专利名称：用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测股骨头坏死易感 性的试剂盒，通过检测VEGF、FV、MTHFR、APOAU APOB和PONl基因的单核苷酸多态性位点 (SNP)，来预测个体对股骨头坏死的易感性。
背景技术：
股骨头坏死因其主要病理系股骨头血运受阻，遭受破坏而引起的头部骨质缺血， 故多称为股骨头缺血性坏死或股骨头无菌性坏死。由于股骨头坏死有一个复杂的病理过 程，如早期不能得到及时有效的治疗，就会使股骨头塌陷，关节间隙变窄，最后导致骨关节 炎，使病人髋关节功能障碍而致残致瘫。病人在遭受生理病痛的同时，还要遭受心理创伤的 煎熬，也给家庭、单位和社会增添了沉重的负担。股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head ANFH)是骨科常 见病，多发病，早期诊断困难，治疗效果欠佳，最终仍需人工关节置换术，给患者和社会带来 巨大损失。其发病机理尚不十分清楚，但其共同特征都是血液循环障碍导致股骨头缺血坏 死。由于机体对坏死区具有自然的修复能力，当新生骨细胞随新生血管向坏死区生长并形 成新骨的同时，坏死骨小梁将被逐步吸收。在此过程中骨的力学性能明显减弱，正常负重即 可致股骨头塌陷变形及髋关节退行性关节炎，同时出现以疼痛和活动障碍为主的临床症状 群。早期的诊断和治疗是治疗ΑΝ 的关键。随着ΑΝ 的基因多态性的深入研究，越来越 多的和ANFH相关的基因见诸报道。证实了多种基因在ANFH的发生发展中的作用，为ANFH 的早期诊断和治疗提供了理论依据。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)基因位于 6 号 染色体pl2区，其-634上C/G多态性会影响基因的表达，其产物血管内皮生长因子能特异 性作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞分裂，促进血管的生长和侧支循环建立的作用，也能 促进血管内皮细胞分泌胰岛素样生长因子等生长因子，促进成骨细胞生长，其多态性会影 响VEGF基因的表达，从而导致ANFH的发生。亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR gene)位于1ρ36. 13，由11个外显子组成，编 码656个氨基酸，翻译成能够催化N5，WO-亚甲基四氢叶酸还原成N5-亚甲基四氢叶酸的 蛋白质，后者为Hcy的再甲基化提供甲基供体，使其生成蛋氨酸。MTHFR基因677位存在 C —T突变。该突变会导致其编码的丙氨酸(GCU)被缬氨酸(GUU)所取代，从而影响MTHFR 的活性，使血浆中HCY水平升高。是同型半胱氨酸，高同型半胱氨酸血症是血栓形成的独立 危险因素。凝血因子5 (coagulation factor V，FV)基因位于 lq23，编码 Glueek 因子 V 蛋白， 在凝血过程中位于内外源性凝血途径的交汇点，加速和促进凝血酶原的激活和凝血酶的生 成。因子V在rs6025发生基因突变后称V Leiden因子。V Leiden因子是静脉血栓形成的 常见的危险因素。基因突变导致深静脉血栓形成，血液高凝状态，从而导致股骨头小血管的 血栓形成。
脂类代谢紊乱是导致股骨头坏死的重要机理，长期大剂量使用糖皮质激素引起体 内高脂血症，脂肪分解，血中游离脂肪酸增多，从而使血管内皮损伤，胶原暴露，激活内源性 凝血途径，使纤维蛋白血小板血栓形成。对氧磷酶(pamoxonase，PON)又称芳香基二烷基磷酸酯酶，人类血清中的PONl与 HDL紧密结合，形成一个八聚合体的结构，是ApoA — 1的重要组成部分。PON基因位于染色 体7q21. 3 一 q22. 1，含有9个外显子及8个内含子，PON基因家族至少有三个成员，分别为 PONUP0N2和P0N3。PONl基因产物是循环中HDL的组成部分，并且HDL的抗氧化的活性大 部分取决于P0N1。PONl的192Glu/Arg的改变，影响了对氧磷酶酶的活性。载脂蛋白Afepolipoprotein Α,Αρο Α)位于人类11号染色体长臂上约15kb的基 因片段内，与Apo C3、Apo A4基因呈簇状排列。Apo Al基因转录起始点上游_75bp处有G/ A多态性位点(rs670)，Apo Al基因结构的改变影响着Apo Al的分子结构、生成和向血液 中释放的速率，进而影响血中Apo Al与HDL的水平。载脂蛋白Bfepolipoprotein B,Apo B)基因位于第2号染色体短臂Op23)末端， 全长43吐，由四个外显子和观个内含子组成。最大的外显子是沈号外显子。位于第沈 号外显子的C7673T多态(rs69;3)靠近LDL受体结合区域，被认为与动脉粥样硬化、冠心病、 心肌梗死及股骨头坏死密切相关。现有技术检测股骨头坏死易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用 taqman探针，该方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序 法，虽准确率高，但其成本高、同样不能实现批量检测，因此现有方法均无法满足大规模基 因筛选的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，通过检测一组与股骨头坏死易感性的试剂盒，利 用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，综合检测和分析受检 人群是否携带“股骨头坏死易感基因”，将股骨头坏死易感人群从人群中筛选出来，改变不 良的生活习惯，达到预防的目的。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种用于检测股骨头坏死易 感的检测试剂盒，它检测与股骨头坏死关系密切的六个基因的组合血管内皮因子类的 VEGF基因，凝血因子类的FV基因和MTHFR基因，脂类代谢基因的PONl基因、AP0A1基因和 APOB基因。包括下述SNP位点VEGF基因的rs2010963位点、FV基因的rs6025位点、MTHFR 基因的rsl801133位点、AP0A1基因的rs670位点、APOB基因的rs693位点和PCMl基因的 rs662位点。所述的用于检测股骨头坏死易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引 物对和探针。所述的用于检测股骨头坏死易感的基因组合设计的特异性引物，所述的特异性引 物对的序列如下，用于进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述6个位点的基因片段针对rs2010963 位点GGTAGCAAGAGCTCCAGAGAG(SEQ ID NO 1)
