专利名称：检测外源基因的核酸杂交膜条及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种检测外源基因的核酸杂交膜条及其应用，可用于植物种子、食品及其加工过程、观赏型植物繁殖体等植物种质资源和产品的外源基因检测。
背景技术：
全球范围内目前已有十多个国家在广泛种植转基因作物，种植面积达到上千万公顷，涉及作物达到数十种，用这些转基因作物生产加工的食品更是达到上万种。转基因植物具有产量高、抗逆性高、品质好、抗病、抗虫等特性，现已开发的转基因番茄、抗虫棉等产品效果良好，受到农户的重视而进一步加大了种植面积。同时，由于国家加大了转基因产品研究力度，转基因植物的新技术和新产品也在不断产生。但是，自转基因技术出现，世界各国、联合国组织和其他非政府组织一直关注转基因产品的安全性，尤其关注转基因食品对人的健康和转基因作物对生态的影响，转入苏云金芽孢杆菌(feciBM iAari/^ie/^is，简称召 )基因等含有毒蛋白的转基因植物更是饱受争议。因此，此类转基因植物产品目前没有用于人类食品加工，而是作为工农业原材料和动物饲料。由于目前还没有明确转基因技术对人类健康和生态环境是否会产生有害影响，各国政府都对转基因产品采取了谨慎态度。2000年联合国通过的“生物安全议定书”详细规定了转基因生物有关过境、审批、检测和管理等责任，防止有风险的转基因产品任意扩散。 2001年欧盟要求对转基因食品进行强制标识管理。因此，对相关产品进行转基因检测、鉴定对加强转基因产品的管理，保障消费者的利益是十分必要的。判断植物种质资源和产品是否为转基因产品、转基因产品的百分含量以及是否为国际上公认的安全性的转基因产品是对转基因植物及其产品进行安全性评价和流向及用途实施监管的基础。目前对转基因成分的检测主要是对外源基因(DNA)和外源基因表达产物(RNA和蛋白质)进行检测。其中，DNA检测的适用范围广，准确性高，便于定性和定量检测。DNA的主要检测方法包括Southern杂交法、基因芯片检测法、PCR检测法和其他相关改进方法。Southern杂交法对设备条件要求较低，但是操作繁琐、易污染；PCR检测法是现在常用的检测方法，但设备价格及对试验条件要求较高；芯片技术具有样品用量少，一次检测目标基因多的优点，但是高密度的基因芯片制作成本高，需要检测信号的仪器价格高昂。膜条杂交法本质上是一种基因芯片检测法，是将寡核苷酸按照可寻址的方式固定在尼龙膜上，形成阵列。同时，根据转基因工程中常用的启动子(如CaMV35S启动子)、终止子(N0S终止子)、筛选基因以及常用的目标基因(如抗虫，耐除草剂基因)等的序列设计捕获探针制作膜条，便能够捕获样品中的目标基因，从而完成检测。膜条杂交能一次检测多个目标基因，且制作成本低，信号检测不需要高端仪器，因此装备简单的实验室都可以应用。中国专利申请CN01214517提出了一种用于转基因植物鉴定的基因检测芯片，在平面型支承载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以微点阵方式排布有供转基因植物判断用的外源基因探针；中国专利申请CN101717825A公开了一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法，用一对SSR特异引物对转基因植物进行PCR检测， 就可以快速检测转基因株系的拷贝数；中国专利申请CN1718742A公开了一种用于诊断 β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒，其核酸杂交膜条包括基底和固定于基底上的特异性探针，每一条所述的特异性探针分别针对一个突变的珠蛋白基因位点，每一条突变探针包含14-20个碱基的序列。