专利名称：一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。
背景技术：
快速准确地鉴定品种对于品种审定、假种鉴别和产权纠纷均有重要作用。然而，我国很多品种真伪的鉴定大多依靠田间表现鉴定，此法依赖于品种表现型差异，虽然鉴定方法直观简单，但是作物的表现型容易受到栽培措施和环境条件的影响。随着分子生物学技术的发展，从DNA水平上进行鉴定使得结果更客观、准确。目前，用SSR分子标记技术对品种进行鉴定的方法已经在各种作物中进行应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的引物组。本发明提供的引物组，由如下10个引物对组成I)由序列表中序列I所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对；2)由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成的引物对；3)由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成的引物对；4)由序列表中序列I所示的DNA分子和序列表中序列8所示的DNA分子组成的引物对；5)由序列表中序列9所示的DNA分子和序列表中序列10所示的DNA分子组成的引物对；6)由序列表中序列11所示的DNA分子和序列表中序列12所示的DNA分子组成的引物对；7)由序列表中序列13所示的DNA分子和序列表中序列14所示的DNA分子组成的引物对；8)由序列表中序列15所示的DNA分子和序列表中序列16所示的DNA分子组成的引物对；9)由序列表中序列17所示的DNA分子和序列表中序列18所示的DNA分子组成的引物对；10)由序列表中序列19所示的DNA分子和序列表中序列20所示的DNA分子组成的引物对。
上述的引物组中，所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉(Gossypium hirsutum)CGMCCNo.5262。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的PCR试剂组。本发明提供的PCR试剂组，由如下10个PCR试剂组成I)由上述的引物组中的I)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；2)由上述的引物组中的2)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；3)由上述的引物组中的3)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；4)由上述的引物组中的4)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；5)由上述的引物组中的5)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；6)由上述的引物组中的6)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成；7)由上述的引物组中的7)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；8)由上述的引物组中的8)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；9)由上述的引物组中的9)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶组成；10)由上述的引物组中的10)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成。上述各个PCR试剂中的每条引物在各自PCR试剂中的终浓度均为0. 5 ii M ;上述芽黄标记光敏不育系为陆地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂组。上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系中的应用也是本发明保护的范围。在上述应用中，所述芽黄标记光敏不育系具体为陆地棉(Gossypium hirsutum)CGMCCNo. 5262。本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。本发明提供的方法，包括分子鉴定的步骤；所述分子鉴定为用上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒中的10个引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测PCR扩增产物；若扩增产物为如下A-J全部所示，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若扩增产物不为如下A-J全部所示，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系；、
A :1)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp_160bp大小的片段；B 2)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp_185bp大小的片段；
C:3)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有155bp_165bp大小的片段；D:4)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有195bp_205bp大小的片段；E:5)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有255bp_265bp大小的片段；F:6)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp_175bp大小的片段；G:7)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp_175bp大小的片段；H:8)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp_185bp大小的片段；1:9)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp_160bp大小的片段；J:10)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp_175bp大小的片段和175bp-185bp大小的片段。