AAGCAGGTCACTCACTTTGC(SEQ ID NO 2)针对rs6025 位点TAGCCAGGAGACCTAACATGTTC(SEQ ID NO 3)GAGAGACATCGCCTCTGGG(SEQ ID NO 4)针对rsl801133 位点CACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 5)GTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 6)针对rs670位点AGCTCTTGCAGGGCCTATT(SEQ ID NO 7)CCACATTGCCAGGACCAGT(SEQ ID NO 8)针对rs693位点AAACCTGGCCTACCAGAGAC(SEQ ID NO 9)TTGGTTACAGGAGGCTTTAAGT(SEQ ID NO 10)针对rs662位点CAAATCCTTCTGCCACCACT(SEQ ID NO: 11)CTGTGGGACCTGAGCACTTT(SEQ ID NO :12)所述的用于检测白血病易感的基因组合设计的特异性探针，其特征在于，所述的 特异性探针序列如下，能同时对6个位点进行检测分型针对rs2010963 位点ACGCACGTCCACGGTGATTTCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG(SEQ ID NO :13)针对rs6025 位点GGATGGCGTTCCGTCCTATTTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC(SEQ ID NO :14)针对rsl801133 位点CGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID NO :15)针对rs670位点AGCGATCTGCGAGACCGTATAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC(SEQ ID NO :16)针对rs693位点GCGGTAGGTTCCCGACATATACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC(SEQ ID NO :17)针对rs662位点GGCTATGATTCGCAATGCTTCACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC(SEQ ID NO :18)所述的引物或探针，用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出 白血病易感基因。本试剂盒的组分和含量包括250ul 10XPCR 反应缓冲液，20ul IOmM dNTP 混合液，450ul 25mM MgCl2 溶液，45ul (5U/ul) Taq DNA 聚合酶，50ul特异性引物(12条)混合液(IOuM each)，15ul特异性延伸探针(6条)混合液(IOuM)，
90ul ExoI(10U/ul),450ul SAP(lU/ul),140ul 10XSAP 反应缓冲液，1700ul Extension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix,IOul DNA polymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive,2500ul 20XWash Buffer 1，800ul 64XWash Buffer 2，一个384孔12重微阵列芯片去离子水20ml，本试剂盒供380人份检测应用，试剂盒保存温度为-20°C。本发明的有益效果是(1)分型结果准确性高达99%以上，重复性好，没有假阳性 影响；( 同时检测多个SNP位点，检测成本低；C3)通量高，可一次对384个样本进行检测； (4)操作简便；( 灵敏度高，每次检测的DNA用量仅2ng。本发明通过单核苷酸延伸技术 结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率 超过99%。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件 的实验放大，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。IDNA 的提取取受检者外周静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细胞， 离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分钟，异丙醇沉淀、 75 %乙醇洗涤两次，晾干后溶于适量TB溶液中。2PCR 扩增取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板中，进行多重PCR扩增反应总体积5ul，其中 10M mol/L dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2 lul，模板 DNA 30ng，6 重引物混合液 lOuM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul，补足水到 5ul。置于 PCR 仪上反应预变性 94°C Imin ；94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，40 个循环；Hold 4°C。扩增引物混合液包括下列引物
