专利名称：一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及 其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。
背景技术：
豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor, CPTI)是一种属于 Bowman-Birk家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以与农业害虫(主要是鳞翅目、直翅目、鞘翅 目昆虫)消化道中的丝氨酸蛋白酶形成酶-抑制剂的复合物，从而减弱或阻断蛋白酶的消 化水解作用，进而使害虫产生营养不良，出现机能紊乱甚至死亡现象。与传统的Bt蛋白相 比，CPTI蛋白具有抑虫或杀虫谱更广、对人畜安全等优点，是一种生物农药的潜在开发对 象，因而在农林业具有很高的应用和推广价值。大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的原核表达体系，主要由表达载体和宿主菌 两部分组成。表达载体一般具有以下特征稳定的遗传复制、传代能力；具有筛选标记；可 调控的启动子，抑制时本底转录水平较低；具备外源基因插入的多克隆位点。宿主菌一般选 择蛋白酶缺陷的菌株，如经典的BL21系列菌株就是Ion和ompT蛋白酶缺陷型。但是并非所有外源基因在大肠杆菌表达系统中都能高效表达，本发明的发明人发 现从豇豆中克隆得到的豇豆胰蛋白酶抑制剂不能在大肠杆菌中高效表达，其表达量较低， 表达的蛋白活性较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。本发明的目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。本发明的再一目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂。本发明的另一目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂原核表达载体。本发明的另一目的是提供一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。本发明的另一目的是提供一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌 株。 本发明的另一目的是提供上述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的应用。如上所述本发明的发明人首先利用PCR反应从豇豆基因组DNA中直接获得CPTI 基因(CPTI基因不含有内含子)，CPTI基因的开放阅读框编码106个氨基酸，该编码蛋 白 N 端带有一个 18 个氨基酸的信号肽(SignalP :http //www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)。将该基因在大肠杆菌中表达，发现其表达量较低，表达的蛋白活性较低。由于原核表达体系通常不具有识别真核细胞信号肽并将该蛋白成功定位的功能， 而成熟有活性的蛋白总是在信号肽酶切除信号肽后才能形成，同时信号肽主要含疏水性氨 基酸，在原核表达体系中大量表达时常常形成包涵体。因此，本发明的发明人在表达上述
3CPTI基因时去除了部分信号肽序列，同时优化了序列按照尽可能的去掉信号肽序列、又要 保证不破坏蛋白的二级结构的原则，把基因前30个脱氧核糖核苷酸去除，利于在大肠杆菌 中表达出该基因的重组蛋白。然后将改造优化的CPTI基因的编码序列构建到原核表达载 体PGEX-6p-l中；随后将构建好的CPTI表达载体转化到表达菌株BL21 (DE3)中，用诱导剂 IPTG (isopropyl-β -d-1-thiogalactopyranoside,异丙基-β -d-硫代半乳糖苷)诱导融 合蛋白的表达；利用融合蛋白的GST标签可以与Glutathione Sephrose 4B亲和的特性，可 以纯化得到纯度达到90%以上的融合蛋白GST-CPTI。优化后CPTI基因的序列如SEQ ID No. 1所示cttgtagggg ttactactgc agccatggat ctgaaccacc tcggaagtaa tcatcatgat 60gactcaagcg atgaaccttc tgagtcttca gaaccatgct gcgattcatg catctgcact 120aaatcaatac ctcctcaatg ccattgtaca gatatcaggt tgaattcgtg tcactcggct 180tgcaaatcct gcatgtgtac acgatcaatg ccaggcaagt gtcgttgcct tgacattgct 240gatttctgtt acaaaccttg caagtccagg gatgaagatg atgag285根据本发明的豇豆胰蛋白酶抑制剂，其由核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的基因编 码，具体地，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。LVGVTTAAMD LNHLGSNHHD DSSDEPSESS EPCCDSCICT KSIPPQCHCTDIRLNSCHSA 60CKSCMCTRSM PGKCRCLDIA DFCYKPCKSR DEDDE95因此，根据本发明的豇豆胰蛋白酶抑制剂原核表达载体，其包括上述豇豆胰蛋白 酶抑制剂CPTI基因。根据本发明的高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法包括在原核生物中表达 上述述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的步骤，优选在大肠杆菌中表达。