上述方法还包括光敏不育表型鉴定的步骤；·所述光敏不育表型鉴定包括先进行如下A和B处理，再进行检测A为将所述待测样本在每天光照11小时-12小时20分的条件下进行培育，B为将所述待测样本在每天光照13小时-14小时40分的条件下进行培育，若检测结果为所述待测样本在经A处理后得到雄性可育表型植株，且经B处理后得到雄性不育表型植株，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若所述待测样本在经A处理后未得到雄性可育表型植株，且经B处理后未得到雄性不育表型植株，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系。上述检测为观察。上述光敏不育表型鉴定中的A处理中，所述每天光照为11小时2分-12小时18分；上述光敏不育表型鉴定中的B处理中，所述每天光照为13小时-14小时35分。上述分子鉴定中的PCR扩增的模板均为待测样本的基因组DNA ；所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。上述方法还包括形态鉴定的步骤所述形态鉴定为培育所述待测样本，若所述待测样本为芽黄性状，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若所述待测样本不为芽黄性状，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系。芽黄性状指的是种子萌发后顶叶较野生型表现淡黄色(叶绿素含量低)，至倒五叶时恢复正常。 上述野生型为中040029。陆地棉(Gossypium hirsutum)芽黄标记光敏雄性不育系已于2011年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 5262。陆地棉(Gossypium hirsutum)CGMCC No. 5262简称芽黄标记光敏雄性不育系(又称中9106)。本发明的实验证明，本发明筛选出10个引物对，用其进行PCR扩增，这10个引物对特异性高，可以根据10个引物对的扩增产物大小来鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系，再结合待测样本的表型特征，从而实现芽黄标记光敏不育系的鉴定。本发明具体采用了形态学鉴定和SSR分子标记鉴定相结合的方法对光敏核不育系中9106进行鉴定和保护，主要包括光敏核不育系中9106的芽黄标记特点；光敏核不育系中9106育性随光照周期的变化特性；同时以8个棉花品系为对照，通过SSR分子标记技术，寻找到10引物组合，其中每对引物在光敏核不育系中9106中相对其他8个棉花品系均具有特异条带。
图I为真叶期芽黄材料中9106与正常材料中040029叶绿素含量；图2为芽黄材料中9106不育表型；图3为芽黄材料中9106光敏可育表型；
图4为筛选的10对特异引物的PCR扩增结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。芽黄性状指的是种子萌发后顶叶较野生型表现淡黄色(叶绿素含量低)，至倒五叶时恢复正常。中040029 :棉花航天诱变敏感材料的筛选及多态性分析，棉花学报，22 (4)312-318，2010 ;公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。实施例I、鉴定芽黄标记光敏不育系陆地棉(Gossypium hirsutum)芽黄标记光敏雄性不育系已于2011年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 5262。陆地棉(Gossypium hirsutum)CGMCC No. 5262简称芽黄标记光敏雄性不育系(又称中9106)。一、芽黄标记光敏不育系中9106的形态特征鉴定I、芽黄表型将陆地棉(Gossypiumhirsutum)CGMCC No. 5262 (中 9106)种子于 2007 年 4 月下旬种植于河南安阳。以中040029 (野生型)为对照。观察结果，与对照相比，中9106子叶期苗期开始表现芽黄，至真叶期顶叶表现芽黄，相对于对照呈淡黄色。随植株生长叶片的叶绿素含量逐渐增多，至倒五叶叶绿素含量与野生型植株相近。用APAD-502 Plus叶绿素测定仪测得的芽黄材料中9106和中040029 (野生型)的倒五叶、倒四叶、倒三叶、倒二叶、倒一叶、顶叶的叶绿素含量，结果如图I所示，可以看出，芽黄材料中9106的叶绿素含量均低于中040029 (野生型)，顶叶的叶绿素含量较野生型材料低10个点左右，且至倒五叶期恢复正常。2、光敏雄性不育表型I)、在河南安阳培育河南处于东经110° 2T 116° 39;，北纬31° 23' 36° 22'之间。安阳处于东经113° 37'至114° 58'、北纬35° 12'至36° 22'之间。将85粒芽黄标记光敏雄性不育系中9106 (种子)于2010年4月种植于河南安阳，萌发得到85株幼苗，均具有芽黄性状，继续培养幼苗，直至8月份结束所有植株均没有花粉粒产生(见图2)，表现为不育。从棉花的生长周期来看，对于4月种植的棉花而言，自7月份开始环境中的温度变化和光照周期与花粉发育相关，所以对7月份和8月份的温度和光照周期进行记录。自7月I日至8月31日河南安阳的光照时间变化区间为13小时至14小时35分。自7月I日至8月31日河南安阳的温度变化见表I。表I 7月I日至8月31日河南安阳的温度变化
权利要求
1.一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的引物组，由如下10个引物对组成 1)由序列表中序列I所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对； 2)由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成的引物对； 3)由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成的引物对； 4)由序列表中序列7所示的DNA分子和序列表中序列8所示的DNA分子组成的引物对； 5)由序列表中序列9所示的DNA分子和序列表中序列10所示的DNA分子组成的引物对； 6)由序列表中序列11所示的DNA分子和序列表中序列12所示的DNA分子组成的引物对； 7)由序列表中序列13所示的DNA分子和序列表中序列14所示的DNA分子组成的引物对； 8)由序列表中序列15所示的DNA分子和序列表中序列16所示的DNA分子组成的引物对； 9)由序列表中序列17所示的DNA分子和序列表中序列18所示的DNA分子组成的引物对； 10)由序列表中序列19所示的DNA分子和序列表中序列20所示的DNA分子组成的引物对。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