IFGGTAGCAAGAGCTCCAGAGAG(SEQ ID NO 1)
IRAAGCAGGTCACTCACTTTGC(SEQ ID NO 2)
2FTAGCCAGGAGACCTAACATGTTC(SEQ ID NO 3)
2RGAGAGACATCGCCTCTGGG(SEQ ID NO 4)
3FCACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 5)
3RGTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 6)
6
4F AGCTCTTGCAGGGCCTATT(SEQ ID NO 7)4R CCACATTGCCAGGACCAGT(SEQ ID NO 8)5F AAACCTGGCCTACCAGAGAC(SEQ ID NO 9)5R TTGGTTACAGGAGGCTTTAAGT(SEQIDN0:10)6F CAAATCCTTCTGCCACCACT (SEQ ID N0:11)6R CTGTGGGACCTGAGCACTTT(SEQ ID NO 12)3 纯化在PCR扩增产物中加入 0. 2ul ExoI, Iul SAP，0. 3ul 10 X SAP 反应缓冲液禾口 1. 5ul 去离子水。将96孔板放入PCR仪中进行纯化，纯化程序37°C 30min,96°C 10min,Hold 4°C。4引物延伸反应纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸探针混合液(1010uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix 0. 2ul，DNA 聚合酶 0. 02ul， 去离子水;3ul。将装有延伸反应混合物的96孔板再次放入PCR仪中进行延伸反应，反应程 序=Hold 96°C 3min ；94°C 20sec，40°C llsec，46 个循环；Hold 4°C。延伸探针混合液包含下列探针IPACGCACGTCCACGGTGATTTCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG(SEQIDNO13)
2PGGATGGCGTTCCGTCCTATTTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC(SEQIDNO14)
3PCGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQIDNO15)
4PAGCGATCTGCGAGACCGTATAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC(SEQIDNO16)
5PGCGGTAGGTTCCCGACATATACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC(SEQIDNO17)
6PGGCTATGATTCGCAATGCTTCACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC(SEQIDNO18)以上延伸探针5’端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。5延伸反应结束后，加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。孵育温度42 °C，孵育时间2小时。6激光扫描检测荧光信号本发明将上述6个与股骨头坏死易感、发生密切相关的基因进行组合，通过大量 的筛选数据表明所述6个基因VEGF基因、FV基因，MTHFR基因、PONl基因、AP0A1基因、 APOB基因，如6个基因都有位点发生突变，则患股骨头坏死的概率最高；4或5个基因发生 突变次之；没有发生突变患股骨头坏死的概率最小。本发明采用单核苷酸延伸技术和微阵列芯片技术相结合的方法，针对上述6个位 点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增携带SNP位点的6个基因片段，根 据SNP位点上游5’端23-2^p的序列设计寡核苷酸探针，此探针与序列杂交后3’末端位 于snp5’端上游Ibp处。检测时聚合酶根据SNP携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧 光的ddNTP，根据结合的ddNTP不同，其所携带的荧光颜色也不相同，在探针的5’端根据与 微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列，与微阵列芯片上对应的序 列互补，延伸后的探针与微阵列芯片上对应区域上的序列杂交，不同的探针结合在芯片的 不同区域，通过检测对应位置的荧光，达到同时进行多个SNP分型的目的。疾病的发生是一个十分复杂的过程，受到多个蛋白和基因的共同影响，其中任何 一个酶的改变都会影响疾病的易感性。传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部份患病风险人群，对于由于其他基 因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警，检测的准确性因此会大幅降低，受检 者不能全面的了解自身疾病的易感情况。本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点，能更 准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能给受检者提出具有针对性和有效地 健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成 本，可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测，本发明针对股骨头坏死不同的患病途 径的关键酶基因寻找挑选了 6个多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径 的患病风险，能够给受检者提出具有针对性的健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。本 发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态 性(SNP)的基因分型准确率超过99%，同时检测上述6个基因对检测、比较个体的股骨头坏 死易感性具有重要意义。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
