化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因、其改造方法及应用，包括PCV2ORF2基因序列的来源及改造、引物的设计与合成、PCV2?ORF2短片段DNA的合成、全长基因的合成及合成后序列、表达载体的构建和目的基因在毕赤酵母中的表达等步骤。本发明综合参考了PTDS法和PAS法，使基因合成费用降低，步骤简单(两步PCR)，错误率低，合成周期短。在整个化学合成的过程中，运用了高保真的Taq酶，使误配的碱基序列能够在合成过程中得以修正，从而最大限度的减少了错误碱基的产生。将该基因克隆入酵母表达载体构建重组表达质粒，重组表达质粒规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可制备亚单位疫苗或核酸疫苗。
【专利说明】化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白，尤其涉及一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改 造方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV)分为PCV1和PCV2两种基因型，其 中PCV2有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，还是育肥猪的猪皮炎和肾病综合征（Porcine Dermatitis and Nephropathy SyndromeJDNS)的主要病因。由于该病属于免疫抑制疾病，可引发严重的继 发感染从而危害猪群健康，是继猪繁殖与呼吸综合征之后又一个严重危害全球养猪业的重 大疾病，在我国规模化猪群中PCV2感染率超过90%。近两年在国际上已获得批准的猪圆环 病毒疫苗有4个，其中2个是通过基因工程技术手段研制的疫苗，但其技术手段均获得了严 格的国际专利保护，这给研发新型PCV2疫苗设置了较高的门槛。猪圆环病毒2型基因工程 疫苗研究的难点是如何提蛋白产量和免疫原性，国际上已有很多研究利用大肠杆菌、杆状 病毒和腺病毒系统表达的产物进行免疫原性评估，在产量和免疫原性上很难两全。目前，国 内外尚无利用毕赤酵母表达系统制备基因工程疫苗。
[0003] 毕赤酵母（Pichia pastoris)表达系统经过近十年发展，已成为较完善的外源基 因表达系统，已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C片段、基因工程抗体等多种外源 基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的 外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模。酵母系统具有操作简单、产量高、对 蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能的优点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，就是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种化学合成的猪 圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用。
[0005] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种化学合成的猪圆环病毒 Cap蛋白基因及其改造方法，包括以下步骤：
[0006] 1)PCV2 0RF2基因序列的来源及改造
[0007] 运用 DNAstar (DNASTAR，Inc.)、RNA structure (Rochester University)软件对猪 圆环病毒0RF2的RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码 子优化的0RF2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0008] 2)引物的设计与合成
[0009] 设计了 18条引物，记为引物1-18,用于化学合成0RF2基因序列，引物1-18对应的 序列如SEQ ID NO. 2-SEQ ID N0. 19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列21bp ;
[0010] 3) PCR扩增400bp片段和300bp片段
[0011] 将步骤2)中所述18条引物分别以ddH20溶解至终浓度30 μ Μ ;分为两组，第一组 为引物1-10,第2组为引物11-18 ;
[0012] 400bp片段的扩增：将第一组中的引物2-9各取5 μ L混合，加入10 μ LddH20混合 均勻，取1 μ L作为扩增模板；以引物1和10为primer扩增400bp片段；
[0013] 300bp片段的扩增：将第二组中的引物12-17各取5 μ L混合，加入20 μ LddH20混 合均匀，取1 μ L作为扩增模板；以引物11和18为primer扩增300bp片段；
[0014] 两个片段的PCR扩增的反应程序为；94°C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸60s，扩增30个循环之后，72°C延伸lOmin ;
[0015] 4)全长基因的合成
[0016] 取上述400bp片段和300bp片段为模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 19所示的 序列为引物，进行PCR反应，一次性合成0RF2基因；
[0017] 5)表达载体的构建
[0018] 设计6条引物，分别扩增Cap基因密码子优化前、后全长以及不含信号肽的四种基 因片段，将四种基因片段分别与毕赤酵母表达载体连接，构建四种重组表达载体，6条引物 的序列如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID N0. 25 所示；