根据本发明的高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌株，其具有上述 豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，优选为大肠杆菌重组菌株。虽然豇豆胰蛋白酶抑制剂在一些豆类植物中含量比较丰富，但是天然提取和纯化 CPTI的工艺繁琐、产量低和成本高，不适合大规模的推广和应用，制约了 CPTI蛋白的在农 林领域防治鳞翅目害虫的应用。本发明的优化CPTI基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达量显著提高，而且表 达蛋白的比活也提高，在抑制剂浓度为0. 05mg/mL时，抑制活性达0. 204，在抑制剂浓度为 0. 2mg/mL时，抑制活性达0. 807。大肠杆菌(E. coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系。大肠杆 菌表达体系的优点是，遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因 经常可以达到高效表达。所用的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。BL21(DE3)是一个λ DE3 ( λ DE3 是λ噬菌体的突变株)的溶原菌，即在BL21的染色体上整合有ADE3的一段染色体。本 发明所使用的表达载体为PGEX-6p_l(GE，Healthcare)带有Ptac可诱导的强启动子，表达 出N端带有一个^kDa的GST标签的融合蛋白。GST作为一种纯化的标签，可以方便地纯化 纯度非常高的目的蛋白，同时GST还具有稳定分子量较小的CPTI蛋白的作用。
图1为豇豆CPTI基因的PCR扩增产物，M =DNA分子量标准，1 阴性对照，2 :CPTI基因。图2为PGEX-6p-l-CPTI表达载体的双酶切验证，1 重组质粒双酶切的产物，M DNA分子量标准。图3为融合蛋白GST-CPTI诱导表达检测，M 蛋白Marker，1 :IPTG诱导的菌液，2 未添加IPTG诱导的菌液。图4为融合蛋白GST-CPTI亲和层析纯化，M 蛋白Marker，1 纯化后的融合蛋白 GST-CPTI。图5为胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制活性。
具体实施例方式实施例1豇豆基因组DNA的提取及CPTI基因的扩增产物豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor, CPTI)基因中不含有内含子， 通过提取豇豆基因组DNA，根据已经发表出来的序列设计引物，扩增出CPTI基因。豇豆种子(购自中国农科院)种于花盆中，大约30天后取其叶片提取基因组DNA。 采用 The chargeswitch gDNA plant kit (购自 invitrogen 公司)提取豇豆基因组 DNA。 以上述豇豆基因组DNA为模板，利用PCR反应扩增出CPTI基因(图1)。CPTI基因的PCR产 物送往上海生工生物工程有限公司测序。测序结果表明CPTI基因的编码序列是由321bp 基组成，编码106个氨基酸，含有一个终止密码子，与已经发表序列非常高的同源性(90% 以上)。实施例2改造CPTI基因CPTI基因的开放阅读框编码106个氨基酸，该编码蛋白N端带有一个18个氨基酸 的信号肽(SignalP ;http://www. cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/)。原核表达体系通常不 具有识别真核细胞信号肽并将该蛋白成功定位的功能，而成熟有活性的蛋白总是在信号肽 酶切除信号肽后才能形成，同时信号肽主要含疏水性氨基酸，在原核表达体系中大量表达 时常常形成包涵体。按照尽可能的去掉信号肽序列，又要保证不破坏蛋白的二级结构的原 则，把基因前30个脱氧核糖核苷酸去除。本发明所表达的CPTI从第11个氨基酸到第106 个氨基酸。设计上、下游引物并分别引入酶切位点BamH I和)(h0 I。上游弓丨物 CPTI-BamH I_F :gaa att ggatcc ctt gta ggg gtt act act下游弓丨物 CPTI-Xho I-R :gaa att ctc gag ctc ate ate ttc atePCR反应程序为95°C热变性5分钟；95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30 秒；30个循环，72°C延伸10分钟。PCR产物经过1 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因条
市ο实施例3GST-CPTI融合蛋白表达载体的构建BamH I和Xho I双酶切CPTI基因条带和PGEX_6p_l表达载体，在T4 Iigase作用 下16°C过夜连接。次日，将连接产物转化DH5 α感受态细胞，涂布含氨苄抗生素固体LB平 板，37°C过夜培养。菌落PCR呈阳性的克隆，提取质粒作酶切验证(图2)。将质粒送往上海 生工公司测序，结果表明表达载体的构建完全正确。实施例4GST-CPTI融合蛋白的表达将构建好的表达载体质粒转化表达菌株BL21 (DE3)。挑取单菌落至含100 μ g/ml氨苄抗生素的液体LB培养基中，37 °C培养，待0D600达到0. 5左右时，取出500 μ 1菌液做 对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度0. 5mmol/L诱导表达，37°C继续培养3小时。取500 μ 1 菌液，12000rpm离心1分钟，收集菌体，用80 μ IPBS重悬菌体，加入20 μ 1 5x SDS-PAGE loading buffer，沸水煮5分钟，取10 μ 1进行SDS-PAGE凝胶电泳(电泳结果见图3)。实施例5GST-CPTI融合蛋白的纯化挑取单克隆于20ml含氨苄抗生素的液体LB培养基中，37°C过夜培养。将活化的菌 种按1 100的比例接种于IL含氨苄抗生素的新鲜LB培养基中，37°C，200rpm，培养两个小 时至0D600 = 0. 