专利名称：产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，属于生物医药技术领域。
背景技术：
四环素类抗生素是抑制细菌蛋白合成的一大类广谱抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌、立克次体属、支原体属和螺旋体等均有效。包括第一代四环素类抗生素四环素、金霉素和土霉素，它们分别由主要产金霉素(chlortetracycline)的金黄色链霉菌(Streptomyces aureofacines)和产土霉素(oxytetracycline)的龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)发酵产生。20世纪70年代开始应用半合成技术对四环素和土霉素进行了化学修饰，得到了第二代四环素类抗生素如7-氯代-6-去甲四环素、强力霉素和以土霉素为母核的二甲胺四环素，这些改进药性的半合成衍生物推动了四环素类抗生素的发展。2005年美国食品药品管理局(FDA)批准替加环素上市，以此为代表的甘氨酰环素类抗生素的上市标志着第三代四环素的诞生。其中第一代四环素类抗生素四环素、金霉素和土霉素因广谱、使用方便、经济等特点广泛应用于医药、畜牧和水产业，全球市场需求巨大。目前，工业生产上用产生金霉素的金黄色链霉菌来生产四环素，向培养基中添加一定浓度的溴化钾，抑制金霉素的产生而生产四环素。这种添加溴化钾发酵生产四环素的方法，不仅增加了工艺流程和生产成本，而且带来了严重的污染问题。近年来随着分子遗传学和化学生物学研究的深入，可以利用代谢工程(metabolicengineering),特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径获得基因重组菌株,从而直接发酵产生所需要的抗生素及其类似物(Keasling JD.Manufacturing molecules throughmetabolic engineering.Science.2010, 330:1355-1358.)。与化学合成相比，目的代谢产物可以由获得的重组菌株发酵大量生产，因而可以降低生产成本和减少环境污染。由于金黄色链霉菌遗传操作困难，对四环素类抗生素的生物合成的研究只能局限于随机突变株，所以大大限制了四环素类生物合成研究以及利用代谢工程特异性地进行遗传改造方面的工作。经对现有技术文献检索，未发现通过敲除氯代反应相关基因改变菌种次级代谢物组份和产量的相关技术报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法。本发明的方法种将氯代反应相关基因进行了基因敲除，从而获得发酵时只产生四环素的菌种的方法，采用这样的菌种发酵不仅四环素产量高，而且在发酵过程中不用添加溴化钾作为抑制剂，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了工业污染。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法包括如下步骤:
对金霉素产生菌中参与金霉素合成氯化相关基因进行了基因中断，进而得到只产生四环素的基因工程菌株。优选地，所述金霉素产生菌为金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3CCTCCN0:M2013080o优选地，所述参与金霉素合成氯化相关基因为氯化酶ctcP基因。优选地，所述方法包括如下步骤:步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶基因ctcP中断的同源交换质粒；步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株。优选地，步骤一中，所述同源交换质粒为ctcP突变的柯斯质粒PJTU4301。优选地，步骤一中，所述转入包括如下步骤:将构建的同源交换质粒通过大肠杆菌与金色链霉菌双亲之间进行的的接合转移，进而将同源交换质粒转入金色链霉菌。优选地，所述大肠杆菌为E.coli ET12567，其携带质粒pUZ8002。优选地，所述构建方法包括如下步骤:步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶ctcP基因中断的同源交换质粒；利用CopyControl Fosmid Library Production 试剂盒构建 Streptomycesaureofaciens F3基因组文库 ，根据卤化酶基因设计探针确定柯斯质粒IlDl包含完整CTC合成基因簇，将柯斯质粒11D1，通过λ-Red介导的大肠杆菌基因重组，将氯化酶基因ctcP突变掉，得到质粒PJTU4301 ；用EcoRI/Hindlll将质粒pIJ778双酶切，回收包含oriT+addA的1.5kb片段，该片段转化大肠杆菌DH10B，在壮观霉素抗性平板上长不出单菌落，则为合格；将回收的片段作为模板，用引物targPF/targPR扩增，回收1.5kb的PCR产物；通过电转化将IlDl导入E.coli BW25113感受态细胞，并制备E.coliBW25113/11D1电转化感受态细胞，将1.5kb片段用电转化导入其中，通过PCR引物对上39bp与ctcP基因外侧的同源片段与I IDl重组，双交换之后的柯斯质粒pJTU4301包含ctcP突变的CTC合成基因簇；步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株；将柯斯质粒PJTU4301通过大肠杆菌与链霉菌双亲之间的接合转移，将所构建的质粒转入金色链霉菌；ctcP突变的柯斯质粒PJTU4301必须在辅助质粒pUZ8002的协助下才能通过接合转移导入到受体金黄色链霉菌细胞中；pJTU4301首先转化E.coli