[0019] 6)目的基因在毕赤酵母中的表达
[0020] 将构建好的四种重组表达载体，电转化进入野生型毕赤酵母菌GS115中，经 Zeocin抗性筛选后获得大量多拷贝重组子；经甲醇诱导，SDS-PAGE和Western-blot分析结 果表明，能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子，目的蛋白分 子质量约为30KDa，免疫印迹试验能与多抗及单抗发生反应。
[0021] 步骤4)所述PCR反应的反应体系为：
[0022] 反应体系如下：
[0023]
【权利要求】
1. 一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1. PCV2 0RF2基因序列的来源及改造 运用 DNAstar(DNASTAR，Inc.)、RNA structure (Rochester University)软件对猪圆环 病毒0RF2的RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码子优 化的0RF2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 2) 引物的设计与合成 设计了 18条引物，记为引物1-18,用于化学合成0RF2基因序列，引物1-18对应的序列 如SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列2Ibp ; 3. PCR扩增400bp片段和300bp片段 将步骤2)中所述18条引物分别以ddH20溶解至终浓度30 μ Μ ;分为两组，第一组为引 物1-10,第2组为引物11-18 ; 400bp片段的扩增：将第一组中的引物2-9各取5 μ L混合，加入10 μ LddH20混合均匀， 取1 μ L作为扩增模板；以引物1和10为primer扩增400bp片段； 300bp片段的扩增：将第二组中的引物12-17各取5 μ L混合，加入20 μ LddH20混合均 勻，取1 μ L作为扩增模板；以引物11和18为primer扩增300bp片段； 两个片段的PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C退火 3〇8,721：延伸6〇8，扩增30个循环之后，721：延伸1〇1^11; 4) 全长基因的合成 取上述400bp片段和300bp片段为模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 19所示的序列 为引物，进行PCR反应，一次性合成0RF2基因； 5) 表达载体的构建 设计6条引物，分别扩增Cap基因密码子优化前、后全长以及不含信号肽的四种基因片 段，将四种基因片段分别与毕赤酵母表达载体连接，构建四种重组表达载体，6条引物的序 列如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID NO. 25 所示； 6) 目的基因在毕赤酵母中的表达 将构建好的四种重组表达载体，电转化进入野生型毕赤酵母菌GS115中，经Zeocin抗 性筛选后获得大量多拷贝重组子；经甲醇诱导，SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明， 能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子，目的蛋白分子质量约 为30KDa，免疫印迹试验能与多抗及单抗发生反应。
2. 如权利要求1所述的化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在 于：步骤4)所述PCR反应的反应体系为： 反应体系如下：
上述体系中，PCR仪程序设置为：94°C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸60s，扩增28个循环之后，72°C延伸lOmin。
3. 如权利要求1所述的化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在 于：步骤5)所述扩增的程序为：95°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火30sec，72°C延 伸30sec，30个循环，最后72°C延伸lOmin。
4. 如权利要求1所述的化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在 于：步骤5)所述6条引物中，SEQ ID NO. 20所示序列和SEQ ID NO. 21所示序列为扩增密码 子优化前用上游引物，SEQ ID NO. 22所示序列为密码子优化前用下游引物；SEQ ID NO. 24 所示序列和SEQ ID NO. 25所示序列为扩增密码子优化后用上游引物，SEQ ID NO. 23所示 序列为密码子优化后用下游引物；并且，上游引物5'端都含有Xhol酶切位点，下游引物5' 端都含有NotI酶切位点。
5. 权利要求1中所述猪圆环病毒Cap蛋白基因的应用，其特征在于：所述重组表达载 体规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可用于制备亚单位疫 苗或核酸疫苗。
【文档编号】C12N15/81GK104109678SQ201310131737
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月16日 优先权日:2013年4月16日
【发明者】张春玲, 于瑞嵩, 倪建平, 李春华, 李震, 何锡忠, 蒋凤英, 张婉华, 董世娟, 周宗清, 彭丽英, 张俊平 申请人:上海佳牧生物制品有限公司, 上海市农业科学院