该核酸杂交膜条，对正常、突变杂合子、突变纯合子都很容易判断，且信号特异性非常好，诊断效率和诊断准确性高、又能降低成本；中国专利申请 CN101545011公开了一种结核分枝杆菌耐药突变基因检测膜条及试剂盒，将检测结核分支杆菌耐药突变基因的特异性寡核苷酸探针固定于基底上，试剂盒可同时检测rpoB、katG、 inhA、embB、rpsL五种基因上多种常见的耐药突变类型，具有检测快速、准确及通量大等优点；中国专利申请CN275^68公开了一种瘢痕疙瘩p53基因检测膜条，该膜条为长条状，分成三格，其中边沿的一格为空白对照格，在另外两格内分别设有等位基因特异性寡核苷酸 Pro探针和等位基因特异性寡核苷酸Arg探针，具有检测结果分辨率高，技术简便、快速、可靠的优点。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种检测外源基因的核酸杂交膜条；本发明的另一个技术目的在于提供一种该核酸杂交膜条的应用方法。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案在于
一、一种检测外源基因的核酸杂交膜条，其特征在于通过以下方法制得 首先根据转基因植物中的外源基因对应设计出匹配探针从来自转基因植物中的外源基因的保守区域特异捕获探针，并在探针的5'加oligo(dt)n;其中，0lig0(dt)n为5-15 个寡核苷酸；对探针的5'端进行氨基修饰；
其次，将得到的探针固定于核酸杂交膜条基底膜片上在核酸杂交膜条基底膜片上划格，方格大小为0.1-1.0 cm，格间呈矩阵排列；基底膜片经EDC活化处理20-40 min 后，其表面的活性羧基能够与末端带有氨基的寡核苷酸探针发生反应，生成酰胺键，从而将加0lig0(dt)n和氨基修饰过的探针牢牢地固定在基底膜片上；通过点样装置，将加 0lig0(dt)n和氨基修饰过的探针按照矩阵规律点样于基底膜片上，经过水合固定和干燥处理后制成核酸杂交膜条，然后干燥，得到本发明所述的核酸杂交膜条。其中，本发明所述的oligo (dt) η为10-12个寡核苷酸。本发明所述的核酸杂交膜条基底膜片上的方格大小为0. 3-0. 5 cm。本发明所述的探针的捕获、制备及修饰的方法应理解为现有技术中的任何常规的探针捕获、制备及修饰方法。本发明所述的每一条特异捕获探针包含30-37个碱基不等。特异捕获探针的序列来自外源基因的保守区域，这样可使探针能够更好的与目的基因结合， 提高检测效率。其中，本步骤所述的转基因植物中的外源基因应理解为现有技术中任何外源基因、导入这些外源基因所用的启动子序列和终止子序列。这些目标基因主要是公开选自植物、微生物或动物基因中的一个或一个以上DNA序列及其组合，其功效主要是抗虫、抗除草齐U、抗病、抗逆、提高品质，但不局限于这些功效。在本发明中涉及的外源基因包括但不限于 CaMV35S、Nos> Npt II、AacU aadA、Ahas> ALS> AMY797E、APH4、Aph II、Bar、Barstar> Bla、 Cordap A、CP、CrylA (b)、Cry2Ab、CryIAs, cry2c、cry3A、Epsps、PAT、PG。这些外源基因的表达在转基因植物中的作用如表1所述。 表1本发明所述转基因植物中的常见外源基因及其作用
权利要求
1.一种检测外源基因的核酸杂交膜条，其特征在于通过以下方法制得首先根据转基因植物中的外源基因对应设计出匹配探针从来自转基因植物中的外源基因的保守区域特异捕获探针，并在探针的5'加oligo(dt)n;其中，0lig0(dt)n为5-15 个寡核苷酸；对探针的5'端进行氨基修饰；其次，将得到的探针固定于核酸杂交膜条基底膜片上在核酸杂交膜条基底膜片上划格，方格大小为0. 1-1.0 cm，格间呈矩阵排列；基底膜片经EDC活化处理20-40 min ；通过点样装置，将加oligo (dt) η和氨基修饰过的探针按照矩阵规律点样于基底膜片上，经过水合固定和干燥处理后制成核酸杂交膜条，然后干燥，得到核酸杂交膜条。
2.根据权利要求1所述的检测外源基因的核酸杂交膜条，其特征在于所述的 oligo (dt) η为10-12个寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的检测外源基因的核酸杂交膜条，其特征在于所述的核酸杂交膜条基底膜片上的方格大小为0. 3-0. 5 cm。
