水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记的制作方法

专利名称：水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记。
背景技术：
稻痕病是由子囊菌Magnaporthe gri sea (Hebert) Barr [无性世代为Pyriculariagrisea(Cooke) Sacc.]引起的,广泛分布于水稻栽培的国家和地区，是水稻上最重要的病害之一。近年来其危害面积逐年扩大，危害程度日趋严重，已成为水稻高产、稳产的主要障碍因素之一。目前生产上一般采用传统的化学防治和种植抗性品种来控制病害。由于水稻的单一种植和稻瘟病菌生理小种遗传的复杂性和高度变异的致病性，一般新选育出优良品种在大面积推广3-5年就丧失抗病性。所以寻找和利用具有广谱抗性的抗源和抗性基因是当前控制稻瘟病的最有效、最经济的措施。传统的抗病育种依赖于抗性鉴定和植株表型选择，要求具有丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间，常规育种中很难选育出同时具有多个抗病基因的持久抗病品种。上个世纪60年代日本利用传统的形态标记鉴定了 14个抗病位点。但随着分子标记技术的迅速发展，在水稻的12染色体上发现了大概50多个抗稻瘟病位点，这些抗病位点分布在除第3染色体外的其余11条染色体，利用与这些抗病基因紧密连锁的分子标记实现多个抗病基因的聚合，拓宽水稻的抗谱。但有部分位点被重复定位到染色体的同一位置附近，如，定位在第11染色体的Pik及其4个等位基因Piks、Pik\ Pikp, Pikm的位置上，还定位了 Pil、Pil8、Pi7、Pif。另外在这个区域还定位了抗白叶枯病基因Xa3、Xa4、Xa26、Xa22。在第12染色体靠近着丝粒的附近定位至少7个抗稻瘟病基因。主要包括Pi4、Pita、Pita2、Pi62 (t)、Pi6及Pi39。在第6染色体上的Piz位点附近也发现了抗稻瘟病基因Piz5 (Pi2)、Piz'Pi^PignuPiACKPiZe及Pi42。目前这些抗病基因之间的关系还不明确，所以克隆这些抗稻瘟病基因对认识抗病基因结构组成、进化与广谱抗病机理提供重要的线索。同时也为这些抗病基因的利用奠定基础。目前已经克隆的抗稻瘟病基因有14个Pib、Pita、Pi2/Piz\ Pi9、Pi36、Pi37、Pid2、Pid3、Pik、Pikm、Pikh、Pit、Pbl、Pi3/Pi5。Pigm 至今未被成功克隆获得。其中 Pid2编码一类新的含有胞外的B型植物凝集素受体激酶结构域和胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的抗病蛋白，为研究抗病机制提供新的线索。含有Pib、Pita、Pi2/Piz\ Pi9、Pi36、Pi37、Pid3、Pik、Pikm、Pikh、Pit、Pbl、Pi3/Pi5 基因编码非常典型的 NBS-LRR 类抗病蛋白，Pib、Pita分别来自日本的粳稻，对中国的稻瘟病菌小种的抗谱窄。最初从日本的水稻品种TorideI引进具有广谱抗性Pizt转育出水稻品种中花9号，对稻瘟病普遍表现高度抗病，在北方大面积推广后，导致侵染Pizt稻瘟病菌生理小种的迅速增殖，从而使中花9号的推广范围受到限制。具有广谱抗性的基因还有Pil、Pi3/Pi5、Pi33、Pi9这些抗源在杂交水稻的抗病育种的应用价值较大。
目前，单一利用一个广谱抗病基因非常容易被稻瘟病菌克服，所以非常有必要从水稻生产寻找和筛选具有广谱持久抗性抗源，分析它们的抗病组成及广谱抗病机理来指导生产上的抗病育种。

发明内容
本发明的目的在于提供水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆方法及分子标记。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组(a) SEQ ID NO :3氨基酸序列的多肽； (b)将SEQ ID NO 3氨基酸序列经过一个或多个(如1_50个，较佳地1_30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗微生物侵染的功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的微生物是对植物有害的微生物，较佳地所述微生物为子囊菌亚门真菌(Magnaporthe gri sea (Hebert) Barr ;较佳地，无性世代为Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc.。在另一优选例中，该多肽是具有SEQ ID NO :3氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，所述的植物是单子叶植物；较佳地，所述的植物是禾本科植物；更佳地，所述的植物选自(但不限于)水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦等。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，所述的多核苷酸是如SEQ ID NO :1所不核苷酸序列的多核苷酸；如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的多核苷酸；或如SEQ ID NO 2中第2001-9065位所示核苷酸序列的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种植物，其包含前面任一项所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽。在本发明的另一方面，提供所述的多肽或其编码基因的用途，用于提高植物的抗微生物侵染能力。在本发明的另一方面，提供一种提高植物的抗微生物侵染能力的方法，该方法包括使植物表达所述的多肽；或提高植物中所述的多肽的表达或活性。在另一优选例中，所述方法包括将编码所述的多肽的多核苷酸转入到植物基因组中。在另一优选例中，所述方法包括
(I)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述多肽的编码序列；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤⑴中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码序列转入植物细胞。在另一优选例中，借助基因枪等方法将含有所述的多肽的编码序列转入植物细胞。在另一优选例中，所述方法还包括(3)选择出转入所述多肽的编码序列的植物细胞、组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。 在另一优选例中，所述方法还包括同时使植物表达其它具有抗微生物感染功能的多肽；或同时提高植物中其它具有抗微生物感染功能的多肽的表达或活性。在另一优选例中，所述其它具有抗微生物感染功能的多肽选自下组Pib蛋白、Pita蛋白、Pi2/PiZt蛋白、Pi9蛋白、Pi36蛋白、Pi37蛋白、Pid2蛋白、Pid3蛋白、Pil蛋白、Pik蛋白、Pikm蛋白、Pikh蛋白、Pit蛋白、Pb I蛋白、Pi3/Pi5蛋白。