专利名称：枯草芽孢杆菌wn01漆酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌漆酶及其编码基因，具体涉及一株枯草芽孢杆菌WNOl的芽孢漆酶及其编码基因，属于应用微生物领域。
背景技术：
漆酶(EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶催化的底物范围十分广泛， 因此漆酶酶已被广泛应用于造纸工业、纺织工业、食品工业以及土壤的生物修复等领域。在自然界中，漆酶广泛分布于植物、真菌和细菌中，特别是真菌，是目前漆酶的主要生产者。虽然目前对细菌漆酶的理论研究不如真菌漆酶深入，但细菌具有生长快、易于培养的特点，细菌漆酶较真菌漆酶在碱性环境和高温下具有更好的稳定性。由于工业造纸废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中受到稳定性差的限制，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。由于细菌芽孢对高温、高压、极端PH以及高盐等多种不利因素具有较强的抗逆性，因此芽孢杆菌属的芽孢漆酶会因芽孢这一特殊构造的特性而表现出更好的温度稳定性和PH稳定性。随着分子生物学技术的不断发展，众多的漆酶基因已经得到了克隆和深入分析。 通过克隆芽孢漆酶基因及其编码的氨基酸序列，有助于了解细菌漆酶在空间结构和催化特性方面与真菌漆酶存在的差异，此外，还可以通过定点诱变等技术对漆酶基因进行改造，提高细菌漆酶工业应用性能。
发明内容
本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WN01，同时本发明的目的还在于提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WN01芽孢漆酶的编码基因。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) WNOl已于2010年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 4265。上述枯草芽孢杆菌菌株是从中国黑龙江省哈尔滨市文昌污水处理厂活性污泥中分离获得，可催化氧化漆酶典型的底物ABTS，丁香醛连氮和2，6-二甲氧基苯酚。枯草芽孢杆菌WNOl菌株革兰氏染色阳性，芽孢中生，有鞭毛。在固体Luria-Bertani (LB)培养基上， 37°C培养Mh，菌落乳白色、扁平呈圆形，菌落表面湿润、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落半透明且正反颜色一致。菌株的最适生长温度为37°C，最适生长pH为5.0，可耐受-13%的 NaCl。本发明所提供的枯草芽孢杆菌漆酶基因，来自于枯草芽孢杆菌WN01，CGMCC No. 4265，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由1542个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1 位到第1542位碱基，包含1542个碱基对。本发明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定义的核酸分子所编码。本发明进一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式与SEQ ID No :2的氨基酸序列是相同的或同源的， 序列表中SEQ ID No 2由513个氨基酸组成。
具体实施例方式以下的实施方式是为了更好地理解本发明。以下实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可购买到的生化试剂。其中细菌基因组提取试剂盒和胶回收试剂盒是Omega公司产品，T载体和其他工具酶等均为 TaKaRa公司产品。实施例1枯草芽孢杆菌WNOl芽孢漆酶基因的克隆1.菌株漆酶基因的克隆将上述菌株挑至5mL LB液体培养基中，37°C，200rpm,培养过夜。参照Omega公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取上述菌株的基因组DNA，并经琼脂糖凝胶电泳检测。采用基因组DNA为模板，以上游引物“CGGGGATCCGACACTTGAAAAATTTG’，(酶切位点 BamH I)和下游引物“CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAG，，(酶切位点Β ο I)扩增菌株枯草芽孢杆菌WNOl芽孢漆酶基因。在200 μ L PCR 管中加入下列试剂ddH20 13. 75 μ L, IOXEx Taq Buffer2 μ L, 10mmol/L dNTP mixture 1 μ L，10 μ mol/L 上游弓 |物 1 μ L，10 μ mol/L 下游弓 |物 1 μ L，DNA模板1 μ L，Ex Taq酶0. 25 μ L，总体积20 μ L。同时设置阴性对照。PCR反应条件94°C 4min 预变性，94°C 45s，53°C 45s，72°C 2min，30个循环，72°C IOmin延伸。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。通过PCR扩增出足量的目的片段，经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后切下目的条带，用 Omega公司胶回收试剂盒参照说明书回收目的片段。回收的目的片段的纯度用琼脂糖凝胶电泳检测。2.连接T载体及转化1)按下列步骤加好反应液:pMD18-T vector 1 μ L，胶回收产物3 μ L，ddH20 1 μ L， Solution I 5口1^，总体积1(^1^，161连接反应111。2)将Ε. coli JM109感受态细胞在冰中融化。3)将10 μ L连接反应液加入到100 μ L感受态细胞中，轻轻吸打混勻，冰浴30min， 42°C保温 60s，冰浴 5min。4)加入890 μ L LB液体培养基，200rpm, 37°C培养lh。同时设置阴性对照。5)取适量上述培养液均勻涂在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上，37°C培养过夜。3.重组T载体的筛选和鉴定1)通过蓝白斑筛选白色的阳性转化子，将白色菌落挑至5mLLB/Amp液体培养基中，37°C，200rpm，培养过夜。
2)用质粒提取试剂盒参照说明书从过夜培养的菌液中提取质粒。3) PCR 鉴定。依次加入下列试剂ddH2013. 75 μ L，10 X Taq Buffer 2 μ L, 10mmol/L dNTP mixture 1 μ L，10 μ mol/L 上游引物 1 μ L，10 μ mol/L 下游引物 1 μ L，质粒模板 1 μ L，Taq 酶 0. 25 μ L，总体积20 μ L。同时设置阴性对照。PCR反应条件94°C 4min预变性，94°C 45s, 53 °C 45s, 72 °C 2min,,30个循环，72°C IOmin延伸。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。4)酶切鉴定。依次加入下列试剂10XKBuffer 2 μ L, BamHI 1 μ L，XhoI IyL,质粒 3yL， ddH20 13 μ L，总体积20 μ L。37°C反应池。1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。4.漆酶基因的测序及序列分析将PCR和酶切检测正确的阳性克隆送往上海英骏生物技术公司测序，测序结果见序列表 SEQ ID No :1ο
权利要求
1.枯草芽孢杆菌WN01，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.似65。
2.枯草芽孢杆菌WNOl具有漆酶活性的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表SEQID No 1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 漆酶基因是序列表中SEQ ID No :1。
4.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)漆酶，是具有序列表中SEQ ID No :2氨基酸残基序列的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌WN01(CGMCC No.4265)芽孢漆酶及编码该芽孢漆酶的核苷酸序列。枯草芽孢杆菌WN01具有漆酶活性的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表SEQ ID No1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。枯草芽孢杆菌WN01漆酶，是具有序列表中SEQ ID No2氨基酸残基序列的蛋白质。
文档编号C12N9/02GK102154150SQ20101059952
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者卢磊, 李泰仑, 杜美惠, 王天女, 赵丽艳, 赵敏 申请人:东北林业大学