ET12567，在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，按照1/10接种量转接培养2小时，收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用；作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理；将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液中，在50°C水浴中热激lOmin，冷却至室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基，37°C摇床培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按IO8:1O8与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板上，进行细菌双亲接合转移；
16小时后用含萘啶酮酸和壮观霉素的Iml无菌水覆盖平板，置30°C培养7 10天后即可看到转移接合子；最终得到只产生四环素的基因工程菌株。本发明具有如下有益效果:本发明通过构建同源交换质粒，转入金色链霉菌F3(Streptomyces aureofaciens) F3进行DNA同源重组,将金霉素合成过程中负责氯代步骤的氯化酶ctcP基因用壮观霉素抗性基因替代，从而中断氯代步骤，本发明的方法成功地进行了氯化酶基因敲除，得到只产四环素的基因工程菌，该菌株能够用于工业生产，且具有显著的效果:第一，该基因工程改造所得到的菌株ZT04仅生产四环素单一组分，其产量高达18.9g/L;其次，在发酵过程中，不用添加溴化钾作为抑制剂，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了溴化钾工业污染。本发明涉及的金色链霉菌F3 (Streptomyces aureofaciens)F3已经于2013年3月13日保减于中国典型培养物保减中心，地址:中国，武汉，武汉大学；邮编:430072 ;保减编号为 CCTCC NO:M2013080o
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1四环素与金霉素的化学结构；图2氯化酶基因中断流程和突变株ZT04的PCR验证；图3突变株ZT04和野生型菌株F3发酵产物HPLC检测结果；图4突变株ZT04和野生型菌株F3发酵产物MS检测结果，左为野生型，右为突变株。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，所述的大肠杆菌E.coli ET12567 (pUZ8002)发表于《Paget, M.S.，Chamberlin, L，Atrihj A.，Paget, M.S.et.al.Evidence that the extracytoplasmicfunction sigma factor σ Eis required for normal cell wall structure inStreptomyces coel icolor A3 (2).J.Bacteriolj 1999, 181:204-211》；以下实施例中使用的质粒以及试剂均可以通过公开的市售渠道获得。实施例1、同源交换质粒的构建用于导入宿主并和染色体发生同源重组以便获得目标突变，具体为利用CopyControl Fosmid Library Production 试剂盒构建 Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，根据卤化酶基因设计探针确定柯斯质粒IlDl包含完整CTC合成基因簇，将柯斯质粒11D1，通过λ -Red介导的大肠杆菌基因重组，将氯化酶基因ctcP突变掉，得到质粒PJTU4301。首先，用 EcoRI/Hindlll 将质粒 pIJ778 双酶切，回收包含 oriT+addA 的 1.5kb片段，该片段转化大肠杆菌DH10B，在壮观霉素抗性平板上长不出单菌落，则为合格。将回收的片段作为模板，用引物targPF/targPR扩增，回收1.5kb左右的PCR产物。接下来，通过电转化将IlDl导入E.coli BW25113感受态细胞，并制备E.coliBW25113/llDl电转化感受态细胞，将1.5kb片段用电转化导入其中，通过PCR引物对上39bp与ctcP基因外侧的同源片段与IlDl重组，双交换之后的柯斯质粒PJTU4301包含ctcP突变的CTC合成基因簇。targPF,5’-CGTCAAGTCGGTCTGAAGGAAAAGGAGTTCGACATGATTCCGGGGATCCGTCGA-3’(SEQ IDN0.1)targPR, 5’ -CCGTCCCGCGGACGCTGCTCGCCGTTGCCCCTCGCGCTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’ (SEQ ID N0.2)实施例2、把用于和染色体发生同源重组的质粒导入野生型宿主将构建的质粒通过大肠杆菌与链霉菌双亲之间的接合转移，将所构建的质粒转入金色链霉菌(金色链霉菌F3 (Streptomyces aureofaciens) F3)。ctcP突变的柯斯质粒PJTU4301必须在辅助质粒PUZ8002的协助下才能通过接合转移导入到受体金黄色链霉菌细胞中。