专利名称：小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达的制作方法
小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。
背景技术：
羧酸酯酶(Carboxylesterase, EC 3. I. I. I)属于B-酯酶,能够催化水解含羧酸酯基的脂肪族和芳烃类有机化合物。羧酸酯酶在生物界分布极广，从古细菌和真细菌、至真核微生物、昆虫乃至哺乳动物的各种组织均有活性较高的羧酸酯酶，尤其肝脏中的酶活性最高。羧酸酯酶可以催化酯水解、酯合成、酯交换等具有重要应用价值的反应，由于羧酸酯酶在食品、染料、皮革、纸张等工业中有多样的应用，因此羧酸酯酶在生物技术领域扮演着极其重要的角色。此外还被应用于制药、染料、杀虫剂和杀菌剂等工农业废水中含羧酸酯基类毒性污染物的降解。
目前已经从人、微生物及昆虫中克隆到羧酸酯酶基因，其中从无色杆菌 (Achromobacter pichaudii)得到259aa的酶,其最高酶活为O. 7U/ml ;从嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geabacillusstearotheromphilus)得到 29KDa 的酶，其最高酶活为 700U/ml ;从嗜热圆锥网团菌(Dictyoglomus turgidum)得到45KDa的酶,其最高酶活为80U/mg ;从棉铃虫(Helicoverpa armigera)得到IOOKDa的酶，其最高酶活为O. 32mmol/100ul ;从抗性蚊虫(Culex quinquefasciatus)得到60KDa的酶，其最高酶活为135U/mg。此外从斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、铅青链霉菌(Deduc Streptomyces lividans)、野山香(Bombyx momdarina M)、铜绿妮(Lucilia cuprina)、稻褐飞風(Nilaparvata lugens)、大鼠(rat)以及人胎脑等来源均克隆得到相应的羧酸酯酶。
然而，至今从小鼠肝脏中克隆获得的羧酸酯酶报道很少，国外对其的研究应用还很少(13篇研究论文，NCBI PUBMID数据库检索)，国内至今未见研究报道。发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，它运用基因克隆技术，成功克隆到小鼠肝脏羧酸酯酶(Mceslf )基因，与表达载体PET_32a连接后在大肠杆菌 BL21中进行了该基因的高效表达。而小鼠肝脏羧酸酯酶(Mceslf)基因对呋喃丹、西维因、 甲基对硫磷、联苯菊酯等农药有降解作用。
本发明的表达是I.以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoR I和Xho I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector NTI对所测定序列与对应的NCBI 序列(GenBank BC013479. I)进行比对分析，确定该基因为Mceslf。
—pt EcoR I起始密码子 GMHEATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTtK^2.通过EcoR I 和 Xho I 进行双酶切(double digestion),使 Mceslf 基因经 T4 DNA 连接酶(T4 DNA Iigase)作用连接在大肠杆菌高效表达载体PET-32a的EcoR I和Xho I 酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mceslf，转化表达宿主菌BL21 (DE3) (Studier F ff, et al. J. Mol. Biol. 1986, 189:113),进行IPTG诱导表达。研究发现此酶是由535个氨基酸残基组成的(如下所示)，由于选PET-32a作为表达载体，SDS-PAGE显示分子量为76. 9KD，跟预期一样。
