加载dna的载体上的金纳米颗粒、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：加载dna的载体上的金纳米颗粒、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及加载DNA的载体上的金纳米颗粒，其制备方法及用途。更具体地，本发明涉及用于基因递送的具有锐利边缘的碳嵌入(carbon embeded)纳米金颗粒。本发明还涉及用于制备所述具有锐利边缘的碳嵌入纳米金颗粒的方法和用该纳米金颗粒转化植物的方法。尽管预期碳载体具有如惰性和较佳穿刺能力等特性，嵌入的Au纳米颗粒却提供了对DNA的最佳载体。
背景技术：
在生物成分中显示预期特性的基因操作打开了许多新的道路。病毒载体已经被鉴定为成功的基因递送载体。由于它们具有如急性毒性、细胞免疫反应、由于插入突变引起的致癌性、有限的承载能力、对重复感染和生产的抗性以及质量控制的可选方案等局限， 非病毒载体如基于脂类、多聚化合物、糖树枝状聚合物和多肽等系统已经显示为更佳的替代方案。正在研究纳米颗粒，尤其是碳纳米结构，用于基因递送应用。然而，大部分研究局限于动物系统或细胞系。另一方面，植物系统的非病毒载体相对欠发达，除了如在Nature， 1987327,70-73中所述的由Sanford等人开发的新方法，其使用了采用加速的DNA包被的微小金射弹将DNA递送进入完整的植物细胞中的粒子枪。作为对微小金结构的改进， Wang和其合作者合成了用于多重基因递送的加载纳米金的介孔二氧化硅，其公开于Nature Nanotech. ,2007,2,295-300中。尽管金覆盖的低密度介孔二氧化硅显示能穿透软玉米胚， 但没有可证明的数据表明其能穿透硬胚如一种木本树种。最近，在杂志“Small，，2006，2，621-625中 Leng Nie 等的题为"Three dimensional functionalized tetrapodlike ZnO nanostructures for plasmid DNA delivery，，白勺论文中，报道了一种将DNA递送进入人细胞系的模拟病毒载体衣壳的四足锐利结构，其中携带质粒的四足锐利尖端进入细胞，从而产生必要的转染。类似地，Vakarelski等在Langmuir， 2007，23，10893-10896中也报道了相比于需要较低的力(0. 1-0. 2nN)来穿透胞质膜的碳纳米管(直径为20-30nm)，硅纳米针(直径为200-300nm)需要0. 7-2. OnN的力，这再次强调了锐利物体在基因递送类应用中的功效。此处值得提及的是，关于细胞内和细胞外微生物的金属纳米颗粒合成可获得大量文献(参考 Narayanan，K. B.禾口 Sakthivel，N. 2010. Advances in Colloids and Interface Science. 156 [1-2] :1-13)。然而，却没有关于通过将纳米颗粒加载于锐利边缘的载体上的报道，其不仅能帮助DNA转运进软组织，也可以帮助DNA转运进硬组织。因此，现有技术的调查显示需要具有锐利边缘的遗传物质载体。而且，所述载体还应具有携带遗传物质的足够能力以及穿透硬材料但损伤较小的锐利度。所述载体的制备方法应当简单，易于实施并且还能填补现有技术的空白及满足本领域的需求。发明简述发明目的因此本发明的主要目的是提供边缘锐利的基因载体组合物。
本发明的另一个目的是提供用于基因递送的嵌入边缘锐利的载体中的金纳米颗粒。本发明的再另一个目的是提供具有穿透硬材料的能力且对材料损伤微小的遗传物质载体。本发明的又一个目的是提供具有较低质粒和金需求的用于基因递送的复合载体。本发明进一步目的是提供制备具有锐利边缘的加载DNA的载体上的纳米金颗粒的方法和用其转化植物的方法。

发明内容
