专利名称：A型猪流感病毒nasba-elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于动物卫生检验技术领域，涉及一种核苷酸及其应用，更具体的说是一种A型猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒。
背景技术：
猪流感(SwineInfluenza , SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus , SIV) 引起的一种急性、高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为特征。该病传播速度快，在各年龄和各品系的猪中，发病率高达100%，对于免疫系统不完善的仔猪致死率较高。此外猪流感还可引起母猪繁殖障碍、育肥猪增重减慢等，对养猪业所造成的危害和经济损失巨大。猪流感自1918年美国首次报道以来，已造成世界范围内的多次大流行，迄今已遍及欧、美、亚、非、澳洲等世界各地。猪流感病毒具有同时感染人和禽的能力，而且猪是对禽流感病毒和哺乳动物流感病毒均敏感的唯一动物，在流感病毒“禽-猪-人”的种间传播链中，充当了病毒重组及复制的“混合器”。2009年3月在墨西哥、美国等地暴发的A型流感病毒便是一种新型的变异病毒株，这种新型流感病毒包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。猪流感不仅给畜禽养殖造成重大经济损失，而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生意义。核酸序列依赖性扩增(nucleicacid sequence-based amplification,NASBA)是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。NASBA的简要过程如下=(I)RNA模板链进入反应混合物后，第一个引物首先与模板链的3’端结束。 (2 )反转录酶(AMV)，合成反义的补偿的DNA链。(3 ) RNaseH,分解破坏RNA模板链。(4 )第二个引物与DNA的5’端结合。(5) T7 RNA polymerase合成RNA补偿链，并加入到步骤I 中，使反应可以循环进行。NASBA-ELISA方法是将NASBA技术和ELISA (酶联免疫吸附剂测定)方法相结合， 其原理是将地高辛标记到检测探针上，通过探针捕获探针将地高辛标记的探针和NASBA产物的复合物吸附到微量反应板上，作用于底物硝基苯基磷酸盐显色，然后通过分析吸光度来检测RNA产物。由于捕获探针和检测探针的应用，使检测结果更为特异，而酶标仪的高通量性能使一次能够检测多个样品。猪流感病毒是负链RNA病毒，病毒基因组由8个分节段的RNA组成，其中核蛋白 (NP)基因相对保守，且该基因具有种群和型的特异性，因此核蛋白经常作为流感病毒型的分类和诊断的候选基因。本发明以猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，保障养猪业的健康、快速发展。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测A型猪流感病毒的特异性探针。本发明的另一个目的是提供一种检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA的试剂盒。 本发明的另一个目的是提供一种检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA试剂盒的制备
方法。 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案
一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性捕获探针和检测探针，其特征在于，所述的捕获探针序列如SEQ NO: I所示；具有如SEQ NO: 2所示的检测探针序列。本发明进一步公开了针对A型猪流感病毒的NASBA-ELISA试剂盒，它是由下述成分组成
I)引物和探针引物 NP-DET 2μ1 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 捕获探针NP-CP μ1 检测探针NP-DP μ1
所述捕获探针NP-CP，具有如SEQ NO: I所示的引物序列；所述检测探针NP-DP具有如 SEQ NO:2所示的引物序列。2) NASBA 扩增试剂
BA (缓冲液)40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT
4μ1
DA 10mM/L dNTP2μ1
NA 20mM/L NTP2μ1
MA (酶混合液):1 2UAMV,0. 2 O. 5URNaseH, 30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6Pllmg/m IBSA4μ1
SA DMS0 μ
3) NASBA产物检测试剂 96孔酶标板链酶亲和素包被的酶标板
杂交缓冲液20XSSPE ( pH7. 4),50mM/L Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA 43μ1 酶标抗体:碱性磷酸酶抗地高辛抗体ΙΟΟμΙ