MFLSTLFLVSLATCVICGNPSSPPVVDTAHGKVLGKHVNVEGFSQPVAVFLGIPFAKPPLGSLRFAPPQ PAEPWSSVKNATTYPPMCSQDAARGQAVNDLITNRKEKIHLEFSEDCLYLNIYTPADFSKNSRLPVMVWIHGGGLKL GGASSFDGRALSAYENVVVVAIQYRLSIWGFFSTCDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQDNIANFGGDPGSVTIFGESAG GYSVSILILSPLSKNLFHSAISESGVAFIPGMFTKDVRPITEQIAVTAGCKTTTSAVIVHCMRQKTEEELLEIMHKL NLYKLSLQGDTKNSDQFVTSVLDGVVLPKDPKEILAEKNFNTVPYIVGINKQECGWLLPTMTGFLPADVKLDKKKAI ALLEQFASMTGIPEDIIPVAVEKYTKGSDDPDQIREGVLDAMGDVAFGVPSVIVSRGHRDTGAPTYMYEYQYYPSFS SPQRPKNVVGDHADDVYSVFGAPILREGASEEEINLSKMVMKSWANFARNGNPNGKGLPHWPKYDQKEGYLHIGGTT QQAQ3.采用Ni-柱亲和层析，对Mceslf的表达产物进行了纯化，获得了高纯度(90%以上) 的 Mceslf0
4.采用固兰B盐法测得可溶性总蛋白，纯化的可溶性重组蛋白，包涵体总复性蛋白及纯化的包涵体复性重组蛋白对应的酶活力浓度分别为209U/ml、537U/ml、3122U/ml、7727U/ml，酶比活分别为 109. 4U/mg、257. lU/mg、2584. 4U/mg、5396. OU/mg。5.对大肠杆菌中Mceslf的表达产物做生物降解的活性测定。以呋喃丹、西维因、甲基对硫磷及联苯菊酯为底物，以高效液相色谱法(HPLC)进行残留量测定，研究发现该酶对呋喃丹、西维因、甲基对硫磷及联苯菊酯的生物活性都很强。本发明的有益效果是利用本发明构建的工程菌及其产生的重组酶降解环境中的农药残留物，改善环境，它与其他的降解方法相比酶制作方法简单，生产成本低且降解效率闻。运用基因克隆技术，成功克隆到小鼠肝脏羧酸酯酶(Mceslf)基因，与表达载体PET-32a连接后在大肠杆菌BL21中进行了该基因的高效表达。研究发现此酶是由535个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量约为76. 9KD，所得酶的最大酶活力浓度为7727U/ml，最大酶比活为5396U/mg，比所有已经克隆得到的羧酸酯酶酶活都要高。研究发现Mceslf对呋喃丹、西维因、甲基对硫磷、联苯菊酯等农药有降解作用，且降解效率很高。
图I羧酸酯酶Mceslf基因琼脂糖鉴定Linel:2000markerLine2 :Mceslf 基因 PCR 产物图2质粒PET-32a-Mceslf的构建过程示意3 SDS-PAGE检测Mceslf基因在大肠杆菌中的表达Linel BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌包涵体总蛋白Line2 BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌可溶性总蛋白Line3 :低分子量蛋白MarkerLine4 BL21 (DE3)含 pET-32a_Meslf 诱导Line5 BL21 (DE3)含 pET-32a_Meslf 未诱导Line6 BL21 (DE3)含 pET_32a:诱导Line7 BL21 (DE3)含 pET_32a 未诱导Line8 BL21 (DE3)诱导Line9 BL21 (DE3)未诱导图4 SDS-PAGE检测Mceslf纯化结果Linel BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌总蛋白Line2 BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌可溶性总蛋白Line3 :镍柱纯化的可溶性MceslfLine4 :低分子量蛋白MarkerLine5 :镍柱纯化的Mceslf包涵体图5 α-萘酚标准曲线
图6 Mceslf降解50mg/L呋喃丹空白组HPLC图谱图7 Mceslf降解50mg/L呋喃丹5小时HPLC图谱图8 Mceslf降解50mg/L呋喃丹12小时HPLC图谱图9 Mceslf降解50mg/L呋喃丹24小时HPLC图谱图10 Mceslf降解50mg/L西维因空白组HPLC图谱图11 Mceslf降解50mg/L西维因5小时HPLC图谱图12 Mceslf降解50mg/L西维因12小时HPLC图谱图13 Mceslf降解50mg/L西维因24小时HPLC图谱图14 Mceslf降解10mg/L甲基对硫磷空白组HPLC图谱图15 Mceslf降解10mg/L甲基对硫磷5小时HPLC图谱图16 Mceslf降解10mg/L甲基对硫磷12小时HPLC图谱图17 Mceslf降解10mg/L甲基对硫磷24小时HPLC图谱图18 Mceslf降解10mg/L甲基对硫磷48小时HPLC图谱图19 Mceslf降解10mg/L联苯菊酯空白组HPLC图谱图20 Mceslf降解10mg/L联苯菊酯5小时HPLC图谱图21 Mceslf降解10mg/L联苯菊酯12小时HPLC图谱图22 Mceslf降解10mg/L联苯菊酯24小时HPLC图谱
