专利名称：一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法
一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法技术领域
本发明属于生物油脂合成领域，具体地说，涉及一种通过在发酵过程中添加阴离子表面活性剂和/或其结构类似物，以提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法。
背景技术：
随着能源短缺与环境问题的日益突出，可再生清洁能源以及生物化工生产方式得到了越来越多的关注。其中，生物柴油作为一种新型能源，由于其可以代替传统柴油而无需改变现有的成熟的机械动力体系，受到了很多国家及地区的欢迎和重视。
生物柴油是通过将可再生油脂原料与短链醇进行转酯化反应得到的长链脂肪酸酯类物质。目前，全世界95%以上的生物柴油油脂原料来自于食用植物油，主要是棕榈油、 大豆油、菜籽油等。然而，随着生物柴油产业的不断增长，油料供给逐步成为限制其进一步发展的瓶颈。对于很多国家和地区来说，依赖于食用植物油脂资源的生产方式既不经济，也不利于食品安全；因此亟待开发更为廉价、可稳定供应的非粮油脂原料。
微生物油脂是从产油微生物中提取的油脂，又称单细胞油脂(Single cell oil), 其主要成分是甘油三酯。产油微生物在细菌、酵母、霉菌、藻类中都有分布，它们能够在一定的条件下利用并转化碳水化合物、甘油、木质纤维素水解液、二氧化碳等多种碳源，在菌体内积累大量油脂，并且大部分微生物油脂的脂肪酸组成与植物油脂接近，被证明可以经由转酯化反应制备生物柴油。与传统的植物油脂原料相比，微生物最突出的优势在于生长周期短，不需要占用耕地，可以利用多种碳源。因此，微生物油脂作为一种潜在的非粮油料，对于生物柴油产业具有重要的现实意义。
提高微生物油脂的生产效率，是进一步降低微生物油脂生产成本的关键。目前，微生物油脂的批式发酵周期多为5-7天，油脂含量达到细胞干重的20% -50%。虽然相比于植物生长周期大大缩短，但是仍然需要开发新的工艺，进一步提高生物量和油脂含量，从而降低生产成本，提高微生物油脂作为生物柴油油脂原料的经济可行性。发明内容
本发明的目的是提供一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的新方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法，其是在发酵过程中向培养基内添加0. 5 4g/L的阴离子表面活性剂和/或其结构类似物，培养产油微生物细胞。
前述的方法，其中所述阴离子表面活性剂为油酸盐、油酸酯、正辛酸盐、正辛酸酯、 1-辛基磺酸盐、木质素磺酸盐中的一种或多种。优选地，所述阴离子表面活性剂为油酸钠、 油酸甲酯、正辛酸钠、1-辛基磺酸钠、木质素磺酸钠中的一种或多种。
前述的方法，其中所述阴离子表面活性剂的结构类似物为与前述的阴离子表面活性剂结构类似但不属于典型的表面活性剂的化合物，例如中长链脂肪酸、极性脂肪和/或中长链脂肪酸酯等。
前述的方法，其中所述阴离子表面活性剂和/或其结构类似物的添加时机为发酵初始阶段(即在发酵培养基配制的同时)，或对数生长期的中期、后期，或在流加物料的同时进行；添加方式依据菌种、发酵方式及培养基配方而定，可以一次性、分步多次或流加添加。前述的方法，其中所述产油微生物细胞为胞内油脂含量可达到总生物量20%以上的产油微生物。前述的方法，其中所述产油微生物细胞为圆红冬孢酵母(lihodosporidiumtoruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、解脂耶式酵母(Yarrowia lipolytica)中的一种或多种。前述方法中，产油微生物细胞的培养方式为批式发酵、两阶段批式发酵、流加批式发酵或连续发酵。所述批式发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养，然后将活化后的菌种接种于营养条件适宜的发酵培养基中，使菌体快速增殖并积累大量油脂。所述两阶段批式发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养，然后将活化后的菌种接种于营养丰富的第一阶段发酵培养基中，使菌体快速大量增殖；最后在菌体生长达到对数期或对数期的中后期时，将菌体离心并重悬于营养条件适宜的第二阶段发酵培养基中，继而使菌体大量积累油脂。所述流加批式发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养；然后将活化后的菌种接种于营养条件适宜的发酵培养基使菌体增殖并积累油脂，并在此期间向培养基中一次性、分步多次或连续流加碳源及其他必要的营养成分，从而进一步促进油脂快速大量积累。所述连续发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养，然后将活化后的菌种接种于营养条件适宜的发酵培养基中培养一段时间，最后进入连续培养状态即以一定的稀释率补加新鲜发酵培养基，并以同样的速率排出发酵液，一段时间后培养进入稳态。本发明首次提出通过添加阴离子表面活性剂或其结构类似物进行产油微生物的培养，可以显著提高细胞生物量和油脂产量，从而有效提高微生物油脂的生产效率。而且，所得油脂脂肪酸组成与植物油类似，可以用于制备生物柴油。本发明的优点在于与不添加阴离子表面活性剂的培养条件相比，微生物细胞生长更快，油脂积累量更高，显著提高了微生物油脂的生产效率，从而增强微生物油脂用于生物柴油油脂原料的经济可行性。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指IOOml溶液中含有溶质的克数。实施例1按如下步骤进行
(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0.2%油酸钠、5%甘油、0.01%(NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 ·7Η20，0· 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养168h。同时以不添加0. 2%油酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量13.6g/L，油脂产量8. lg/L ；相比于未添加油酸钠的发酵培养基生物量提高38. 3 %，油脂产量提高52.8%。实施例2按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0.05%正辛酸钠、5%甘油、0.01%(NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 ·7Η20，0· 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养136h。同时以不添加0. 05%正辛酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量10. 4g/L，油脂产量4g/L ；相比于未添加0. 