显色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存。ΙΟΟμΙ
终止液:0. 5Μ Na2CO3 溶液。ΙΟΟμΙ
洗液PBST 溶液(含 0. 05%Tween-20，ρΗ7· 2，PBS )450μ1。本发明进一步公开了针对猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征是包括下述步骤
1)扩增反应体系3μ1待检样品 RNA、4P1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET ；
2)NASBA扩增过程65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1MA，41°C反应90min ； 4°C终止反应；
3)NASBA产物检测过程①在酶标孔中加入杂交缓冲液43μ1、捕获探针 μ 、检测探针 μ 和NASBA产物5μ1，震荡混匀，放入41 °C温箱中反应l 2h ；
②用每孔加入150μ1洗液，室温放置3 5min，弃去溶液，反复洗板3次；
③每孔加入酶标抗体ΙΟΟμΙ，室温孵育30min，洗板3次；
④显色每孔加入ΙΟΟμΙ显色液,室温避光显色IOmin；
⑤终止反应每孔加入100终止液，在酶标议上测定405nm的OD值。本发明更加详细的制备方法如下
I试剂组成
I. I引物
针对A型猪流感病毒的NP基因设计合成引物和探针，由宝生物工程(大连)有限公司合成，序列如下
NP-DET :5’ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3’2μ1
ΝΡ-Τ7 :5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT-3’2μ1
捕获探针 NP-CP:BIO- TAA GGA CCA GAA GG G μ
检测探针 NP-DP:DIG- GATGCTAGGTCGCATATGAG μ
I.2 NASBA扩增试剂
BA (缓冲液):40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT 购自 Promega 公司4μ1
DA 10mM/L dNTP，购自上海生物工程有限公司2μ1
NA :20mM/L ΝΤΡ，购自上海生物工程有限公司2μ1
MA (酶混 合液)1 2 U A M V , O . 2 O. 5URNaseH, 30 50U T 7 RNA 聚合 酶，2 6Pllmg/mlBSA 4μ1
SA DMS0,购自天津博美科生物工程有限公司 μ
1.3 NASBA产物检测试剂
96孔酶标板链酶亲和素包被的酶标板，购自上海生物工程有限公司杂交缓冲液20XSSPE ( ρΗ7· 4)，50mM Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA ；
购自上海生物工程有限公司43μ1
酶标抗体碱性磷酸酶抗地高辛抗体，购自天津博美科生物工程有限公司 ΙΟΟμΙ 显色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存，购自天津博美科生物工程有限公司ΙΟΟμΙ
终止液0. 5M/L Na2CO3溶液，购自天津博美科生物工程有限公司ΙΟΟμΙ
洗液=PBST溶液(含0. 05%Tween-20,pH7. 2，PBS)450μ1，购自天津博美科生物工程有限公司。2 NASBA检测过程
2.I扩增体系
取 3μ1 模板 Ι ΝΑ、4μ1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ_Τ7、2μ1 引物 NP-DET 加入扩增管。2. 2 NASBA 扩增程序在DNA扩增仪上65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1 MA，41°C反应90min ；4°C
终止反应。2.3 NASBA扩增产物的检测
2.3. I在酶标孔中加入杂交缓冲液43μ1、捕获探针 μ 、检测探针 μ 和NASBA产物 5μ1，震荡混匀，放入41°C温箱中反应I 2h。2. 3. 2用每孔加入150μ1洗液，室温放置3 5min，弃去溶液，反复洗板3次。2. 3. 3结合酶标抗体每孔加入酶标抗体ΙΟΟμΙ，室温孵育30min，洗板3次。2. 3. 4显色每孔加入ΙΟΟμΙ显色液，室温避光显色lOmin。2. 3. 5终止反应每孔加入ΙΟΟμΙ终止液，在酶标议上测定405nm的OD值。通过检测已知的16个猪流感阴性样品的OD值，根据公式阴阳性标准临界值= 阴性样品的平均OD值+3SD(标准差)
表I 16个阴性样品的OD值
16 yI、样品的OD值0.171 I 0.219O. 256 0.175O. 301 0.187O. 203 0.213O. 228 O. 2300.138 0.1890.176 & 0.192·...,
根据结果计算平均值为0. 20557，标准差为0. 040540,根据公式计算阴阳临界值为 0. 20557+3X0. 040540=0. 326。根据统计学原则，样本的OD4tl5值> 阴性样本OD4tl5均值(X) +3XSD时，可以在99. 9%的水平上判定为阳性。因此，当样品OD4tl5值大于0. 326时，结果判定为猪流感阳性；当样品OD4tl5值小于