具体实施例方式
实施例l.Mceslf基因的克隆及表达
l.Mceslf基因的克隆
I. I小鼠肝脏总RNA的提取
采用TIAN GEN RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒提取小鼠肝脏总RNA。I. 2 通过 RT-PCR 扩增 Mceslf 基因I. 2. IcDNA第一链合成
利用TINA GEN TIANScript cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA第一链，具体步骤如下
1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物
10. 5ul总RNA提取液；
2ul oligo (dT)15 ；
2ul dNTP (2. 5mM each)；
2)70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min。简短离心收集反应液后加入以下各组分
4ul 5XFirst-Strand Buffer (含有 DTT) ;0· 5ulRNasin ;
3)加Iul (200U) TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀；
4)42°C温浴 50min;
5)95°C加热5min终止反应;
6)用RNase-free_ddH20将反应体系稀释到50ul，此即为cDNA第一链。L 2. 2Mceslf基因片段的PCR扩增
以 5 ' - GGAATTCATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCT -3 ; 和 5 '-CTCGAGTCACAGCTCATTGTGGTATGG-3 ;为引物(引物由上海生工合成)，以I. 2. I合成的cDNA第一链为模板，在以下条件下进行PCR扩增
反应体系
模板 2ul，引物 I Iul，引物 2 Iul，10X PCR buffer 5ul，Taq 聚合酶 Iul，dNTP 4ul，双蒸水36ul。PCR扩增条件
a.94°C 变性 5min ；b.940C变性45s，54°C退火2min，72°C延伸2min，进行35个循环；
c.72°C 延伸 IOmin ；
d.40C保存，放置至室温，1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3 Mceslf基因的序列测定及分析
将1%琼脂糖凝胶电泳检测得到的大小合适的片段，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)进行目的片段的回收，经O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的浓度及纯度(如图1)，之后在T4 DNA连接酶的作用下，与pUCm-T载体(上海生工)，22°C连接16h，构建重组质粒PUCm-T-Mceslf0采用CaCl2转化感受态大肠杆菌DH5 a (TaKaBa)，进行氨苄青霉素抗性筛选，挑取平板上的单菌落进行PCR及双酶切鉴定，将初步鉴定正确的亚克隆，送往上海生工进行DNA测序。测序结果出来后，利用Vector nti 11. 5. I软件对所测定序列进行分析，发现所克隆的DNA片段为一完整的开放阅读框，其基因全长1686bp，由于突变导致提取终止，最终编码535个氨基酸残基。I. 3 Mceslf的表达与纯化
I. 3. I重组质粒PET-32a-Mceslf的构建(如图2)
质粒pUCm-T-Mceslf以EcoR I和Xho I酶切，回收1698bp的小片段，连接到经EcoRI和Xho I酶切的质粒pET_32a (Novagen)上，得到了正确的重组质粒，将此质粒转入宿主菌BL21 (DE3)。1.3.2 Mceslf基因在大肠杆菌中的诱导表达