4.根据权利要求1所述的检测外源基因的核酸杂交膜条，其特征在于所述的外源基因是 CaMV35S、Nos、Npt II、Aad、aadA、Ahas、ALS、AMY797E、APH4、Aph II、Bar、Barstar、Bla、 Cordap A、CP、CrylA (b)、Cry2Ab、CryIAs> cry2c、cry3A、Epsps、PAT、PG0
5.根据权利要求1所述的检测外源基因的核酸杂交膜条，其特征在于所述的用于制备核酸杂交膜条基底膜片是尼龙膜、硝酸纤维素膜、醛基化玻璃片、氨基化玻璃片或者磁珠。
6.权利要求1所述的检测外源基因的核酸杂交膜条在检测植物种质资源和产品的外源基因中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于包括以下步骤(1)植物样品DNA的提取和标记采用试剂盒法或CTAB法进行植物样品DNA提取；采用无毒、无放射性生物素或地高辛的UTP来标记样品DNA，并在37°C下温育3_10 h反应，完成后添加1_2 μ 的0. 2-0. 5 M的 EDTA，在pH 8. O条件下终止反应，-20°C保存；(2)杂交反应将提取的植物样品DNA与核酸杂交膜条上的探针进行的杂交；(3)显色判断是否存在外源基因杂交反应完成后，生物素或地高辛标记过的植物样品DNA被固定于探针上，利用对应的生物素检测试剂盒或地高辛检测试剂盒完成显色反应，整个显色过程是在封闭的一次性微管中进行，显色反应时间为0. 5-6 h ；显色完成后，肉眼观察膜片上各方格是否形成均勻印迹，比对存在均勻印迹膜格的探针，可直接判断其对应的外源基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的步骤(2)的杂交反应的方法为(1)取5mg/mL的鲑鱼精DNA溶液，在95°C条件下水浴10 min后，迅速冰上冷却5 min,完成鲑鱼精DNA的变性；将变性的鲑鱼精DNA加入到杂交液中，使变性鲑鱼精DNA 杂交液浓度为50 Pg/mL，制备成杂交液I ；其中IOmL杂交液配方为20XSSC 5 mL ； IOOXDenhart' s 1 mL ；dd H2O 3 mL ； 10%SDS 1 mL ；(2)将核酸杂交膜条插入到封闭的一次性2mL离心管I中，然后向该管中加入1. 5 mL 杂交液I，并在69°C的金属浴中杂交4 h；(3)将生物素或者地高辛标记的样品DNA在100°C的热水浴中反应10min，然后迅速冰上冷却5 min;将变性后的样品DNA添加到杂交液I中，制备成杂交液II ；(4)将过程2)得到的膜条放入到封闭的一次性2mL离心管II中，并且添加1.5 mL的杂交液II，然后在69°C金属浴中杂交20 h；(5)杂交完成后，向离心管II中添加浓度为0.1%的SSC+SDS混合洗涤液，洗涤3次；洗涤条件为65°C条件下浸泡20 min。
全文摘要
本发明涉及一种检测外源基因的核酸杂交膜条及其应用，属于生物工程领域。本发明所述的膜条上的每一条特异性捕获探针有30-37个碱基，分别针对一种转入到植物中的外源基因，在探针的5′端加oligo(dt)n并用氨基标记。本发明系统检测植物外源基因包括以下步骤探针设计、探针合成、核酸杂交膜条制备、探针固定、样品NDA提取、样品NDA标记、杂交和显色。植物外源基因检测过程无放射性同位素，且杂交、显色和相应的洗涤步骤是在封闭的一次性微管中进行，检测结果可肉眼观察，检测过程方便、安全。本发明可用于植物种子、食品及其加工过程、观赏型植物繁殖体等植物种质资源和产品的外源基因检测。
文档编号C12Q1/68GK102191326SQ20111009603
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者何珣, 廖乾生, 田庆常, 陈集双 申请人:南京工业大学