DNA片段，进行纯化。混合这2个DNA片段和Ligation high (New England Biolabs社)，连接这2个DNA片段。将该载体命名为pTH/JFH-I (PA)。 该pTH/ JFHl (PA)含有下述核苷酸序列编码包含来自JFH-I株的5’非翻译区；来自TH株的 核心、El、E2、p7、NS2蛋白区的N末端33氨基酸残基为止；JFH-1株的NS2蛋白区 的N末端34氨基酸残基开始、包含NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白区和3’非 翻译区的嵌合基因的核苷酸序列，其中，以核心蛋白的N末端氨基酸残基即甲硫氨酸残 基为第1位数起，第328位氨基酸残基为丙氨酸残基。接着，用限制酶Acc65I消化pTH/JFHl和已纯化的PCR产物no.10，利用琼脂 糖凝胶电泳分离各DNA片段，进行纯化。混合这2个DNA片段和Ligation high (New England Biolabs社)，连接这2个DNA片段。将该载体命名为pTH/JFHl (PT)。该pTH/ JFHl (PT)含有下述核苷酸序列编码包含来自JFH-I株的5’非翻译区、来自TH株的 核心、El、E2、p7、NS2蛋白区的N末端33氨基酸残基为止、JFH-I株的NS2蛋白区 的N末端34氨基酸残基开始、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白区和3，非翻译 区的嵌合基因的核苷酸序列，其中，以核心蛋白的N末端的氨基酸残基即甲硫氨酸残基为第1位数起，第328位的氨基酸残基为苏氨酸残基。以 pTH/JFHl (PA)作为 SEQ ID NO 1、以 pTH/JFHl (PT)作为 SEQID NO
2，这些核苷酸序列见序列表。实施例6 TH/JFH-I (PA)和 TH/JFH-1 (PT)病毒的制作用XbaI切断实施例5制作的各质粒，之后进行苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀。接 着，对该XbaI切断片段进行绿豆核酸酶处理，除去来自XbaI识别序列的3’末端的剩余 核苷酸序列。进一步进行蛋白酶K处理、苯酚氯仿提取、乙醇沉淀，纯化DNA片段。 以该切断的质粒为模板，使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion社)进行各HCV RNA的合 成。将3 X IO6 个 Huh-7 细胞和 IOyg HCV RNA 悬浮于 400 μ 1 Cytomix 溶液(120mM KCL 0.15mM CaCl2> IOmM K2HP04/KH2P04> 25mMHepes> 2mM EGTA> 5mM MgCl2> 20mM ATP、50mM谷胱甘肽)中，移入4mm比色皿中后，使用Gene Pulser (BioRad社)， 以260V、950 μ F进行电穿孔。之后，将导入有HCV RNA的细胞接种在IOcm2的培养皿
中，进行传代培养。进行导入有实施例2 制作的 TH/JFH-1RNA、TH/JFH-I (PA) RNA (SEQ ID NO 3)和TH/JFH-1 (PT) RNA(SEQ ID NO 4)的各细胞的传代时，使用HCV抗原ELISA实
验试剂盒(才一〃社)定量培养上清中所含的HCV核心蛋白，确认HCV颗粒产生。从 培养初期一直到后期，比较导入有未导入突变的RNA的细胞的培养上清中所含的HCV核 心量与导入有导入了突变的RNA的细胞的培养上清中所含的HCV核心量时，显示后者的 HCV核心量高(图4)。实施例7 导入有突变的病毒的感染性评价将由导入有TH/JFH-1 (PA)RNA的细胞产生的病毒的感染性与野生型TH/JFH-1 进行比较。研究导入各RNA后直至4、24、48、72和96小时的细胞内和培养上清的HCV 核心蛋白的变化，研究该培养上清的感染性。具体而言，与实施例6—样，合成TH/JFH-1和TH/JFH-1(PA)RNA，将3X106 个 Huh-7 细胞禾Π 10 μ g HCV RNA 悬浮于 400 μ 1 Cytomix 溶液(120mM KCL 0.15mM CaCl2> IOmM K2HP04/KH2P04> 25mM Hepes、2mM EGTA> 5mM MgCl2、20mMATP、 50mM谷胱甘肽)中，移入4mm的比色皿中，之后使用Gene Pulser(BioRad社)，以 260V、950 μ F进行电穿孔。之后，将导入有HCV RNA的细胞接种在IOcm2的培养皿 中，于4、24、48、72和96小时后回收培养上清，用0.45 μ m的滤器(Millipore社)过 滤，之后使用HCV抗原ELISA实验试剂盒(才一 〃社)定量HCV核心蛋白。另外，除 去了培养上清的IOcm2培养皿用PBS清洗后，使用500 μ 1 PBS和刮棒(住友一夕，< 卜社)搂取(搔t取>9 )细胞，离心，回收细胞。向回收的细胞中添加100 μ 1被动裂解 缓冲液(Promega社)，制备溶胞产物，与培养上清一样，使用HCV抗原ELISA实验试剂 盒(才一 ^社)定量HCV核心蛋白。用培养液进行阶段稀释，如下定量培养上清的感染效价。将Huh-7细胞以 IX IO4个/孔接种在用聚赖氨酸包被的96孔板(Coming社)中，培养一昼夜后，交换成 用培养液进行了阶段稀释的培养上清，再培养3天。之后，舍弃培养液，用PBS清洗3 次后，用甲醇固定15分钟。接下来，用含有0.3% Triton X-100的Block Ace(大日本住友制药)封闭各孔，使之与抗HCV核心特异性抗体(克隆2H9)反应。接下来，用PBS 清洗孔，使之与Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(Invitrogen社)反应。之后，用PBS清 洗孔，在荧光显微镜(力U >〃 7社)下观察各孔的感染转化灶数，算出各培养上清的感 染效价，作为转化灶形成单元(FFU)。其结果，在导入有TH/JFH-1 (PA)RNA的细胞中，与野生型TH/JFH-1相比，
