一种高吸附镉的丝状真菌毛霉xlc及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高吸附镉的丝状真菌毛霉及制备方法和应用，其步骤：称取重金属镉含量为50mg·Kg-1的用于重金属修复的盆栽试验土样于加有玻璃珠的无菌水中，恒温摇床振荡、静置后，取上清进行稀释；将不同稀释倍数的稀释液涂布在含有镉的马丁固体培养基上，倒置于恒温培养箱中培养。将培养基上生长的微生物进行划线分离纯化，并进行复筛验证，经分离筛选后，得到对镉具有稳定抗性能力的丝状真菌毛霉XLC菌株，在PDA斜面上保存备用。该菌株保藏编号为CCTCCNO：M2012136。该菌株的活性菌体吸附镉的能力高于死菌体,在电镀污水处理中具有对镉的高效移除能力，在实际应用中能修复水体及土壤中的镉污染。
【专利说明】一种高吸附镉的丝状真菌毛霉XLC及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于水体环境治理领域，具体涉及一种高吸附镉的丝状真菌毛霉，同时还涉及一种高吸附镉的丝状真菌毛霉的制备方法，还涉及一种高吸附镉的丝状真菌毛霉在重金属镉污染水体及土壤的生物修复中的应用。
【背景技术】
[0002]土壤与水源都是自然环境的重要组成，也是人类赖以生存的资源，随着人类活动的加剧，越来越多的重金属污染物通过大气沉降、污水灌溉、固体废弃物排放以及农药和化肥的施用等途径进入土壤和水体(李天杰，1995)。有害重金属积累到一定程度就会对生态系统产生毒害，并可以通过直接接触、食物链等途径危害人类的健康(陈晶中等，2003)。重金属作为一类危害很大的污染物，具有移动性小，周期长，易积累，毒性大等特点，目前，受到了广泛关注。
[0003]镉是一种稀有分散金属，在自然界中背景值低，相对其它重金属，镉的生物有效性更高，也更容易被生物利用积累(熊愈辉，2007)。镉金属因其毒性高、污染面积最大，是最重要、危害最大的重金属污染物之一，具有长期性、隐蔽性和不可逆性，不仅会直接影响植物的生长发育还会影响土壤和水体的生态结构，降低植物产量和品质，然后通过食物链危及动物和人类(Kramer，Clemens，2005)。镉在人类生活中应用范围很广，工业上主要用于电镀、着色剂、抗腐剂和抗摩擦剂、塑料稳定剂、光敏元件和电池生产等行业(Lin etal.，2002);农业生产上，镉化合物有时会被添加到杀虫剂和杀菌剂中，造成对植物和土壤的污染，继而通过自然界物质循环污染水体环境。因此寻找一种能够有效治理镉污染的方法是当前一个重要的课题(Basta et al.，2001)。
[0004]对于重金属污染，传统的方法有工程治理措施、物理化学修复、化学修复措施，包括离子交换法、吸附法、 电化学处理法、萃取法和膜分离法等(Wang，Wang, 2009)，但是从实践角度发现，工程治理措施在花费大量人力金钱的情况仍然只是治标不治本；物理化学修复方法只适合小范围的污染修复(David et al.，1995);化学修复的作用经过证实具有比较好的作用，通过对重金属的吸附作用、氧化还原作用、拮抗或沉淀作用产生影响最终降低重金属污染，并且是现在治理污染应用较多的方法(Naidu et al.，1997)。但是实践表明，虽然上述的的一些修复方法能够在一定程度上减少重金属在环境中的生物有效性，但是都有各自的缺陷和局限性，并且在重金属浓度较低(<100mg.L-1)的环境中很难发挥作用，花费巨大，效果不佳，很难推广应用。