0.326时，判定为猪流感阴性；当样品OD4tl5nm值等于0. 326时，判定为可疑，需重新检测。由上述的技术方案可见，本发明建立的检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA的试剂盒所具有的优点如下
(I)操作简便本试剂盒已将NASBA扩增和NASBA产物检测试剂进行了优化处理，普通实验人员即可掌握操作方法，易于推广。(2)检测灵敏度高该试剂盒的灵敏度比RT-PCR高10倍。(3)高通量由于使用了ELISA方法检测NASBA扩增产物，因此可以同时检测90份样品。(4)准确性高试剂盒NASBA扩增反应中使用了两条特异性引物，在NASBA产物检测时使用了一条捕获探针和一条检测探针，这些环节均确保了检测结果的准确性。
具体实施例方式
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪流感病毒NASBA-ELISA试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中RNA提取试剂Trizol购自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆转录酶、BSA购自 Promega公司；dNTP、NTP购自上海生物工程有限公司；链霉亲和素、pNPP购自天津博美科生物工程有限公司；碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体购自Roche公司。实施例I 试剂组成
权利要求
1.一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性捕获探针和检测探针，其特征在于，所述的捕获探针序列如SEQ NO: I所示；具有如SEQ NO: 2所示的检测探针序列。
2.一种针对A型猪流感病毒NP基因的NASBA-ELISA试剂盒，它是由下述成分组成1)引物和探针引物 NP-DET 2μ1 引物 ΝΡ-Τ7: 2μ1捕获探针NP-CP μ1 检测探针NP-DP μ1所述捕获探针NP-CP，具有如SEQ NO: I所示的引物序列；所述检测探针NP-DP具有如 SEQ NO:2所示的引物序列；2)NASBA扩增试剂BA (缓冲液)40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2,5mM/L DTT4μ1DA 10mM/L dNTP2μ1NA 20mM/L NTP2μ1MA (酶混合液)1 2UAMV，0.2 0.5U RNaseH，30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/ml B SA4μ1SA DMS0 μ 3)NASBA产物检测试剂96孔酶标板链酶亲和素包被的酶标板杂交缓冲液20XSSPE ( pH7. 4),50mM/L Tris-HCl ( ρΗ8· 8)，I % BSA 43μ1 酶标抗体碱性磷酸酶抗地高辛抗体ΙΟΟμΙ显色液3mg pNPP溶于ImLddH2O中，避光_20°C保存ΙΟΟμΙ终止液0. 5M Na2CO3 溶液ΙΟΟμΙ洗液PBST 溶液(含 O. 05%Tween-20，ρΗ7· 2，PBS )450μ1。
3.权利要求2所述针对猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征是包括下述步骤1)扩增反应体系3μ1待检样品 RNA、4P1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 SA、2Pl 引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET ；2)NASBA扩增过程65°C加热5min，41°C冷却5min，迅速加入4μ1MA，41°C反应90min ； 4°C终止反应；3)NASBA产物检测过程①在酶标孔中加入杂交缓冲液43μ1、捕获探针 μ 、检测探针 μ 和NASBA产物5μ1，震荡混匀，放入41 °C温箱中反应l 2h ；②用每孔加入150μ1洗液，室温放置3 5min，弃去溶液，反复洗板3次；③每孔加入酶标抗体ΙΟΟμΙ，室温孵育30min，洗板3次；④显色每孔加入ΙΟΟμΙ显色液,室温避光显色IOmin；⑤终止反应每孔加入ΙΟΟμΙ终止液，在酶标议上测定405nm的OD值。
4.权利要求2所述试剂盒在制备A型猪流感病毒临床样品检测方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种针对A型猪流感病毒NP基因的试剂盒，其组成包括一对扩增引物、捕获探针、检测探针、NASBA扩增试剂、NASBA产物检测试剂。本发明以A型猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于A型猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，保障养猪业的健康、快速发展。
文档编号C12N15/11GK102586488SQ201210069268
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者孙英峰, 张健, 张国伟, 张莉, 李秀丽, 池晶晶, 王东, 王荣升, 路超, 鄢明华, 韩伟 申请人:天津市畜牧兽医研究所