考虑到具有锐利边缘的载体和纳米金的组合可以是基于基因枪的转化的一个重要突破，我们在这里描述了用生物化学/物理学/化学转化相结合的碳负载的金纳米颗粒的制备。通过惰性加热通过对应于ATCC18500的真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus) ITCC 6436原位合成的细胞内金纳米颗粒来制备该颗粒。600°C下热处理的细胞内金纳米颗粒为了简要的目的在本文中进一步表示为HTC-600AU。这种基质支持了金纳米颗粒，从而为 DNA提供了结合的平台，且提供了载体的最小密度，以获得穿透植物系统中的硬细胞壁的基因枪中的阈速度。嵌入碳基质中的Au纳米颗粒提供了 DNA可以结合的平台。碳载体夹住了 Au纳米颗粒并在DNA包被过程所需的超声步骤中防止它们浸出(leach)。另一方面，在纯碳材料中，由于不存在金，DNA不能结合。因此，本发明提供了加载DNA的载体上的金纳米颗粒，其特征为加载DNA的载体上的金纳米颗粒具有图2A中曲线2中所示的锐利边缘。本发明进一步提供了制备加载DNA的载体上的金纳米颗粒的方法，其中步骤包括[a]将能够合成细胞内金纳米颗粒的微生物培养物接种于营养培养基中并培养以获得生物质；[b]收获步骤[a]中获得的生物质，随后在无菌条件下用无菌蒸馏水洗涤生物质；[c]将步骤[b]中获得的经洗涤的生物质悬浮于HAuCl4溶液中并孵育2-3天，随后在无菌条件下用无菌蒸馏水洗涤生物质；[d]将步骤[C]中获得的经洗涤的生物质在管式炉中在惰性条件下热处理6-8小时以获得热处理的碳金HTC-600AU ；[e]用乙醇洗涤步骤M中获得的HTC-600AU ；[f]将乙醇洗涤的无菌HTC-Au-600与XHO缓冲液(基于Tris. Cl,NaC的缓冲液) 中悬浮的DNA混合；[g]用亚精胺和PEG顺序平衡步骤[f]中获得的混合物，随后在2. 5M CaCl2中超声处理；[h]以12000rpm离心步骤[g]中获得的超声处理的混合物并用无水乙醇洗涤沉淀 (pellet)两次，最后在所需体积的乙醇中重悬以获得加载DNA的载体上的金纳米颗粒。


图1. A 用金离子孵育前的生物质。
B 用金离子孵育后的生物质。C =SEM下真菌的细微菌丝。D SEM下的煅烧的生物质。
2. A =XRDif0曲线1 用IX IO^3M HAuCl4孵育的未煅烧的生物质；曲线2 在600°C下热处理的碳金(HTC 600-Au)；B 生物质的拉曼谱(样品1)；C 在600°C下热处理的碳金的拉曼谱(HTC 600-Au)。图3. (A)在600°C下热处理的碳金的SEM图(HTC 600-Au)；(B、C和D)在600°C下热处理的碳金的TEM图(HTC 600-Au)。注意如在C和D的 TEM图中显示的嵌入碳基质中的小金颗粒平面的存在；插图D金纳米颗粒的HRTEM图表明了对应于金的111相的“d”间隔。图4.将在Img 600°C下热处理的碳金(HTC 600-Au)上的不同浓度的质粒DNA标准化以匹配商售微米金规格获得的⑶S位点数。图5.生物弹轰击的银合欢属(leucaena)胚的SEM图。A、B、C 和 D :100、30、10 和 3μπι尺寸的胚；E禾口 F 10禾口 3 μ m尺寸的以HTC 600-Au轰击的胚；G禾口 H 10禾口 3 μ m尺寸的以微金颗粒轰击的胚；I禾Π J :1 μ m禾Π 300nm尺寸的未轰击的胚。图6.生物弹轰击的稻米愈伤组织的SEM图。A和B是以HTC 600-Au轰击的愈伤组织；C和D是以微金颗粒轰击的愈伤组织。发明详述就本发明的目的而言，“纳米金加载的边缘锐利的碳子弹”、“锐利碳质片上负载的金纳米颗粒”和“HTC 600-Au”的表述方式在整个说明书中是可互换使用的，且它们可以由本领域技术人员同样地理解的。此处所述术语“HTC 600-Au”是指用本发明的方法制备的在600°C热处理的碳金。