[0005]近年来，重金属污染的生物修复技术正在兴起，利用特定的生物(植物、微生物或原生动物)吸收、转化、清除或降解环境污染物，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施(温志良等，1999)。生物吸附重金属是一个新环境友好的、不引入二次污染的污染处理技术，主要优点是能够高效处理低浓度的重金属废水，而且生物吸附剂的来源非常广泛，有良好的经济效益(David, Volesky, 1998)。真菌在重金属净化应用中表现出的优势在于大规模工业发酵中常常可以获得大量廉价的真菌菌体，并且通常这些菌体是需要被废弃的副产物，真正可以做到废物的环保利用。真菌菌丝粗大、富集量大、易于与液体分离收集更利于稀有重金属的回收。酿酒酵母、黑根霉、产黄青霉、金霉素链霉菌等一些工业生产应用的菌株都已经被证实具有很强的重金属富集能力(Waihung et al., 1999;Liu et al.，2001)。一般认为真菌分离溶液中的重金属离子主要有三种过程:胞外富集与沉积、细胞表面吸附以及胞内富集(Ledin，2005)，根据依赖代谢能量情况又分为主动吸附和被动吸附，一般被动吸附是真菌对重金属吸附的主要作用(Ayla, Dursun, 2003)。
[0006]随着科技的快速发展，重金属污染问题正困扰着人们的生活，给人们的健康带来潜在威胁，科学研究者正试图寻找一些高效的修复方法来解决这个问题。生物修复技术由于其特殊的优越性受到重视，而其中微生物修复又因其有痕量性、快速性以及再生性受到关注。本发明利用微生物对重金属污染具有耐受性，从镉污染的土壤中分离得到一株具有高浓度镉抗性的丝状真菌，进一步探究其对重金属镉吸附的能力，从解吸附能力、化学预处理方法对菌体吸附影响以及不同活性状态菌体对镉吸附能力影响的角度来探究本发明作为重金属修复材料的可行性。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是在于提供了一种高吸附镉的丝状真菌毛霉XLC (Mucoromycltesp.XLC)，保藏编号:CCTCC NO:M2012136。本发明所提供的丝状真菌毛霉XLC经实验验证对多种重金属均具有较高耐受性，可以在实际应用中高效去除污染水体中的镉。
[0008]本发明的另一 个目的是在于提供了一种高吸附镉的丝状真菌毛霉XLC的制备方法，该方法能够较快获得单一的纯菌株，获得的丝状真菌具有稳定的重金属抗性并且具有较高的镉吸附能力，该方法更具有经济高效、操作简单易行的优点。
[0009]本发明的再一个目的是在于提供了一种高吸附镉的丝状真菌毛霉XLC在重金属镉污染水体及土壤的生物修复中的应用，吸附实验结果显示毛霉XLC冻干菌体可以在实验室条件下显著吸附重金属镉，具有修复镉污染土壤和水体的能力，并且发现活菌比死菌对镉具有更高的吸附能力，电镀废水中重金属移除实验结果证明，丝状真菌毛霉XLC可以在实际应用中高效去除污染水体中的镉。
[0010]为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施:
[0011]一种高吸附镉的丝状真菌毛霉XLC的制备方法，其步骤是:
[0012]A、称取重金属镉含量为50mg *Kg 1的用于重金属修复的盆栽试验土样IOg于90ml带有5个0.5mm玻璃珠的无菌水中，28°C恒温摇床150r.mirT1振荡15min,静置Imin后，取上清进行10倍系列稀释。
[0013]B、将100 μ L不同稀释倍数的稀释液涂布在含有60mM镉的马丁固体培养基上，静止片刻，倒置于28°C恒温培养箱中培养5d。
[0014]C、将培养基上生长的微生物进行划线分离纯化，并进行复筛验证，经10次分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存，备用。
[0015] 申请人:将分离获得的丝状真菌命名为XLC，经形态学特征观察和分子生物鉴定，确认该菌为毛霉(Mucoromyclte sp.)。该菌株于2012年4月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏号:CCTCC NO:M2012136，分类命名:毛霉 XLC Mucoromyclte sp.XLC。[0016]菌株的生物学和形态学鉴定