3.一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的PCR试剂组，由如下10个PCR试剂组成 1)由权利要求I或2所述的引物组中的I)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 2)由权利要求I或2所述的引物组中的2)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 3)由权利要求I或2所述的引物组中的3)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 4)由权利要求I或2所述的引物组中的4)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 5)由权利要求I或2所述的引物组中的5)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 6)由权利要求I或2所述的引物组中的6)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 7)由权利要求I或2所述的引物组中的7)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 8)由权利要求I或2所述的引物组中的8)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 9)由权利要求I或2所述的引物组中的9)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成； 10)由权利要求I或2所述的引物组中的10)所示的引物对、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶组成。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂组，其特征在于各个PCR试剂中的各条引物在各自PCR试剂中的终浓度均为0. 5 ii M ; 所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
5.一种用于鉴定芽黄标记光敏不育系的试剂盒，包括权利要求I或2所述的引物组或权利要求3或4所述的PCR试剂组。
6.权利要求I或2所述的引物组或权利要求3或4所述的PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系中的应用；所述芽黄标记光敏不育系具体为陆地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
7.一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法，包括分子鉴定的步骤； 所述分子鉴定为用权利要求I或2所述的引物组或权利要求3或4所述的PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒中的10个弓I物对分别对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测PCR扩增产物； 若扩增产物为如下A-J全部所示，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若扩增产物不为如下A-J全部所示，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系; A :1)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp-160bp大小的片段； B 2)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp-185bp大小的片段； C 3)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有155bp-165bp大小的片段； D:4)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有195bp-205bp大小的片段； E:5)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有255bp-265bp大小的片段； F:6)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段； G:7)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段； H:8)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有175bp-185bp大小的片段； 1:9)所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有150bp-160bp大小的片段； J: 10 )所示的引物对扩增得到的PCR扩增产物具有165bp-175bp大小的片段和175bp-185bp大小的片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包括光敏不育表型鉴定的步骤； 所述光敏不育表型鉴定包括先进行如下A和B处理，再进行检测 A为将所述待测样本在每天光照11小时-12小时20分的条件下进行培育， B为将所述待测样本在每天光照13小时-14小时40分的条件下进行培育， 若检测结果为所述待测样本在经A处理后得到雄性可育表型植株，且经B处理后得到雄性不育表型植株，则所述待测样本为或候选为芽黄标记光敏不育系；若所述待测样本在经A处理后未得到雄性可育表型植株，且经B处理后未得到雄性不育表型植株，则所述待测样本不为或候选不为芽黄标记光敏不育系。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于 所述光敏不育表型鉴定中的A处理中，所述每天光照为11小时2分-12小时18分； 所述光敏不育表型鉴定中的B处理中，所述每天光照为13小时-14小时35分。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于 所述分子鉴定中的PCR扩增的模板均为待测样本的基因组DNA ； 所述芽黄标记光敏不育系为陆地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。本发明提供了用于鉴定芽黄标记光敏不育系的引物组、PCR试剂组和试剂盒，还提供了鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系的方法。本发明的实验证明，本发明筛选出10个引物对，用其进行PCR扩增，这10个引物对特异性高，可以根据10个引物对的扩增产物大小来鉴定或辅助鉴定芽黄标记光敏不育系，再结合待测样本的表型特征，从而实现芽黄标记光敏不育系的鉴定。
文档编号C12N15/11GK102676679SQ20121015823
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者刘计, 喻树迅, 宋美珍, 庞朝友, 范术丽, 马建辉, 魏恒玲 申请人:中国农业科学院棉花研究所