在本发明中，将包含锐利碳质片上负载的金纳米颗粒的复合材料描述为用 Sanford和其合作者开发的基因枪进行基因递送的替代材料。尽管预期碳载体具有如惰性和较佳穿刺能力等的所需特性，嵌入的金纳米颗粒却提供了 DNA的最佳载体。用于制备上述复合材料的第一步包括将能在细胞内合成Au纳米颗粒的微生物生物质与金离子一起孵育，导致生物质显现宝石红色，这表明在细胞基质内金离子被还原为 Au纳米颗粒。将加入生物基质的金前体的浓度优化以获得进入生物基质的金纳米颗粒的最大加载。此外，发现测试的不同批次间煅烧后获得的金的浓度是一致的。为了确定复合材料HTC-600 Au可以作为有效的DNA递送剂发挥功能，以指定用于微米大小的金颗粒的普通常规方法[Bio-Rad Laboratories,Hercules,USA]用DNA包被上述合成的HTC-600 Au。最后，DNA包被的HTC-600 Au悬浮于无水乙醇中，且在使用前储存于-20摄氏度下。用Biolistic-PDS 100/He系统以上述DNA包被的HTC-600 Au的等分试样进行转化实验。在将质粒DNA至双子叶树种银合欢(Leucaena Ieucoc印hala)的递送标准化后，发现加载于HTC 600-Au(600°C下热处理的碳金)的仅200ng质粒DNA就足以比得上利用加载于商用非生物微米金载体(图3B)上的600ng质粒DNA所得的结果。因此，用加载于HTC 600-Au上的200ng质粒DNA进行所有其他研究。而且，根据颗粒大小分布(图2C ；插图) 和所用的金的重量，确定这200ng质粒DNA对应于约0. 23个质粒加载在一个金颗粒上。作为比较，加载在微米大小金上的600ng的质粒对应于载荷在各个颗粒上的约2100个质粒。 因此，很明显，由于有更大的表面积，质粒DNA能更均勻地铺展在HTC 600-Au上，且它们能有效地递送至期望的位置。因此，本发明公开了包括锐利碳质片上负载的金纳米颗粒的复合材料。在一个实施方式中，本发明提供了任选金属、金属离子或金属氧化物纳米颗粒的载体上的载体组合物。 在另一个实施方式中，发现本发明的金属纳米颗粒的载体上的载体组合物可用于许多领域，比如，但不限于，用于DNA递送、去除金属离子、燃料电池、抗细菌和催化作用中。在再另一个实施方式中，所述载体选自碳质材料、含氮材料、硫、含磷材料、细胞材料、生命物质及类似物。在另一个实施方式中，所述微生物优选选自施氏假单胞菌(I^eudomonas stutzeri)AG 259 ATCC 17588、海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)、鲍氏织线藻 (Plectonema boryanum)UTEX485、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α、荚膜红细菌 (Rhodobacter capsulatus)lif (Corynebacterium)p. SH09>^ifelf |ifM (Bacillus sp·)、乳酸菌属(Lactobacillus sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.) (AAT-TS-4) (ATCC. 16312)、单端孢霉属(Trichothecium sp.)、V. luteoalbum、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)禾口黄曲霉(Aspergillus flavus)。