[0017]①.生物学特征:丝状真菌，专性需氧，最适生长温度20°C-28°C，在PDA培养基中产孢量大，菌落较为疏松，呈绒毛状，菌落与孢子呈白色。
[0018]②.培养条件:
[0019]分离筛选所用培养基为马丁培养基:葡萄糖IOg.ΙΛ蛋白胨5.0L-1,MgSO40.5g.I71,自然 pH, 121°C高压蒸汽灭菌 30min ；
[0020]保存活化以及收集该菌孢子所用培养基为PDA培养基:土豆200.0g.L_\葡萄糖20.0g.L'1%琼脂，自然pH, 121°C高压蒸汽灭菌30min ；
[0021]毛霉XLC制备吸附剂时所用的培养基为矿物盐培养基(丽培养基):葡萄糖20.0g.L-1，(NH4) 2S045.0g.L-1KH2PO415.0g.L' MgSO40.6g.L' CaCl20.6g.I71，FeSO4.7Η205.0mg.L1, CoC122.0mg.L1,调节 pH 至 5.5 后 115°C高压蒸汽灭菌 15min。
[0022]培养该菌可以以孢子的形式进行接种:以2%体积比的吐温-80冲洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%体积比吐温-80稀释至需要的孢子浓度后接种，28°C，150r.mirT1恒温培养。一种高吸附镉的丝状真菌毛霉在重金属镉污染水体及土壤的生物修复中的应用，其应用过程是:
[0023]I)丝状真菌毛霉XLC对多种重金属耐受性水平检测:
[0024]接种孢子至丽液体培养基，摇床培养至菌丝球刚好形成。将含有设定浓度重金属的矿物盐固体平板划分三等分区域，分别在每一区域以点种法接种直径相同的菌丝球，28°C培养7天。每24小时记录一次菌丝球直径，分析不同浓度平板上随着时间变化菌落大小变化趋势。使菌落直径基本无变化的重金属浓度即为该菌的最低抑菌浓度。
[0025]2)丝状真菌毛霉XLC对镉吸附能力实验:
[0026]①.静态镉的吸附:
[0027]制备孢子悬液，接种到矿物盐液体培养基中培养，过滤收集菌体，进行真空冷冻干燥处理后，将菌体打散至松散状态，然后进行吸附镉的实验。
[0028]冻干菌体加入到含有镉溶液的离心管中，置于28°C恒温摇床中、150r.mirT1反应240min，反应过程中分别在0、5、15、30、45、60、120、180和240min取上清，然后用石墨炉原子吸收分光光度计(F-240，VARIAN)测定吸附前后上清液中镉的含量。
[0029]②.吸附-解吸附实验:
[0030]用冻干处理后的菌体进行镉的吸附实验，具体吸附实验条件:镉溶液浓度为500mg.L' pH 4.0、0.1g.l-1冻干菌体充分吸附4h，吸附饱和后上清取样，用石墨炉原子吸收分光光度计测定吸附前后上清液中镉的含量，计算吸附到菌体表面的镉含量。过滤收集吸附后菌体并进行冷冻干燥。分别选取去离子水、硝酸、盐酸、EDTA、氢氧化钠作为解吸附剂，确定最适解吸附剂。
[0031]③.菌的活性状态对镉的吸附的影响:
[0032]将毛霉XLC在PDA培养基活化4天后产生的孢子收集制成悬液，然后接种到新鲜矿物盐培养基中培养5d，过滤收集菌体。活菌收集后尽量除去水分,取一小部分80°C烘干至恒重测得菌体含水量。
[0033]死菌收集后进行冷冻干燥一高压蒸汽灭菌一冷冻干燥一研磨过筛处理制成死菌粉末，两种状态的菌对镉进行吸附实验，实验在含有镉溶液的离心管中进行，吸附体系设定:活菌投加的镉溶液ρΗ5.0、镉浓度300mg七1、投加活菌0.5g.L-1 (干重)、吸附120min ；死菌投加的镉溶液PH5.0、镉浓度300mg 吸附45min、投加死菌0.Sg-T10完成饱和吸附实验后，测得两种状态菌的吸附能力。
[0034]将吸附饱和的菌体回收，金属洗脱液去除结合在菌表面的镉后进行酸消化处理，用石墨炉原子吸收分光光度计测定菌体中镉的含量。
