专利名称：抗glipr-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗glipr-2单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体。
背景技术：
GLIPR-2 (glioma pathogenesis related-2,GLIPR-2)属于 PR-1 (pathogenesisrelated-1)家族，普遍表达于哺乳动物外周血单核细胞和脾脏。最近的研究发现，肾脏纤维化中GLIPR-2表达基因在肾小管上皮细胞中表达增加，提示它在这一病理过程中具有重要作用。 肾脏纤维化是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程，主要包括肾间质纤维化与肾小球硬化。以往认为肾功能减退是由于肾小球病变所致，然而自1970年Schainuch提出肾小管间质(Tubuleinterstitium, TI)损害与肾功能减退呈显著相关的观点以来，TI损害日益得到重视。研究发现，表达GLIPR-2的肾小管上皮细胞明显向间质细胞转化，是肾脏成纤维细胞的主要来源之一。但目前对于GLIPR-2在纤维化中作用的分子机制尚不清楚，主要原因是缺乏有效的试验工具，特别是抗GLIPR-2的特异性抗体。因此，提供一种抗GLIPR-2的单克隆抗体，对进一步研究GLIPR-2的分子作用机制具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CCTCC NO :C201221。本发明所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗GLIPR-2单克隆抗体，即获得抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞。其中，所述GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠优选为 取GLIPR-2蛋白100 μ g加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次免疫注射，3周后取GLIPR-2蛋白300 μ g加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次免疫注射，7周后取GLIPR-2蛋白500μ g对BALB/C小鼠进行第三次免疫注射。本发明免疫所用GLIPR-2蛋白可参照文献《人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达》(黄绍光，李强，钮芹，倪丹妮，蒲晓允，免疫学杂质，2010年5月第26卷第5期)记载的内容获得。所述HAT培养具体操作优选为
用含20%胎牛血清的HAT选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96孔板中培养2周。所述ELISA检测具体操作优选为杂交瘤细胞培养上清液加入到GLIPR-2蛋白包被的酶标板中于37°C孵育20min，洗涤后以工作浓度为1:2000的标准加HRP标记的羊抗鼠IgG于37°C孵育20min，然后加邻苯二胺底物显色15min后终止反应。经过上述方法制备后,最终筛选出能够稳定分泌抗GLIPR-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为IAlIAl 1C9E2，并于2012年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学。此外，本发明还提供一种抗GLIPR-2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO:C201221的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗GLIPR-2单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水，本发明优选为
将保藏编号为CCTCC N0:C201221的杂交瘤细胞传代培养，取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5 X IO5个/只，诱导腹水，离心，收集上清，用DEAE-SephadeXA50离子交换柱层析法纯化抗GLIPR-2单克隆抗体。本发明所述保藏编号为CCTCC N0:C201221的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗GLIPR-2单克隆抗体均为IgGl型，效价较高，直接培养的上清可达I :2000，小鼠腹水可达10mg/mL，效价可达I : 10000，完全能够应用于GLIPR-2的分子作用机制的研究中。因此，本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO :C201221的杂交瘤细胞在制备抗GLIPR-2单克隆抗体中的应用。由以上技术方案可知，本发明提供了一株抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的抗GLIPR-2单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生抗GLIPR-2单克隆抗体，且细胞染色体稳定、抗体效价高，完全能够应用于GLIPR-2的分子作用机制的研究中。生物保藏信息说明杂交瘤细胞株1A11A11C9E2于2012年7月5日保藏在保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :C201221。
具体实施例方式本发明公开了抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面就本发明提供的抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体做进一步说明。实施例I:免疫小鼠I、材料