在又一个实施方式中，本发明提供了制备加载DNA的载体上的金纳米颗粒(优选负载于碳质载体上)的方法，其中步骤包括(a)在含麦芽糖-葡萄糖-酵母提取物和蛋白胨肉汤的培养基中接种真菌孢子；(b)使孢子在37°C下3天萌发以产生菌丝，以获得收获的生物质，随后在无菌条件下用热压处理的MilliQ 水洗涤生物质；(c)在HAuCl4溶液中重悬步骤(b)获得的生物质，随后37 °C下孵育两天，随后以 MilliQ 水洗涤；(d)将步骤(c)中获得的生物质在管式炉中在氮气流下600°C热处理6小时以获得产物 HTC 600-Au ；(e)用乙醇洗涤步骤(d)中获得的HTC-600 Au并与XHO缓冲液(基于Tris. Cl， NaC的缓冲液)中悬浮的DNA混合；(f)用亚精胺和PEG顺序平衡步骤(e)中获得的混合物，随后在2. 5M CaCl2中超声处理；(g)以12000rpm离心如步骤(f)中获得的超声处理的混合物并用无水乙醇洗涤沉淀两次，最后在所需体积的乙醇中重悬以获得碳质载体上负载的加载DNA的金纳米颗粒。在本发明的另一个实施方式中，孢子优选为对应于ATCC 18500的赭曲霉ITCC 6436的孢子。HAuCl4溶液的浓度优选为10_3摩尔。在再另一个实施方式中，将湿重为60g的经洗涤生物质悬浮于200mL 10_3M HAuCl4中。将产物热处理从而获得400mg HTC-600Au。在又一个实施方式中，通过惰性加热如实施例1中例举的由对应于ATCC18500的真菌赭曲霉ITCC 6436原位合成的细胞内金纳米颗粒来制备本发明的载体组合物。这种基质负载金纳米颗粒，从而为DNA提供了结合的平台，且提供了载体的最小密度以获得穿透植物系统中细胞壁的基因枪中的阈速度。在本发明的再另一个实施方式中，1至IOmg载体组合物与每次轰击至少2ng DNA 的组合表明在不同物种中的不同转化水平。在本发明的再另一个实施方式中，为了研究用于遗传修饰细胞的本发明载体组合物，对茄科、禾本科和豆科植物进行了研究。然而，本发明方法的遗传修饰细胞选自，但不限于，植物物种、细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞。在进一步的实施方式中，HTC 600-Au和微小金在烟草中三次重复的平均再生效率分别为41. 73%和38. 93%，其转化效率为14. 80%和12.40%。在稻米的情况中，HTC 600-Au和微小金的再生效率分别为26. 42%和23. 25%，其转化效率为9. 33%和8. 42%。 在银合欢属的情况中，由于需要更长的再生时间(6至7个月)，推定的转基因植物仍在选择过程中，因此再生和转化效率还没有得出。在另一个实施方式中，由于碳基质构成了 95%的载体，本发明中金的量和每次转化所用的DNA减少了。而且，在模型植物烟草(Nicotiana tcAaccum)、单子叶植物稻(Oryza sativa)和双子叶树种银合欢的制备材料中观察到的更高的瞬时或稳定的GUS表达和转化效率归因于由SEM研究证实的这种相比于典型的Ι.Ομπι非生物载体的更小的和边缘锐利的载体产生的更小损伤。GUS位点与HTC 600-Au有效载量的更高比例提供了降低嵌合体百分比的可能性，这是基因枪方法中的一个重要关注点。在再另一个实施方式中，金颗粒为纳米尺寸的，从而为操纵更多基因荷载提供了更高的金颗粒面积。边缘锐利的石墨样碳也可以穿透硬植物细胞壁和核膜并将基因定位于染色质丝中。SEM图表明用基因枪转化后，创伤愈合非常快，这是高效转化所需的。
实施例以下包括优选实施方式的实施例将用于说明本发明的实施，应理解所示细节是示例的方式且目的在于说明性讨论本发明的优选实施方式，而不应被解释为用于限制本发明的范围。实施例1 在典型反应中，将分离的真菌孢子接种于含200mL麦芽糖-葡萄糖-酵母提取物和蛋白胨肉汤的500mL爱伦美式烧瓶中。使得对应于ATCC 18500的赭曲霉ITCC 6436的孢子在37°C下在振动器QOOrpm)中萌发并产生菌丝3天。其产生湿重为60g的生物质， 收获该生物质并在无菌条件下用热压处理的MilliQ 水进行三轮洗涤(IOOOrpm 15分钟)。 然后将生物质重悬于200mL IO^3M HAuCl4中，随后在37°C下在振动器QOOrpm)中孵育2 天。以MilliQ 水洗涤生物质产物并在管式炉中在氮气流下热处理(600°C，6小时)。得到 400mg产物，精细研磨并鉴定。用AAS分析该样品中的金浓度，发现为约5wt%。该样品表示为HTC 600-Au。真菌生物质与金离子一起孵育导致生物质显现宝石红色，这表明在细胞基质内金离子被还原为Au纳米颗粒(图IA和B)。