[0035]3)丝状真菌毛霉XLC对电镀废水中重金属的移除实验:
[0036]发明人分别进行了毛霉XLC活菌与死菌对采集的电镀废水中镉去除能力的实验:将毛霉XLC在PDA培养基活化4天后产生的孢子收集制成悬液，然后按1%的体积比接种到200毫升的新鲜矿物盐液体培养基中培养5d，过滤收集菌体(培养收集活性状态菌体的三角瓶为底部带棱的三角瓶，培养收集死菌的三角瓶为普通三角瓶)。活菌收集后尽量除去水分，取一小部分80°C烘干至恒重测得菌体含水量，死菌收集后进行冷冻干燥一高压蒸汽灭菌一冷冻干燥一研磨过筛处理制成死菌粉末，两种菌体均用于移除电镀废水中的镉离子。
[0037]毛霉XLC对电镀废水中镉的实际移除实验体系为:20mL电镀废水(Cd2+: 0.13mg.L-1)、干重0.0lg. 菌体、28°C和150r.mirT1处理2h后过滤收集上清液，按照前述方法测定吸附前后镉的含量，计算获得的镉移除率。另外发明人再次利用毛霉XLC活菌和死菌处理絮凝剂处理过后的污水，以了解毛霉XLC在低浓度重金属污染废水中去除镉的能力。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0038]1.丝状真菌毛霉XLC菌体易培养获得，不同生物活性状态菌体均具有较高吸附重金属能力，材料成本低廉；
[0039]2.利用丝状真菌毛霉XLC的冻干菌体作为生物吸附剂，不仅可以高效吸附污染水源中的重金属离子，同时还具备良好的吸附剂再生能力，具备商业化应用的潜能，解吸附效果好有利于回收贵金属，实际应用价值高；
[0040]3.丝状真菌毛霉XLC在电镀废水中表现出了低浓度镉(0.13mg.L-1)的高效移除能力，而传统重金属污染废水处理技术在低浓度重金属污染水体中无法发挥有效作用，因此丝状真菌毛霉XLC具有良好的实际应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为一种丝状真菌毛霉XLC冻干菌体的静态镉吸附量测定结果示意图。
[0042]图2为一种丝状真菌毛霉XLC对铺的解吸附剂的选择不意图。
[0043]图3为一种丝状真菌毛霉XLC对镉的解吸附动力学结果示意图。
[0044]实验采用最佳解吸附剂0.1mol.L-1盐酸。
[0045]图4为一种丝状真菌毛霉XLC活菌与死菌对电镀废水以及絮凝作用后废水中镉移除结果不意图。
具体实施方案
[0046]以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考分子克隆手册(参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)所描述的内容。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0047]实施例1:
[0048]一种高吸附镉的丝状真菌毛霉XLC的制备方法，其步骤是:
[0049]A、称取重金属镉含量为50mg *Kg 1的用于重金属修复的盆栽试验土样IOg于90ml带有5个0.5mm玻璃珠的无菌水中，28°C恒温摇床150r.mirT1振荡15min,静置Imin后，取上清进行10倍系列稀释。
[0050]B、将100 μ L不同稀释倍数的稀释液涂布在含有60mM镉的马丁固体培养基上，静止片刻，倒置于28°C恒温培养箱中培养5d。
[0051]C、将培养基上生长的微生物进行划线分离纯化，并进行复筛验证，经10次分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存，备用。
[0052] 申请人:将分离获得的丝状真菌命名为XLC，经形态学特征观察和分子生物鉴定，确认该菌为毛霉(Mucoromyclte sp.)。该菌株于2012年4月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为:CCTCC NO:M2012136。