HCV核心蛋白向培养上清中的分泌率高，培养上清的感染效价也高(图5和图6)。结果 显示TH/JFH-1 (SEQ ID NO 5)中第328位脯氨酸残基的突变是使HCV颗粒的产生增 加的突变。产业实用性通过本发明的方法提供的HCV颗粒具有高表达性、高产生、高感染性，所以适 合用作HCV的预防或治疗用疫苗。并且，本发明的HCV颗粒还可用作诱导抗HCV抗 体的工具。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，参照其全部内容而并入本说 明书中。
权利要求
1.核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来自 JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自上述 JFH-I株或上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白或来自上述JFH-I株的NS2 蛋白与来自上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白的嵌合NS2蛋白、以及来自 上述JFH-I株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各区按 照该顺序从5’侧向3’侧配置而形成的，从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的脯氨酸残基被取代成脯氨酸 残基以外的氨基酸残基。
2.权利要求1所述的核酸，其中，在编码上述核心蛋白的区的5’侧含有上述JFH-I 株的5’非翻译区，在编码上述NS5B蛋白的区的3’侧含有上述JFH-I株的3’非翻译 区。
3.权利要求1或2所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株是属于基 因型la、Ib或2a的株。
4.权利要求1 3中任一项所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株 选自TH株、Conl株、Jl株和它们的衍生株。
5.权利要求1 4中任一项所述的核酸，其中，上述脯氨酸残基以外的氨基酸残基选 自 Ala、Leu、lie、VaL Thr 和 Ser。
6.权利要求1 5中任一项所述的核酸，其中，上述核酸是包含序列表的SEQID NO 1所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的DNA、 或者是包含序列表的SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90%以上同 源性的核苷酸序列的RNA。
7.权利要求1 5中任一项所述的核酸，其中，上述核酸是包含序列表的SEQID NO 2所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的DNA、 或者是包含序列表的SEQ IDNO 4所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90%以上同 源性的核苷酸序列的RNA。
8.载体，该载体含有权利要求1 7中任一项所述的核酸。
9.嵌合丙型肝炎病毒颗粒，其中含有权利要求1 7中任一项所述的核酸作为病毒基 因组。
10.细胞，该细胞生产权利要求9所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒。
11.权利要求10所述的细胞，其中，上述细胞为Huh-7或其衍生株。
12.筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括在被检物质的存在下培养下述 (a)或(b)的细胞，之后检测所得培养物中的来自上述核酸的复制子RNA或病毒颗粒(a)权利要求10或11所述的细胞、或(b)权利要求9所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒敏感细胞。
13.丙型肝炎病毒疫苗，其中含有权利要求9所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒。
14.权利要求13所述的丙型肝炎病毒疫苗，其中，上述嵌合丙型肝炎病毒颗粒被灭活 或减毒。
15.抗丙型肝炎病毒抗体，该抗体将权利要求9所述的嵌合丙型肝炎病毒颗粒作为抗 原识别。
全文摘要
本发明提供可用作疫苗的感染性嵌合HCV颗粒。本发明还提供核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来自JFH-1株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自上述JFH-1株或上述JFH-1株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白或来自上述JFH-1株的NS2蛋白与来自上述JFH-1株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白的嵌合NS2蛋白、以及来自上述JFH-1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各区按照该顺序从5’侧向3’侧配置而形成的，其中，从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的脯氨酸残基被取代成脯氨酸残基以外的氨基酸残基；含有该核酸的嵌合HCV颗粒；以及该HCV颗粒作为疫苗的应用。
文档编号C12N5/10GK102016026SQ200980115770
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月24日 优先权日2008年4月25日
发明者胁田隆字, 赤泽大辅 申请人:东丽株式会社, 日本国立感染症研究所, 财团法人东京都医学研究机构