实施例2 记录室温下干燥并粒化为粉末(图2A，曲线1)和在惰性气体中在600°C下煅烧 (图2A，曲线2)的生物质的XRD信号。如此制备样品的XRD图(曲线1)显示了 fee金的特征性d值为约2. 36,2. 04、1. 45和1.23人的多个布拉格反射。这清楚地表明纳米颗粒是刚刚通过生物质处理金离子而形成的。HTC 600-Au的峰(曲线2)比未加热制得的样品的峰更尖锐，表明了加热后结晶度的改善。实施例3 通过将碳负载的HTC 600-Au的水性分体液滴置于无定形碳涂覆的铜网上并使溶剂风干来制备其TEM样品。用以300kV加速电压操作的"Technai G2F_30型和以200kV操作的JEM 2100仪器记录透射电子显微(TEM)图像。图3A的SEM图像显示了由许多平板样材料制成的锐利颗粒。选择该图来突出显示这种材料可能具有的锐利尖端/边缘。较低放大率的TEM图像(图3B)表明嵌于边缘锐利的碳基质中的50nm Au纳米颗粒的存在。在图 3C中，除了少量50nm颗粒外，还观察到遍及碳层的大量5nm颗粒分布。在图3D中碳的更近视图仍然显示了波状边缘，表明其中一个片突出以形成锐利边缘的片束排列。一个分离的颗粒的HRTEM图像(插图3D)显示了2.4人的“d”间隔，与(111)金平面的2.36人点阵间隔匹配。实施例4 用632. 8-nm HeNe激光激发以反向散射配置测定拉曼谱。用配备电荷耦合阵列检测器和全息陷波滤波器的Jobin-Yvon HR800分光仪分析散射光。为了避免激光对样品的损伤，在低激光功率OW/cm2)下进行实验。HTC 600-Au的拉曼信号绘制于图2C中。曲线显示了无序碳特征性的约1590CHT1和约1350CHT1处的峰特征，分别称为G和D峰。将数据去卷积并拟合为两个高斯峰。根据1365CHT1和ΙδθΟοπΓ1处的峰的强度，确定HTC 600-Au中石墨平面内域尺寸(La)值为1.35nm，与无金纳米颗粒的纯碳样品中的0. 90nm形成对比。HTC 600-Au中1. 35nm的平面内尺寸仍表明无定形碳基质的存在。实施例5 用具有金中空阴极灯的Chemito-原子吸收光谱仪(AAS) 201测定金浓度。用Leica Stereoscan 440型记录扫描电子显微(SEM)图像。实施例6:烟草(N. tabaccum var. Anand 119)植物体外生长于不含任何植物生长调节剂的 Murashige和Skoog基础培养基(MS培养基196 上。两个月大植物的新鲜叶用作外植体， 并将其切成约5mm2块，在25士2°C下在生长培养器中于黑暗中接种于含1. 4%琼脂并补充 2%蔗糖、0.8% 6-苄氨基嘌呤(BAP)和α-萘乙酸(NAA)的MS基础培养基(ρΗ 5.8)中用于愈伤组织诱导。按每平方英寸(psi)900磅的规格以25英寸Hg真空和间隔4小时使用爆破片(rupture disc)在将来源于叶外植体的所选择胚发生性愈伤组织放置于90mm直径的Petri板中央后用HTC-600AU轰击两次。在黑暗中孵育两天后，将经轰击的愈伤组织转移至含MS基础培养基、B5维生素、lmg/L BAP、0. lmg/L NAA、30g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的分化培养基中一周，然后转移至含100mg/L浓度的植物选择标志物卡那霉素的相同培养基中。分析三轮选择后存活的推定转基因植株。