[0053]菌株的生物学和形态学鉴定
[0054]①.生物学特征:丝状真菌，专性需氧，最适生长温度20°C~28°C，在PDA培养基中产孢量大，菌落较为疏松，呈绒毛状，菌落与孢子呈白色。
[0055]②.培养条件:
[0056]分离筛选所用培养基为马丁培养基:葡萄糖IOg.ΙΛ蛋白胨5.(.?ΛMgSO40.5g.I71,自然 pH, 121°C高压蒸汽灭菌 30min ；
[0057]保存活化以及收集该菌孢子所用培养基为PDA培养基:土豆200.0g.L_\葡萄糖20.0g.L'1%琼脂，自然pH, 121°C高压蒸汽灭菌30min ；
[0058]毛霉XLC制备吸附剂时所用的培养基为矿物盐培养基:葡萄糖20.0g.L_S(NH4) 2S045.0g.I/1, ΚΗ2Ρ0415.0g.I/1, MgSO40.6g.I/1, CaCl20.6g.I/1, FeSO4.7H205.0mg.L1, CoC122.0mg.L1,调节 pH 至 5.5 后 115°C高压蒸汽灭菌 15min。
[0059]培养该菌可以以孢子的形式进行接种:以2%体积比的吐温-80冲洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%体积比吐温-80稀释至需要的孢子浓度后接种，28°C，150r.mirT1恒温培养。
[0060]菌株的分子生物学鉴定
[0061]CTAB法抽提丝状真菌毛霉XLC的总DNA，检测后以此为模板，利用ITS1-1TS4引物进行此菌株的ITS保守序列16SrDNA的PCR扩增，用于菌株的分子学鉴定。结合形态学特征观察和分子生物鉴定结果确认该菌为毛霉(Mucoromycote sp.)。
[0062]实施例2:
[0063]一种高吸附镉的丝状真菌毛霉在重金属镉污染水体及土壤的生物修复中的应用，其步骤是:
[0064]A、丝状真菌毛霉XLC对多种重金属耐受性水平检测
[0065]液体培养条件:接种前向培养基添加一定量过滤灭菌的重金属母液至设定浓度，按1%体积比接种量接种毛霉XLC孢子悬液，培养7d，观察菌株生长状况。
[0066]矿物盐固体培养条件:接种孢子至矿物盐液体培养基，摇床培养至菌丝球刚好形成。将含有设定浓度重金属的矿物盐固体平板划分三等分区域，分别在每一区域以点种法接种直径相同的菌丝球，28°C培养7天。每24小时记录一次菌丝球直径，分析不同浓度平板上随着时间变化菌落大小变化趋势。使菌落直径基本无变化的重金属浓度即为该菌的最低抑菌浓度。
[0067]表I为毛霉XLC对不同重金属离子的耐受性检测结果，矿物盐液体培养基培养条件下不同重金属对毛霉XLC的最低抑菌浓度分别为:镉(Cd2+)120mM、钴(Co2+)4mM、铜(Cu2+)130mM、锌(Zn2+) 120mM、铬(Cr3+) 85mM、铬(Cr6+) ImM、镍(Ni2+) 22mM ;矿物盐固体培养基培养条件下则分别为:lOOmM、15mM、40mM、140mM、60mM、ImM、18mM。本实验证实了本发明所提供的毛霉XLC对多种重金属的毒害具有较强耐受性。
[0068]
【权利要求】
1.一种丝状真菌毛霉，其特征在于:毛霉XLC (.Mucoromyclte sp.XLC)，CCTCC NO:M2012136。
2.权利要求1所述的一种丝状真菌毛霉XLC在重金属镉污染水体的生物修复中的应用。
3.权利要求1所述 的一种丝状真菌毛霉XLC在重金属镉污染土壤的生物修复中的应用。
【文档编号】C12R1/645GK103451104SQ201210180801
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年6月4日 优先权日:2012年6月4日
【发明者】陈雯莉, 黄巧云, 朱伟, 夏璐, 徐兴健, 张哲轶 申请人:华中农业大学