抗原GLIPR_2蛋白，根据文献《人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达》(黄绍光，李强，钮芹，倪丹妮，蒲晓允，免疫学杂质，2010年5月第26卷第5期)的方法制备；试验动物6周龄、17g左右BALB/C小鼠(由第三军医大学实验动物中心提供)；试剂福氏完全佐剂和不完全佐剂(购自Promega公司)；2、方法BALB/C小鼠后腿肌肉及背部皮内注射抗原免疫，第一次100 μ g加等量福氏完全佐剂，3周后用100 μ g加等量福氏不完全佐剂，7周后500 μ g不加佐剂腹腔注射，腹腔注射后第4天准备进行细胞融合。实施例2 :细胞融合I、材料 骨髓瘤细胞SP2/0细胞(由中国典型培养物保藏中心提供)；培养基胎牛血清(购自Invitrogen公司);HAT选择性培养基(购自Sigma公司)；饲养细胞2、方法腹腔注射后第4天取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下融合。融合后的杂交瘤细胞用含20%进口胎牛血清的HAT选择性培养基混均加入种有饲养细胞的96孔板中培养，2周后在倒置显微镜下挑选克隆孔。接种96孔细胞培养板7块共660孔(对照孔除外)，其中420孔有克隆生长，融合率为 64% (420/660) ο实施例3 =ELISA检测GLIPR-2蛋白包被酶标板，封闭后加杂交瘤细胞培养上清液37°C孵育20min，洗涤后加HRP标记的羊抗鼠IgG (工作浓度I : 2000)，37°C孵育20min后洗涤，加邻苯二胺(OPD)底物显色15min后终止反应。同时设阴性、阳性和空白对照，筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞。结果显示，抗体阳性有16孔，阳性率为2. 4% (16/660)。实施例3 :克隆化培养及染色体鉴定将前述筛选出的阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行多次克隆化培养，至克隆细胞抗体阳性率为100%，获得10株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，选择其中一株活性最强的杂交瘤细胞，命名为1A11A11C9E2。秋水仙素处理传代培养的1A11A11C9E2杂交瘤细胞，O. O75mol/LKC1溶液低渗处定、铺片，10%Giemsa染色，镜检。结果显示，正常BALB/C小鼠脾细胞染色体的数目恒定为40对，同品系的SP2/0细胞的染色体众数目为68对，1A11A11C9E2杂交瘤细胞的染色体数目约为两种亲本染色体数目的总合，染色后计数为102对。实施例4 :腹水诱导抗GLIPR-2单克隆抗体及抗体亚型检测1A11A11C9E2杂交瘤细胞经传代取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5 X IO5个/只，诱导腹水，离心，收集上清，用DEAE_SephadexA50离子交换柱层析法纯化单克隆抗体。用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒(购自于Sigma)鉴定，结果显示，制备的单克隆抗体均为IgGl型。实施例5 :抗GLIPR-2单克隆抗体特异性及效价检测
I、特异性检测采用常规的Western Blot印迹测定抗体纯度，操作步骤参见《分子生物学基本实验技术》(赵亚力，马学斌，韩为东主编)，一抗为本发明腹水纯化后的抗GLIPR-2单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG/HRP，ECL试剂盒。结果显示，抗GLIPR-2单克隆抗体可特异性识别分子量为17KD的抗GLIPR-2蛋白。2、ELISA法效价检测按照常规ELISA法进行检测，结果显示，直接培养的上清可达I :2000，小鼠腹水可达 10mg/mL,效价可达 I : 10000。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO:C201221。
2.根据权利要求I所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，由以下方法制备获得 GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合 ，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗GLIPR-2单克隆抗体，即获得抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞。
3.根据权利要求2所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，所述GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠具体为 取GLIPR-2蛋白100 μ g加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次免疫注射，3周后取GLIPR-2蛋白300 μ g加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次免疫注射，7周后取GLIPR-2蛋白500 μ g对BALB/C小鼠进行第三次免疫注射。
4.根据权利要求2所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，所述HAT培养具体操作为 用含20%胎牛血清的HAT选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96孔板中培养2周。
5.根据权利要求2所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，所述ELISA检测具体操作为 杂交瘤细胞培养上清液加入到GLIPR-2蛋白包被的酶标板中于37°C孵育20min，洗涤后以工作浓度为1:2000的标准加HRP标记的羊抗鼠IgG于37°C孵育20min，然后加邻苯二胺底物显色15min后终止反应。
6.保藏编号为CCTCCNO :C201221的杂交瘤细胞在制备抗GLIPR-2单克隆抗体中的应用。
7.抗GLIPR-2单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCCNO C201221的杂交瘤细胞分泌产生。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体。本发明所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CCTCC NOC201221。本发明所述杂交瘤细胞能够稳定产生抗GLIPR-2单克隆抗体，且细胞染色体稳定、抗体效价高，完全能够应用于GLIPR-2的分子作用机制的研究中。
文档编号C12N5/20GK102876637SQ201210418849
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者蒲晓允, 黄绍光, 蒋栋能, 刘飞 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院