手工去皮的稻米(本地优良的indica培育种IR64)种子用70%乙醇表面消毒3分钟，随后用1.5% (ν/ν)次氯酸钠消毒10-15分钟，再以无菌蒸馏水洗涤5-7次。然后将消毒种子置于含2.5mg/L 2，4-D的MS培养基(愈伤组织诱导培养基)上并在25士2°C下在黑暗中培养3周。在用PDS-1000/He生物弹颗粒递送系统首次轰击前4小时，计数50份脆弱的胚发生愈伤组织并置于装有含渗透剂的愈伤组织诱导培养基(补充36. 4g/L甘露醇和 6. 4g/L山梨醇的愈伤组织诱导培养基)的90mm直径的Petri板中央。如之前所进行的用爆破片轰击外植体两次。第二次轰击48小时后，将愈伤组织直接转移至含50mg/L潮霉素 B的MS愈伤组织诱导培养基上，并在25士2°C下培养15-18天。以15-18天的间隔将活跃增殖的愈伤组织在新鲜的选择培养基上分培养三次。将潮霉素B选择3轮后的增殖胚发生性愈伤组织转移至MS再生培养基(分别补充3mg/L和0. 5mg/L的BAP和NAA (Sigma，USA) 的MS培养基)。在25°C下，愈伤组织于光照(110-130mM/m2/s)下培养16小时，在黑暗中培养8小时，直至产生芽。将新生的芽转移至含30mg/L潮霉素B的MS生根培养基(半强度MS基础盐，MS维生素和15g/L蔗糖)中。实施例7 从豆荚中取出的一种常年生长的豆科树种银合欢(银合欢树，white popinac, subabul)的种子用1.5% (ν/ν)次氯酸钠溶液表面消毒10-15分钟，随后以无菌水洗涤4次。用一把尖锐的无菌镊子无菌分离未成熟的胚，芽尖朝上放置于含再生培养基 (1/2MS+Thia Dia Zuron) (0. 5mg/L)的90mm直径Petri板的中央。如之前所进行的轰击胚并在黑暗中保持两天。胚在未选择的情况下在上述再生培养基中生长一周后，在含IOOmg/ L卡那霉素的同样再生培养基中进行三轮选择，间隔为15天。将三轮200mg/L卡那霉素选择后存活的植株转移至含0.5mg/L细胞分裂素2ip(2-异戊烯基腺嘌呤)的1/2MS以增强转化新芽的延长。在上述所有实施例中，用聚合酶链式反应确认植物转化。轰击的组织用SEM检验， 以显现损伤和穿透效率。图4表明仅仅200ng质粒就足以比得上与植物转化中所用的600ng 经典非生物微米金载体的结果。还发现当每单位HTC 600-Au的DNA浓度增加时，可以获得 GUS表达位点的更高水平，这可以优化，且非常好地用于其它植物转化系统。因此，可以推测，通过细胞内生物源的纳米颗粒的简单热处理制备的边缘锐利的载体上的Au纳米颗粒证明为比市场可买到的纳米大小的金颗粒更佳的植物转化非生物载体。这说明了细胞内合成的纳米颗粒的独特应用，否则，除非从基质中分离纳米颗粒，其没有应用。本发明的优点本发明提供的复合物的优点如下-由于金颗粒为纳米级别，获得了更高的金表面积，因此可以操纵更高基因载荷。-由于已知金支持高DNA包装密度，它可能得到更高的转化效率和低核酸酶降解。-嵌入的金也改善复合物的密度，从而使之能够获得必要的阈速度。-而且，边缘锐利的石墨样碳可以穿透硬植物细胞壁和核膜并将基因定位于染色体位点中。SEM图像表明，转化后细胞壁/核膜的创伤愈合非常快，这是高效转化所需要的。
权利要求
1.加载DNA的载体上的金纳米颗粒，其特征在于所述加载DNA的载体上的金纳米颗粒具有图2A中曲线2中所示的锐利边缘。
2.如权利要求1所述的加载DNA的载体上的金纳米颗粒，其中所述载体选自碳质材料、 含氮材料、硫、含磷材料、细胞材料和生命物质。
3.如权利要求1所述的加载DNA的载体上的金纳米颗粒，其中载体优选为碳质。
4.如权利要求1所述的加载DNA的载体上的金纳米颗粒，用于穿透细胞壁，优选用于基因递送。