在本发明的另一方面，提供一种由前述方法制备获得的转基因植物。在本发明的另一方面，提供所述的多肽或其编码基因的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力(抗病性)；或用于制备鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物。在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物，所述的分子标记物特异性识别所述的多肽或其编码基因(包括外显子、内含子或5’或3’侧翼序列(含启动子))。在另一优选例中，所述的分子标记物选自(但不限于)特异性的引物、特异性的探针、特异性的限制性内切酶、或特异性的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。在另一优选例中，所述的分子标记物是特异性扩增所述的多肽的编码基因(包括外显子、内含子或5’或3’侧翼序列(含启动子))的引物对；且，该引物的扩增产物中包括SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或序列片段。在另一优选例中，所述的引物对选自SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示核苷酸序列的引物对；SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示核苷酸序列的引物对；或SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示核苷酸序列的引物对。在本发明的另一方面，提供所述的分子标记物的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力。在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗微生物感染能力的试剂盒，包含所述的分子标记物。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包含使用说明书。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其是包括SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的多核苷酸的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力。在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗微生物感染能力(抗病性)的方法，所述方法包括
检测植物中所述的多肽或其编码基因的存在与否；若存在，则表明植物具有抗微生物感染能力。在另一优选例中，检测植物中所述的多肽的编码基因的存在与否的方法是
(I)以该植物的基因组为模板，以引物对进行PCR扩增；其中，所述的引物对选自SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示核苷酸序列的引物对；SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示核苷酸序列的引物对；或SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示核苷酸序列的引物对；(2)分析⑴的扩增产物，若其中包括SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或序列片段，则表明植物具有抗微生物感染能力。在另一优选例中，所述的SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示核苷酸序列的引物对的扩增产物的大小为856bp ;所述的SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示核苷酸序列的引物对的扩增产物的大小为472bp ;所述的SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示核苷酸序列的引物对的扩增产物的大小为777bp。在另一优选例中，所述的分析扩增产物的方法包括(但不限于)测序鉴定、限制性内切酶酶切鉴定或电泳鉴定等。在本发明的另一方面，提供一种分离的启动子，所述的启动子选自下组(I)如SEQ ID NO 2中第1-2000位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)在严格条件下能够与(I)限定的多核苷酸序列杂交且具有启动目的基因表达(组成型表达)的功能的多核苷酸；或(3)与(I)限定的多核苷酸序列具有90%以上(优选95%以上，更优选98%以上，最优选99%以上)相同性且具有启动目的基因表达的功能的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，用于启动目的基因的组成型表达。在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的启动子。在另一优选例中，所述构建物中，所述的启动子的下游含有至少一个多克隆位点(如酶切位点)，其与所述的启动子可操作性连接，用于插入目的基因。在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。在另一优选例中，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件所述的启动子；和目的基因。在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的多肽。在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp (优选的，小于IOOObp ;更优选的，小于500bp ;最优选的，小于300bp)。在本发明的另一方面，提供一种启动目的基因表达的方法，所述的方法包括将构建物转化植物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因。在另一优选例中，所述方法包括