05%正辛酸钠的发酵培养基生物量提高12. 0%，油脂产量提高11. 3%。实施例3按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0.2% 1_辛基磺酸钠、5 %甘油、0. 01% (NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 · 7Η20，0· 04% KH2PO4 的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养13他。同时以不添加0. 2% 1-辛基磺酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量10. 7g/L，油脂产量5. lg/L ；相比于未添加0. 2%1-辛基磺酸钠的发酵培养基生物量提高15. 2%，油脂产量提高41. %。实施例4按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。
(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0.4%木质素磺酸钠、5%甘油、0. 01% (NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 · 7Η20，0· 04% KH2PO4 的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养15他。同时以不添加0. 4%木质素磺酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量13. 3g/L，油脂产量8. 6g/L ；相比于未添加0. 4%木质素磺酸钠的发酵培养基生物量提高52. 9 %，油脂产量提高72. 0%。实施例5按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0. 油酸甲酯、5%甘油、0.01%(NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 ·7Η20，0· 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养168h。同时以不添加0. 油酸甲酯的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量11. lg/L，油脂产量6. 2g/L ；相比于未添加0. 1%油酸甲酯的发酵培养基生物量提高14. 4%，油脂产量提高21. 6%。实施例6按如下步骤进行(1)种子培养将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)接入含有2. 0 %葡萄糖、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0.2%油酸钠、7.0%葡萄糖、0.01%(NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 ·7Η20，0· 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养168h。同时以不添加0. 2%油酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量14. 9g/L，油脂产量6. 5g/L ；相比于未添加油酸钠的发酵培养基生物量提高19. 5 %，油脂产量提高25. 4%。实施例7按如下步骤进行(1)种子培养将解脂耶式酵母(Yarrowia lipolytica)接入含有2. 0 %葡萄糖、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)发酵培养按10V/V%的接种量接入含有0.2%油酸钠、7.0%葡萄糖、0.01%(NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4 ·7Η20，0· 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养132h。同时以不添加0. 2%油酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量8. 2g/L，油脂产量1.6g/L;相比于未添加油酸钠的发酵培养基生物量提高20. 1 %，油脂产量提高27.0%。实施例8按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)第一阶段发酵培养按10v/v%的接种量接入含有1. 5%甘油、1. 0%酵母粉、1. 0%蛋白胨的培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养36h。(3)第二阶段发酵培养将第一阶段发酵结束后的发酵液离心获得菌体，然后重悬于含有0. 2%木质素磺酸钠、4%甘油、0. 01% (NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15%MgSO4 · 7H20,0. 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养11他。同时以不添加0. 2%木质素磺酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量14. 5g/L，油脂产量7. 2g/L ；相比于未添加木质素磺酸钠的发酵培养基生物量提高31. 8%，油脂产量提高63. 6%。实施例9按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)第一阶段发酵培养按10v/v%的接种量接入含有1. 5%甘油、1. 0%酵母粉、1. 0%蛋白胨的培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养36h。(3)第二阶段发酵培养将第一阶段发酵结束后的发酵液离心获得菌体，然后重悬于含有0. 05 %正辛酸钠、4 %甘油、0. 01 % (NH4)2SO4jO. 075 %酵母抽提物、0. 15 %MgSO4 · 7H20,0. 04% KH2PO4的培养基中进行批式发酵培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养11他。同时以不添加0. 05%正辛酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量14. 2g/L，油脂产量6. lg/L ；相比于未添加正辛酸钠的发酵培养基生物量提高29. 0%，油脂产量提高38. 6%。实施例10按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)流加发酵培养按10V/V%的接种量接入含有1.5%甘油、0.5%酵母粉、0. 25% (NH4)2SO4jO. 15% MgSO4 ·7Η20、0· 04% KH2PO4 的培养基中进行发酵培养。