PJTU4301首先转化E.coli ET12567 (携带pUZ8002)，在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，按照1/10接种量转接培养2小时，收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液(5ml0.05mol/L,pH8.0)中，在50°C水浴中热激lOmin，冷却至室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基(Difco酵母粉1%，Difco酪蛋白氨基酸1%，CaCl20.0lmol/L)，37°C摇床(250rpm)培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按IO8:1O8与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板(2%琼脂糖，2%甘露醇，2%黄豆饼粉，pH7.2 7.5)上，进行细菌双亲接合转移。16小时后用含萘啶酮酸(抑制大肠杆菌的生长)和壮观霉素(导入质粒PJTU4301带有此抗性)的Iml无菌水覆盖平板(终浓度:萘啶酮酸50ng/mL;壮观霉素50ng/mL),置30°C培养7_10天后即可看到转移接合子。实施例3、突 夺株的筛诜和骀证从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到抗性(壮观霉素)平板上进一步确认抗性，并放大平板培养。以备选株总DNA作为PCR模板；引物targPCF和TargPCR用于突变株的筛选，原始出发菌株DNA作为对照。突变株ctcP基因完整编码序列被壮观霉素抗性基因序列置换，PCR产物大小为1601bp，而出发菌株PCR产物大小为1905bp，从而最终确证了目标突变的正确性。targPCF, 5，-ACCACTTCGCCATCGGCGTCAAGTC-3’ ；(SEQ ID N0.3)targPCR, 5’-CGAGGTGCCCAGCCCGCTGATGTAC-3’ ；(SEQ ID N0.4)实施例4、突变菌株的发酵培养、抗生素的分离纯化及产物检测所述金色链霉菌用20%甘油保存菌种接种燕麦平板,燕麦平板具体配方:3.4%(w/V)，MgSO40.005%, KH2PO40.01%, (NH4) 2ΗΡ040.015%，所述突变株燕麦培养基中均加入相应终浓度为30 μ g/mL的壮观霉素。5-8天后用20%甘油收集孢子，取适量接种30mL种子培养基，容器为250mL带弹簧的三角瓶，30°C摇床培养24小时后按5%接种量接种IOOmL发酵培养基，容器为500mL带弹簧的三角瓶，30°C摇床培养4_5天。种子培养基配方为(w/v):玉米淀粉4.0%,黄豆饼粉2.0%,酵母粉0.5%,蛋白胨
0.5%,碳酸钙0.4%,硫酸铵0.3%,氯化钠0.2%,硫酸镁0.025%,磷酸二氢钾0.025%,高压灭菌。
发酵培养基配方为(w/v):玉米淀粉8.0%,黄豆饼粉4.0%,酵母粉0.1%,蛋白胨
1.4%,玉米浆0.8%,碳酸钙0.7%,硫酸铵0.35%,氯化钠0.25%,硫酸镁0.025%,分装之后按1.5mL/30-35mL体积比加入豆油，高压灭菌。发酵液用草酸酸化，调节pH至1.5-2.0, 5000rpm/min离心IOmin,收集上清液于_20°C避光冻存，以备下一步检测。金霉素及四环素的HPLC分离鉴定在安捷伦公司AglientllOOseries上进行，分离柱子为 glient TC C18 反向柱(5.0 μ m, 4.6mmX 250mm);流动相 A，0.02M 草酸/0.0lM 三乙基胺(TEA，pH2.0),B,乙腈。样品经过0.45 μ m滤膜过滤后上样，用20%乙腈等浓度洗脱下，流速为1.0mL/min,柱温保持室温，检测波长360nm，金霉素和四环素保留时间分别为6.9分钟、15分钟，二者能够很好分离，如图2所示。将出发菌株金色链霉菌和获得的ZT04突变株同时进行发酵，分离纯化发酵液，同批次进行HPLC检测。附图3所示，发酵结果表明，金色链霉菌突变株ZT04，不产金霉素，但是积累大量四环素，其产量高达18.9g/L。高压液相色谱-质谱联用(LC/MS)是在安捷伦公司的AgilentllOOseries LC/MSDTrap system上进行。分离柱子为glient TC C18反向柱(5.0 μ m, 4.6_X250mm);流动相A，0.02M草酸/0.0lM三乙基胺/1%甲酸(TEA, pH2.0)，B，乙腈。样品经过0.45 μ m滤膜过滤后上样，用30%乙腈等浓度洗脱下，流速为0.3mL/min，柱温保持室温，检测波长360nm。质谱工作条件:负离子模式；干燥气流:10L/min ;喷雾器压力:50psi ;干燥气温:3500C ;轰击电压:1.0-1.8V。通过LC-MS对发 酵产物进行了检查，进一步确证了积累的产物为四环素，结果见图4，左为野生型，右为突变株。显然，本发明的发酵方法，在发酵过程中，不用添加溴化钾作为抑制剂，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了溴化钾工业污染。综上所述，本发明通过构建同源交换质粒，转入金色链霉菌F3(Streptomycesaureofaciens)F3进行DNA同源重组,将金霉素合成过程中负责氯代步骤的氯化酶ctcP基因用壮观霉素抗性基因替代，从而中断氯代步骤，本发明的方法成功地进行了氯化酶基因敲除，得到只产四环素的基因工程菌，该菌株能够用于工业生产，且具有显著的效果。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
权利要求
1.一种产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤:对金霉素产生菌中参与金霉素合成氯化相关基因进行了基因中断，进而得到只产生四环素的基因工程菌株。