将含有质粒PET-32a-MCeslf的BL21 (DE3)菌株按照I :50的比例接种在LB液体培养基中(含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)，37°C恒温震荡摇床培养过夜(180rpm)，作为种子液使用。将种子液按照I :20的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中(含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)，37摄氏度，180rpm摇床培养2_3h。加入IPTG (终浓度ImM)，继续摇床培养5h。于IOOOOrpm下离心lOmin，取沉淀(菌体)，加入Iml 8M尿素重悬，4°C冰箱过夜，取IOml进行12%SDS_PAGE凝胶电泳检测目的蛋白带的表达。SDS-PAGE检测结果(图3)表明在76. 9KD附近有一条目的蛋白带，与预期大
小一致。I. 3. 3 Mceslf 的分离纯化
采用I. 2. 5的方法诱导表达工程菌，在4°C条件下，IOOOOrpm, IOmin离心收集菌体；菌体沉淀用O. 2M磷酸缓冲液(pH7. O)悬浮，加入溶菌酶(100ug/ml)进行细胞超声波破碎(功率300W，超声5秒，间隔9秒，重复30次)，lOOOOrpm，离心15min，取上清，得到酶储备液。酶储备液进行Ni-柱亲和层析。分别以10倍柱体积的ImM和20mM的咪唑进行洗涤，最后用200mM的咪唑洗脱，洗脱液先用0. 2M磷酸缓冲液(pH7. 0)透析，再用蔗糖进行浓缩，以SDS-PAGE检测纯度。结果表明，经过以上纯化过程，获得了纯度高(90%)的Mceslf目的蛋白(如图4)。米用固兰B 盐法(A study of Housefly esterases by means of a sensitivecolorimeteric menthod
K. VAN ASPEREN 1962)测 Mceslf 的酶活性。
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2. I所需试剂
O. 03M磷酸盐缓冲液(PH7. O) =Na2HPO4 5. 373g，NaH2PO4 2. 340g,分别溶解并定容至500ml，混合后调PH到7.0 ；
IOmM α -萘酚标准溶液称I. 441g α -萘酚溶于无水乙醇中，并定容至IOOml ；
0.03Μ α -乙酸萘酯溶液称O. 2793g α -乙酸萘酯溶于无水乙醇中，并定容至50ml ;DBLS (固兰B盐显色剂)Ig固兰B盐溶于IOOml双重水，12. 5g SDS溶于250ml双重水，将两种溶液混合后过滤待用；
Na2HPO4、似& 04和α-萘酚均为分析纯，α -乙酸萘酯购自阿拉丁，固兰B盐购自Ourchem02. 3 α -萘酚标准曲线的制备
先将IOmM的α -萘酚标准溶液用O. 03Μ磷酸盐缓冲液稀释为不同浓度梯度，与500ulDBLS混合后27°C水浴10分钟，于600nm下比色，记录个浓度梯度下的0D600值，然后以α -萘酚浓度为横坐标，以0D600值为纵坐标作出α -萘酚标准曲线(如图5)。2. 3 Mceslf酶活性测定
采用考马斯亮蓝法测得Mceslf可溶性总蛋白，纯化的可溶性目的蛋白，包涵体总复性蛋白，纯化的包涵体复性目的蛋白的蛋白浓度分别为1.911 mg/ml,2. 089 mg/mlU. 208mg/ml、L 432mg/ml。采用固兰B盐法测以上四种蛋白的酶活，具体做法为2.5mla-乙酸萘酯(含O. 0003Μα-乙酸萘酯)与500ul蛋白溶液混合后27°C反应半小时，反应结束后加500ulDBLS并置于27°C反应10分钟后测600nm下比色。根据标准曲线算出对应的α _萘酚产量。酶活性单位定义单位时间内催化产生I μΜ α-萘酚所需酶量定义为一个酶活单位，即 1 U=1 mmol *T,_1 miη~1 η酶活性浓度定义单位体积所含的酶活力单位数，即1U*L_1酶比活力定义单位mg酶所具有的酶活力单位数,即lU*mg-l。经计算得出四中蛋白对应的生成α - 丁萘酚的量分别为O. 126 μ mol/L、O. 321 μ mol/L、I. 873 μ mol/L,4. 637 μ mol/L ;对应的酶活力浓度为 209U/ml、537U/ml、3122U/ml、7727U/ml ;酶比活分别为 109. 4U/mg、257. lU/mg、2584. 4U/mg、5396. 0U/mg。Mceslf的获得及其用于对呋喃丹、西维因、甲基对硫磷和联苯菊酯等农药的降解3. I Mceslf的获得参照实施例I. 3. 3所制备的酶储备液。3. 2所需试剂
咲喃丹标品母液lg/L ;西维因标品母液4 g/L ;甲基对硫憐标品母液I g/L ;联苯菊酷标品母液I g/L ；