(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转 入植物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图I、载体 plndigoBAC-5 图谱。图2、载体 pCAMBIA 1301 图谱。图3、Pigm初步定位在第6染色体。a表示定位Pi9、Pi2的标记,b表示定位Pi25、Pi 26的标记。图4、A、B分别是CAPS标记C5483和C0428检测10个重组交换个体的多态性。C、表示共分离标记S29742在不同抗感池中扩增的带型。P1 :谷梅 4 ；P2 Maratelli !F1 :谷梅 4 与 Maratelli 杂交 1-10 感病交换单株；RU S1-R6、S6 分别是由菌株 CH109、CH63、101/1/1、101/4/8、01_19 和 CH199 接种F2构建的抗感池。图5、Pigm的精细定位图谱。A，根据1556感病单株构建覆盖Pigm的contig图谱。这些BAC/PAC均来自IRGP测序的日本晴，标记下面的括号里数字代表是该标记存在的交换个数，B，Pigm精细定位在标记C5483和C0428间，与标记S29742、c24901, pc22705共分离。C，Pigm位点对应的日本晴的70kb序列中包含6个抗病基因和9311基因组中含有5个抗病基因。图6、水稻谷梅4大分子量基因组DNA。图7、最佳部分酶切条件的确定。M =Markers ;1_7 :1/8DNA凝胶块分别用 0、0. 5、1、2、3、5、10 单位的 HindIII 酶切的结果。图8、酶切后DNA片段的两次选择A，第一次脉冲场电泳分离，切下含100_300KbDNA大片段的胶带(图中黑洞处)；B，第二次脉冲场电泳分离，切下含100-300Kb DNA大片段的压缩胶带(图中黑洞处)。图9、水稻谷梅4基因组BAC文库插入片段大小检测。图10、水稻谷梅4基因组BAC文库插入片段的分布。图11、含Pigm基因阳性候选BAC克隆的PCR筛选。A，图中1-12，A-H为不同BAC质粒DNA池，B，图中1-20为不同BAC克隆质粒。图12、由筛选的候选BAC克隆构建的覆盖Pigm的物理图谱。BC2F2-R :抗病BC2F2-S 感病。图13、谷梅4基因组中Pigm位点R基因与对应的日本晴及9311基因组的同源序列比较。图14、Pigm位点包含的抗病基因数目多于Pi9、Pi2。图15、反转录转座子Ty3/gyspy的结构示意图。
图16、不同的Pigm候选抗病基因具有相同的结构。
图17、Pigm位点的不同抗病基因间序列一致性分析。图18、Sau3AI 部分酶切 BAC30 质粒 DNA。图19、回收2U/ml Sau3AI部分酶切BAC30质粒DNA的15_30kb的片段。图20、HindIII (A)和BamHIII⑶酶切验证亚克隆插入片段大小。图21、覆盖整个BAC30的亚克隆重叠连锁群。图22、引物S26205检测57的Tl代转基因植株。图23、Pigml基因组成型表达。0表示未接种时取样，4、12、24、48、96，不受病原菌的诱导，在根，叶，幼苗，穗部位表达一致。图24、在黑龙江农科院2008年接种统计结果(左)以及在湖北恩施国家病圃鉴定结果(右)。图25、Pigm/Pi9/Pi2位点的抗病基因基因的成员聚类分析。主要依据基因的编码序列进行分析，没有完整的编码框的选取其基因组序列。图26、分子标记M26205鉴定Pigm的转育株系和Pi9，Piz, Pi2，Pizt。图27、Pigm位点不同抗病蛋白(R4、R6、R8)与Pi9、Pi2、Pizt蛋白序列比较。图28、pCambria 1301N 质粒图谱。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，首次筛选到一份抗性广谱突出的籼稻品种，并进而找到该品种中含有的具有广谱抗病性的显性基因，定名为Pigml。基于该基因，可制备抗病能力增强的转基因植物，或制备出鉴定植物抗病能力的分子标记物。本发明还提供了特异性鉴定Pigml的分子标记物。如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，只要所述“植物”是易于被微生物侵染的，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)棉花、小麦、大麦、黑麦、7JC稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为本发明的优选方式，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦等。如本文所用，所述的微生物是一些对植物有害的微生物。较佳地为子囊菌亚门真菌(Magnaporthe grisea (Hebert) Barr,其无性世代为 Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.；更佳地为稻梨孢属的真菌；更佳地为稻瘟病菌。所述微生物可以侵染杂草(如画眉草)、禾本科植物(大麦、水稻、短柄草等)。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的植物抗病多肽(蛋白)”、“分离的提高植物抗病能力的蛋白”、“分离的Pigml蛋白”或“分离的Pigml多肽”是指Pigml蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Pigml蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本文中，“多肽”和“蛋白”代表了等同的意义，可互换使用。如本文所用，所述的“抗微生物感染”与“抗病”可互换使用。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括Pigml蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的Pigml蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“Pigml蛋白”指具有提高植物抗病能力的功能的SEQ IDNO :3序列的多肽。该术语还包括具有提高植物抗病能力的、SEQ ID NO :3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为50个以内，较佳地20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Pigml蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Pigml蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Pigml蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Pigml蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 Pigml蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有Pigml蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约100个连续氨基酸，更佳地至少约300个连续氨基酸，最佳地至少约600个连续氨基酸。 本发明还提供Pigml蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Pigml蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“Pigml蛋白保守性变异蛋白”指与SEQ ID NO 3的氨基酸序列相比，有至多50个，较佳地至多30个，更佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表0进行氨基酸替换而产生。表0