5.制备加载DNA的载体上的金纳米颗粒的方法，其中包括步骤[a]将能够合成细胞内金纳米颗粒的微生物培养物接种于营养培养基中并培养以获得生物质；[b]收获步骤[a]中获得的生物质，随后在无菌条件下用无菌蒸馏水洗涤所述生物质；[c]将步骤[b]中获得的经洗涤的生物质悬浮于HAuCl4溶液中并孵育2-3天，随后在无菌条件下用无菌蒸馏水洗涤所述生物质；[d]将步骤[c]中获得的经洗涤的生物质在管式炉中在惰性条件下热处理6-8小时以获得热处理的碳金HTC-600AU ；[e]用乙醇洗涤步骤[d]中获得的HTC-600AU；[f]将乙醇洗涤的无菌HTC-Au-600与悬浮于XHO缓冲液(基于Tris.Cl，NaC的缓冲液)中的DNA混合；[g]用亚精胺和PEG顺序平衡步骤[f]中获得的混合物，随后在2.5M CaCl2中超声处理；[h]以12000rpm离心步骤[g]中获得的超声处理的混合物并用无水乙醇洗涤沉淀两次，最后在所需体积的乙醇中重悬以获得加载DNA的载体上的金纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的方法，其中微生物优选自施氏假单胞菌AG259 ATCC 17588、海藻希瓦氏菌、鲍氏织线藻UTEX485、大肠杆菌DH5ci、荚膜红细菌、棒状杆菌p. SH09、芽孢杆菌属、乳酸菌属、轮枝菌属(AAT-TS-4) (ATCC. 16312)、单端孢霉属、V. luteoalbum、赭曲霉和黄曲霉。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述微生物优选为对应于ATCC18500的赭曲霉 ITCC 6436。
8.如权利要求5所述的方法，其中HAuCl4溶液的浓度优选为10_3摩尔。
9.如权利要求5所述的制备加载DNA的载体上的金纳米颗粒的方法，优选在碳质载体上，其中包括步骤[i]在含麦芽糖-葡萄糖-酵母提取物和蛋白胨肉汤的培养基中接种对应于ATCC 18500的赭曲霉ITCC 6436的真菌孢子；( )使孢子在37°C下三天以萌发而产生菌丝，以获得收获的生物质，随后在无菌条件下用热压处理的MiIliQ^水洗涤所述生物质；(iii)在HAuCl4溶液中重悬步骤(ii)中获得的生物质，随后在37°C下孵育两天，随后用MiIliQ 水洗涤；(iv)将步骤(iii)中获得的生物质在氮气流下在管式炉中600°C下热处理6小时以获得产物 HTC-600AU ；(ν)用乙醇洗涤步骤(iv)中获得的HTC-6OOA11并与悬浮于XHO缓冲液(基于Tris. Cl， NaC的缓冲液)中的DNA混合；(vi)用亚精胺和PEG顺序平衡步骤(ν)中获得的混合物，随后在2.5M CaCl2中超声处理；(vii)以12000rpm离心步骤(vi)中获得的超声处理的混合物并用无水乙醇洗涤沉淀两次，最后在所需体积的乙醇中重悬以获得负载在碳质载体上的加载DNA的金纳米颗粒。
10.基本上如本文中参照说明书所附的实施例和附图所述的加载DNA的载体上的金纳米颗粒、其制备方法及其用途。
全文摘要
本发明涉及嵌于锐利碳质载体中的DNA加载金纳米颗粒，其可用于DNA更高效地递送进入植物。这些纳米金嵌入的碳基质通过生物源的细胞内金纳米颗粒的热处理来制备。在植物模型中测试DNA递送效率。这些材料表现出转运物质的良好分散，从而产生更多的单位面积GUS位点。复合载体的额外优点是更少的质粒和金的需求。具有制备的碳负载颗粒的植物细胞损伤非常小，这可以从与商售的微米尺寸的金颗粒相比植物再生和转化效率的增加来判断。这可能是由于碳载体所具有的锐利边缘，其导致使损伤最小化的同时具有更佳的穿刺能力。
文档编号C12N15/10GK102575247SQ201080042978
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月3日 优先权日2009年8月4日
发明者L·V·B·帕拉萨德, M·K·巴希尔, S·V·佩里亚萨米, U·A·奥萨拉萨拉 申请人:科学与工业研究委员会