其中呋喃丹、西维因、甲基对硫磷购自中国计量科学研究院，均为标品(纯度在96%以上)。联苯菊酯购自上海市农药研究所，为标品(纯度为96. 6%)。3.3 Mceslf对呋喃丹、西维因、甲基对硫磷和联苯菊酯等农药的降解作用3. 3. I Mceslf对呋喃丹的降解作用
2ml的酶液与IOml呋喃丹(50mg/L)混合后置于27°C恒温振荡培养箱中，200rpm反应5小时、12小时、24小时，以2ml 0· 03M磷酸盐缓冲液(PH7. O)做为空白对照，然后将四个反应液经0. 22um滤器过滤后用HPLC (色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为甲醇/水=70/30 ；流速为I. Oml/mim;检测波长为210nm ;进样量为IOul ;柱温为30°C )检测呋喃丹残留量，结果(如图6-图9)显示Mceslf对呋喃丹具有降解作用，O小时空白组保留时间为3. 588，峰面积为3053185 ；5小时保留时间为3. 570，峰面积为2384557，降解率为21. 90% ；12小时保留时间为3. 575，峰面积为2223100，降解率为27. 19% ；24小时保留时间为3. 577，峰面积为2164976，降解率为 29. 09%。3. 3. 2 Mceslf对西维因的降解作用
2ml的酶液与IOml西维因(50mg/L)混合后置于27°C恒温振荡培养箱中，200rpm反应5小时、12小时、24小时，以2ml O. 03M磷酸盐缓冲液(PH7. O)做为空白对照，然后将四个反应液经O. 22um滤器过滤后用HPLC (色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为甲醇/水=60/40 ；流速为I. Oml/mim;检测波长为220nm ;进样量为IOul ;柱温为30°C )检测西维因残留量,结果(如图10-图13)显示Mceslf对西维因具有降解作用，O小时空白组保留时间为6. 156，峰面积为8795249 ；5小时保留时间为6. 155，峰面积为7769906，降解率为11. 66% ；12小时保留时间为6. 160，峰面积为6593095，降解率为25. 04% ；24小时保留时间为6. 148，峰面积为6270043，降解率为28. 71%。3. 3. 3 Mceslf对甲基对硫磷的降解作用
2ml的酶液与IOml甲基对硫磷(10mg/L)混合后置于27°C恒温振荡培养箱中，200rpm反应5小时、12小时、24小时及48小时，以2ml O. 03M磷酸盐缓冲液(PH7. O)做为空白对照，然后将四个反应液经O. 22um滤器过滤后用HPLC (色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为甲醇/水=60/40 ;流速为O. 6ml/mim;检测波长为270nm ;进样量为50ul ;柱温为30。。)检测甲基对硫磷残留量，结果(如图14-图18)显示Mceslf对甲基对硫磷具有降解作用，O小时空白组保留时间为6. 297，峰面积为785679 ；5小时保留时间为6. 184，峰面积为765334，降解率为2. 59% ；12小时保留时间为6. 199，峰面积为756590，降解率为3. 70% ；24小时保留时间为6. 196，峰面积为419315，降解率为46. 6% ；48小时保留时间为6. 200，峰面积为228778，降解率为 70. 88%。3.3.4 Mceslf对联苯菊酯的降解作用
2ml的酶液与IOml联苯菊酯(10mg/L)混合后置于27°C恒温振荡培养箱中，200rpm反应5小时、12小时、24小时，以2ml O. 03M磷酸盐缓冲液(PH7. O)做为空白对照，然后将四个反应液经O. 22um滤器过滤后用HPLC(色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为甲醇/水=80/20 ；流速为O. 6ml/mim;检测波长为254nm ;进样量为IOul ;柱温为30°C)检测联苯菊酯残留量，结果(如图19-图22)显示Mceslf对联苯菊酯具有降解作用，O小时空白组保留时间为3. 350，峰面积为2960930 ；5小时保留时间为3. 340，峰面积为2733521，降解率为7. 68% ；12小时保留时间为3. 340，峰面积为1553286，降解率为47. 54% ；24小时保留时间为3. 360，峰面积为656201，降解率为77. 84%。
权利要求