5，加入IPTG至终浓度为0. 2mmol/L, 16°C过夜诱导。次日用大容量冷冻离 心机4°C，4000rpm, 30分钟收集菌体。然后用30ml PBS重悬，冰浴下超声裂解。细胞裂解物 用高速冷冻离心机4°C，15000rpm离心30分钟。将得到的上清以lml/min的流速上样于用 PBS平衡的Glutathione Sephrose 4B层析柱，待上样结束后，继续用20倍柱体积的PBS冲 洗非特异性结合的蛋白。然后用3倍柱体积的洗脱液(lOmmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/ L Tris-HCl,pH 8.0)洗脱目的蛋白。聚丙烯凝胶电泳检测融合蛋白的纯度(图4)将洗脱 下来的目的蛋白加入IOkDaMillipore浓缩离心管中，将Glutathione Sephrose 4B洗脱液 换成 20mmol/L Tris pH 8. 0, lOOmmol/LNaCl, 3mmol/L DTT 并浓缩至 1. 5ml。-20°C，保存。 利用分光光度计测量该蛋白的^Onm吸光度值，计算出IL菌液中可以得到25mg GST-CPTI 蛋白。实施例6融合蛋白GST-CPTI对胰蛋白酶的抑制活性的测定(1)酶活抑制活性测定原理胰蛋白酶可作用于人工合成底物苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(ΒΑΡΝΑ)，释放出 黄色的对硝基苯胺，该物质在410nm下有最大吸收值。胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使 410nm吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度计在410nm处 测定吸光度值的变化，可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。(2)溶液的配制^ ! 30. Omg (Trypsin 1 :250, porcine pancrease) 5mmol/L CaCl2 和lmmol/LHCl溶液(ρΗ3· 0)，并定容至100ml。保存于4°C冰箱中。称取60mg的BAPNA用Iml 二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后用50mmol/ LTris-HCl (pH8. 1)和 5mmol/L CaCl2 溶液定容至 100ml。(3)融合蛋白GST-CPTI抑制胰蛋白酶活性的测定方法对照组取200 μ 1纯化的蛋白GST-CPTI (不同浓度)到750 μ 1 ΒΑΡΝΑ溶液(37°C预热) 中，37°C反应10分钟，立即用100 μ 1醋酸溶液终止该反应，然后加入200 μ 1胰蛋白酶，混 合均勻。以水为空白，410nm测定吸光度值Al。抑制组取200 μ 1纯化的蛋白GST-CPTI (不同浓度)加入到750 μ 1 ΒΑΡΝΑ溶液(37°C预 热)中，然后加入200 μ 1胰蛋白酶溶液，37°C反应10分钟，立即用100 μ 1醋酸溶液终止该 反应。以水为空白，410nm测定吸光度值Α2。无抑制组取200 μ 1胰蛋白酶溶液加入到750 μ 1 ΒΑΡΝΑ溶液(37°C预热)中，37°C反应10分钟，加入100 μ 1醋酸溶液终止该反应，然后再加入200 μ 1纯化的蛋白GST-CPTI (不同浓 度)，混合均勻。以水为空白，410nm测定吸光度值A3。融合蛋白GST-CPTI对胰蛋白酶活性的抑制
权利要求
1.一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一种豇豆胰蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述豇豆胰蛋白酶抑制剂由核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示的基因编码。
3.—种豇豆胰蛋白酶抑制剂，其特征在于，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
4.一种豇豆胰蛋白酶抑制剂原核表达载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1所 述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。
5.一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括在原核 生物中表达包括权利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括在大肠杆菌中表达包括权 利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的步骤。
7.一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株具 有权利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。
8.一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株为 具有权利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的大肠杆菌。
9.权利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。如上所述本发明的发明人首先利用PCR反应从豇豆基因组DNA中直接获得CPTI基因(CPTI基因不含有内含子)，然后优化改造所述CPTI序列，改造后的序列在大肠杆菌中的表达量和表达比活性都有显著改进。
文档编号C12R1/19GK102127552SQ20101059032
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者李峰, 陆庆宇, 高伟 申请人:北京林业大学