使用 5L 发酵罐，装液量4L，培养温度30°C，控制pH为6. 0 ；在此期间，每他取样测定发酵液中的残余甘油浓度，每当甘油浓度低于5g/L流加60g甘油(补加量按15g/L计)。其中，第一次补加甘油的同时补加8g木质素磺酸钠(补加量按发酵液总量的0.2%计)；以后每次流加碳源的同时按流加量的0.2%计木质素磺酸钠添加量，与碳源流加液同时进入发酵培养基。有氧培养180h。同时以不添加木质素磺酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，发酵液中生物量30. Og/L,油脂产量20. 8g/L ；相比于未添加木质素磺酸钠的发酵培养基生物量提高42. 0 %，油脂产量提高65.2%。实施例11按如下步骤进行(1)种子培养将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)接入含有1.5%甘油、1.0%酵母粉、1.0%蛋白胨的种子培养基中进行摇床培养。使用500mL三角瓶，装液量IOOmL,培养温度30°C，摇床转速200rpm，有氧培养^h。(2)连续发酵培养按10V/V%的接种量接入含有5%甘油、0.25% (NH4)2SO4,0. 25%酵母粉、0. 15% MgSO4 ·7Η20，0. 04% KH2PO4的培养基中进行发酵培养。使用5L发酵罐，装液量4L，培养温度30°C，控制pH为6. 0。培养3 后，以0. 02的稀释率补加新鲜的含有0. 4%木质素磺酸钠、5%甘油、0. 01% (NH4)2SO4^O. 075%酵母抽提物、0. 15% MgSO4. 7H20，0. 04% KH2PO4的培养基中进行连续发酵。进入稳态后维持连续发酵150h。同时以不添加0. 4%木质素磺酸钠的培养基作为对照。发酵结果菌体生长良好，生物量生长强度达到0. lg/L/h，油脂生产强度为0. 05g/L/h ；相比于未添加木质素磺酸钠的发酵培养基生物量提高20. 0%，油脂产量提高30. 2%。实施例12所述微生物油脂发酵同实施例1。将提取的微生物油脂进行脂肪酸组成分析，可知其中肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的含量分别为1.6%、27. 2%、2. 1%、12. 1%、44. 1%、11. 3%和1. 6%。将该微生物油脂采用脂肪酶(Novozyme 435)催化与甲醇进行转酯化反应制备生物柴油，脂肪酸甲酯(生物柴油)的得率大于90%。实施例13所述微生物油脂发酵同实施例4。将提取的微生物油脂进行脂肪酸组成分析，可知其中肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的含量分别为1.8^^27.4^^1.6^^11.9^^47.4%,7. 8%和1.6%。将该微生物油脂采用脂肪酶(Novozyme 435)催化与甲醇进行转酯化反应制备生物柴油，脂肪酸甲酯(生物柴油)的得率大于90%。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法，其特征在于，在发酵过程中向培养基内添加0. 5 4g/L的阴离子表面活性剂和/或其结构类似物，培养产油微生物细胞；其中，所述阴离子表面活性剂为油酸盐、油酸酯、正辛酸盐、正辛酸酯、1-辛基磺酸盐、 木质素磺酸盐中的一种或多种；阴离子表面活性剂的结构类似物为中长链脂肪酸、极性脂肪和/或中长链脂肪酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为油酸钠、油酸甲酯、正辛酸钠、1-辛基磺酸钠、木质素磺酸钠中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子表面活性剂和/或其结构类似物的添加时机为发酵初始阶段，或对数生长期的中期、后期，或在流加物料的同时进行；添加方式为一次性、分步多次或流加添加。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产油微生物细胞为胞内油脂含量占总生物量20%以上的产油微生物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述产油微生物细胞为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、解脂耶式酵母 (Yarrowia lipolytica)巾白勺一禾中$$禾中。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，产油微生物细胞的培养方式为批式发酵、两阶段批式发酵、流加批式发酵或连续发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述批式发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养，然后将活化后的菌种接种于营养条件适宜的发酵培养基中，使菌体快速增殖并积累大量油脂。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两阶段批式发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养，然后将活化后的菌种接种于营养丰富的第一阶段发酵培养基中，使菌体快速大量增殖；最后在菌体生长达到对数期或对数期的中后期时，将菌体离心并重悬于营养条件适宜的第二阶段发酵培养基中，继而使菌体大量积累油脂。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流加批式发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养；然后将活化后的菌种接种于营养条件适宜的发酵培养基使菌体增殖并积累油脂，并在此期间向培养基中一次性、分步多次或连续流加碳源及其他必要的营养成分，从而进一步促进油脂快速大量积累。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述连续发酵具体为将保存于固体培养基中的产油微生物菌种接入种子培养基中进行活化培养，然后将活化后的菌种接种于营养条件适宜的发酵培养基中培养一段时间，最后进入连续培养状态即以一定的稀释率补加新鲜发酵培养基，并以同样的速率排出发酵液，一段时间后培养进入稳态。
全文摘要
本发明提供一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法，其是在发酵过程中向培养基内添加0.5～4g/L的阴离子表面活性剂和/或其结构类似物，培养产油微生物细胞。发酵结束后可将所得油脂通过转酯化反应用于制备生物柴油。本发明的方法能有效促进产油微生物细胞生长和油脂积累，从而增强微生物油脂用于生物柴油油脂原料的经济可行性。
文档编号C12R1/645GK102559790SQ20121002660
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者刘德华, 徐静阳, 杜伟, 赵雪冰 申请人:清华大学