2.如权利要求1所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述金霉素产生菌为金色链霉菌(Sti^ptomyces aureofaciens) F3CCTCC NO:M2013080o
3.如权利要求2所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述参与金霉素合成氯化相关基因为氯化酶CtcP基因。
4.如权利要求3所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述方法包括如下步骤: 步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶CtcP基因中断的同源交换质粒； 步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株。
5.如权利要求4所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，步骤一中，所述同源交换质粒为CtcP突变的柯斯质粒PJTU4301。
6.如权利要求4所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，步骤一中，所述转入包括如下步骤:将构建的同源交换质粒通过大肠杆菌与金色链霉菌双亲之间进行的的接合转移，进而将同源交换质粒转入金色链霉菌。
7.如权利要求6所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述大肠杆菌为E.coli ET12567，其携带质粒pUZ8002。
8.如权利要求6所述的产生 四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述构建方法包括如下步骤: 步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶CtcP基因中断的同源交换质粒； 利用 CopyControl Fosmid Library Production 试剂盒构建 Streptomycesaureofaciens F3基因组文库，根据卤化酶基因设计探针确定柯斯质粒IlDl包含完整CTC合成基因簇，将柯斯质粒11D1，通过λ-Red介导的大肠杆菌基因重组，将氯化酶基因ctcP突变掉，得到质粒PJTU4301 ； 用EcoRI/Hindlll将质粒pIJ778双酶切，回收包含oriT+addA的1.5kb片段，该片段转化大肠杆菌DH10B，在壮观霉素抗性平板上长不出单菌落，则为合格； 将回收的片段作为模板，用引物targPF/targPR扩增，回收1.5kb的PCR产物； 通过电转化将IlDl导入E.coli BW25113感受态细胞，并制备E.coli BW25113/11D1电转化感受态细胞，将1.5kb片段用电转化导入其中，通过PCR引物对上39bp与ctcP基因外侧的同源片段与IlDl重组，双交换之后的柯斯质粒PJTU4301包含ctcP突变的CTC合成基因族； 步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株； 将柯斯质粒PJTU4301通过大肠杆菌与链霉菌双亲之间的接合转移，将所构建的质粒转入金色链霉菌； ctcP突变的柯斯质粒PJTU4301必须在辅助质粒pUZ8002的协助下才能通过接合转移导入到受体金黄色链霉菌细胞中；PJTU4301首先转化E.coli ET12567，在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，按照1/10接种量转接培养2小时，收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用；作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理；将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液中，在50°C水浴中热激lOmin，冷却至室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基，37°C摇床培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按108:108与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板上，进行细菌双亲接合转移；16小时后用含萘啶酮酸和壮观霉素的Iml无菌水覆盖平板，置30°C培养7 10天后即可看到转移接合子 ；最终得到只产生四环素的基因工程菌株。
全文摘要
本发明涉及一种生物医药技术领域的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤对金霉素产生菌中参与金霉素合成氯化相关基因进行了基因中断，进而得到只产生四环素的基因工程菌株。本发明通过构建同源交换质粒，转入金霉素产生菌，进行DNA同源重组，将金霉素合成过程中负责氯代步骤的氯化酶基因ctcP用壮观霉素抗性基因替代，从而中断氯代步骤，得到只产四环素的基因工程菌，该菌株能够用于工业生产，且具有显著的效果第一，该基因工程改造所得到的菌株ZT04仅生产四环素单一组分，其产量高达18.9g/L；其次，与当前发酵工艺相比在发酵过程中，不用添加溴化钾作为抑制剂，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了溴化钾工业污染。
文档编号C12N1/21GK103233034SQ20131014321
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者由德林, 朱涛, 邓子新 申请人:上海交通大学