1. 一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，其表达是(O.以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoR I和Xho I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector NTI对所测定序列与对应的NCBI序列进行比对分析，确定该基因为Mceslf ；EcoR I起始 码子GMHEATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTtK^^ I I * tti 石I(2).通过EcoR I和Xho I进行双酶切，使Mceslf基因经T4 DNA连接酶作用连接在大肠杆菌高效表达载体PET-32a的EcoR I和Xho I酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mceslf，转化表达宿主菌BL21，进行IPTG诱导表达；此酶是由535个氨基酸残基组成的，由于选PET-32a作为表达载体，SDS-PAGE显示分子量为76. 9KD，跟预期一样；MFLSTLFLVSLATCVICGNPSSPPVVDTAHGKVLGKHVNVEGFSQPVAVFLGIPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSSVKNATTYPPMCSQDAARGQAVNDLITNRKEKIHLEFSEDCLYLNIYTPADFSKNSRLPVMVWIHGGGLKLGGASSFDGRALSAYENVVVVAIQYRLSIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQDNIANFGGDPGSVTIFGESAGGYSVSILILSPLSKNLFHSAISESGVAFIPGMFTKDVRPITEQIAVTAGCKTTTSAVIVHCMRQKTEEELLEIMHKLNLYKLSLQGDTKNSDQFVTSVLDGVVLPKDPKEILAEKNFNTVPYIVGINKQECGWLLPTMTGFLPADVKLDKKKAIALLEQFASMTGIPEDIIPVAVEKYTKGSDDPDQIREGVLDAMGDVAFGVPSVIVSRGHRDTGAPTYMYEYQYYPSFSSPQRPKNVVGDHADDVYSVFGAPILREGASEEEINLSKMVMKSWANFARNGNPNGKGLPHWPKYDQKEGYLHIGGTTQQAQ采用Ni-柱亲和层析，对Mceslf的表达产物进行了纯化，获得了高纯度90%以上的Mceslf。
2.如权利要求I所述的一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，其特征是有535个氨基酸组成的蛋白，是一种B-酯酶，能够催化水解含羧酸酯基的脂肪族和芳烃类有机化合物。
3.如权利要求I所述的一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，其特征是重组质粒PET-32a-Mceslfο
4.如权利要求I所述的一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，其特征是重组微生物是大肠杆菌BL21。
全文摘要
一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，属于分子生物学技术领域，其表达是以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoRI和XhoI酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件VectorNTI对所测定序列与对应的NCBI序列进行比对分析，确定该基因为Mces1f。通过EcoRI和XhoI进行双酶切，使Mces1f基因经T4DNA连接酶作用连接在大肠杆菌高效表达载体酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mces1f。有益效果是利用本发明构建的工程菌及其产生的重组酶降解环境中的农药残留物，改善环境，它与其他的降解方法相比酶制作方法简单，生产成本低且降解效率高。
文档编号C12N15/70GK102925468SQ20121036672
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者于源华, 周帅, 乔玉龙, 王保学, 张昊, 姚健, 王岩, 王维, 邬磊 申请人:长春长理康源生物技术有限公司