权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组 (a)具有SEQID NO : 3氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO :3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗微生物侵染的功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组 (a)编码如权利要求I所述多肽的多核苷酸； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，它是 具有SEQ ID NO : I所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的多核苷酸；或 具有SEQ ID NO 2中第2001-9065位所示核苷酸序列的多核苷酸。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体；或其基因组中整合有权利要求2或3所述的多核苷酸。
6.权利要求I所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含 (a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞； (b)从培养物中分离出权利要求I所述的多肽。
7.权利要求I所述的多肽或其编码基因的用途，其特征在于，用于提高植物的抗微生物侵染能力；或用于鉴定植物的抗微生物感染能力；或用于制备鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物。
8.一种提高植物的抗微生物侵染能力的方法，其特征在于，该方法包括使植物表达权利要求I所述的多肽；或提高植物中权利要求I所述的多肽的表达或活性。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求I所述的多肽的多核苷酸转入到植物中。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括 (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求I所述的多肽的编码序列； (2)将植物细胞、组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码序列转入植物。
11.一种鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物特异性识别权利要求I所述的多肽或其编码基因。
12.如权利要求11所述的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物是特异性扩增权利要求I所述的多肽的编码基因的引物对；且，该引物的扩增产物中包括SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列或序列片段。
13.如权利要求12所述的分子标记物，其特征在于，所述的引物对选自 SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的引物对； SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示核苷酸序列的引物对；或 SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11所示核苷酸序列的引物对。
14.权利要求11-13任一所述的分子标记物的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力。
15.—种鉴定植物的抗微生物感染能力的试剂盒，其特征在于，包含权利要求11-13任一所述的分子标记物。
16.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其是包括SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的多核苷酸。
17.权利要求16所述的多核苷酸的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力。
18.—种鉴定植物的抗微生物感染能力的方法，其特征在于，所述方法包括 检测植物中权利要求I所述的多肽或其编码基因的存在与否；若存在，则表明植物具有抗微生物感染能力。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，检测植物中权利要求I所述的多肽的编码基因的存在与否的方法是 (1)以该植物的基因组为模板，以引物对进行PCR扩增；其中，所述的引物对选自 SEQ ID NO :6和SEQ ID NO : 7所示核苷酸序列的引物对； SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的引物对；或 SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示核苷酸序列的引物对； (2)分析(I)的扩增产物，若其中包括SEQID NO :4所示的核苷酸序列或序列片段，则表明植物具有抗微生物感染能力。
20.一种分离的启动子，其特征在于，所述的启动子选自下组 (1)如SEQID NO 2中第1-2000位所示的核苷酸序列的多核苷酸； (2)在严格条件下能够与(I)限定的多核苷酸序列杂交且具有启动目的基因表达的功能的多核苷酸；或 (3)与(I)限定的多核苷酸序列具有90%以上相同性且具有启动目的基因表达的功能的多核苷酸。
21.权利要求20所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于启动目的基因的组成型表达。
22.—种构建物，其特征在于，所述的构建物含有权利要求20所述的启动子。
23.如权利要求22所述的构建物，其特征在于，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件 权利要求18所述的启动子；和 目的基因。
24.一种启动目的基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括将构建物转化植物，所述的构建物含有权利要求20所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因。
全文摘要
本发明涉及水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记。首次筛选到一份抗性广谱突出的籼稻品种，并进而找到该品种中含有的具有广谱抗病性的显性基因，定名为Pigm1。基于该基因，可制备抗病能力增强的转基因植物，或制备出鉴定植物抗病能力的分子标记物。本发明还提供了特异性鉴定Pigm1的分子标记物。
文档编号C12N1/21GK102633870SQ201110037790
公开日2012年8月15日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者何祖华, 曾龙军, 朱旭东, 李群, 邓一文 申请人:中国水稻研究所, 中国科学院上海生命科学研究院