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权利要求
1.一种用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，其特征在于，包括同时检测VEGF基因 的rs2010963位点、FV基因的rs6025位点、MTHFR基因的rs 1801133位点、APOAl基因的 rs670位点、APOB基因的rs693位点和PONl基因的rs662位点的特异性引物及对应的延 伸探针，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，10XPCR反应缓冲液，ExoI，SAP, 10XSAP反应缓 冲液，Extension Dilution Buffer, IOXExtension Mix, DNA polymerase, Hybridization Solution, Hybridization Additive, 20 Xffash Buffer 1,64X Wash Buffer2，去离子水，微 阵列芯片。
2.根据权利要求1所述的用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，其特征在于所述的 特异性引物对是针对VEGF基因的rs2010963位点、FV基因的rs6025位点、MTHFR基因的 rsl801133位点、AP0A1基因的rs670位点、APOB基因的rs693位点和PONl基因的rs662 位点而设计，能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，其特征在于所述的 特异性延伸探针是针对VEGF基因的rs2010963位点、FV基因的rs6025位点、MTHFR基因的 rsl801133位点、AP0A1基因的rs670位点、APOB基因的rs693位点和PONl基因的rs662 位点而设计，能通过单核苷酸延伸和微阵列技术检测出这六个SNPs位点基因型的探针。
4.根据权利要求1所述的用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，其特征在意所含的 特异性引物对选自具有SEQ ID NO :1，2所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID N0:3，4所 示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO :5，6所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO :7， 8所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO :9，10所示核苷酸序列的引物对以及具有SEQ ID NO :11，12所示核苷酸序列的引物对。
5.根据权利要求1所述的用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，其特征在于所含的 特异性延伸探针选自具有SEQ ID N0:13、14、15、16、17和18所示核苷酸序列的延伸探针。
6.根据权利要求1所述的用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，其特征在于试剂 盒的组分和含量包含250ul 10XPCR反应缓冲液，20ul IOmM dNTP混合液，450ul 25mM MgCl2溶液，45ul 5U/ul Taq DNA聚合酶，50ul每条IOuM的12条特异性引物混合液， 15ul 每条 IOuM 的 6 条特异性延伸探针混合液，90ull0U/ul Exol，450ul lU/ul SAP, 140ul 10XSAP 反应缓冲液，1700ulExtension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix, IOul DNApolymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive, 2500ul 20XWash Buffer l,800ul 64XWash Buffer 2，去离子水20ml，一个供 380人份检 测应用的384孔12重微阵列芯片，试剂盒保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测股骨头坏死易感性的试剂盒，它检测与股骨头坏死关系密切的六个基因的组合血管内皮因子类的VEGF基因，凝血因子类的FV基因和MTHFR基因，脂类代谢基因的PON1基因、APOA1基因和APOB基因。利用本试剂盒，通过检测一组与股骨头坏死易感性相关的基因及位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，可清晰的判断受检人群是否携带“股骨头坏死易感基因”，将股骨头坏死易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
文档编号C12Q1/68GK102108413SQ201010599558
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者刘志霈, 刘蓉华, 周毓玲, 李楠, 杜宏伟, 靳霞, 韩俊领 申请人:协和干细胞基因工程有限公司, 天津滨海协和基因科技有限公司