一种pcr-dgge\tgge\sscp引物筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的筛选方法，从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选，筛选指标包括引物对的匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量，最适的引物对是通过综合比较各引物对之间指标的优劣来确定的。本发明选取的引物具有很强的针对性同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作，有助于采用PCR-DGGE\TGGE\SSCP技术对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。
【专利说明】—种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物分子生态学【技术领域】，具体涉及一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的筛选方法，特别是一种适合于所研究微生物生态体系菌群多样性解析的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的筛选方法。
【背景技术】
[0002]PCR-DGGE简称DGGE即变性梯度凝胶电泳、PCR-TGGE简称TGGE即温度梯度凝胶电泳和PCR-SSCP简称SSCP即单链构态多样性分析是三项DNA指纹技术，目前均已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。这三项技术可以用于分离长度相同但序列不同的DNA片段:对于DGGE和TGGE技术，双链DNA片段的分离是依靠其在含有化学变性剂梯度(DGGE)或温度梯度(TGGE)的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为而实现的；对于SSCP技术，单链片段的分离是依靠其在低温下具有不同的构像而实现的。与微生物学传统研究手段相比，这三项微生物分子生态学技术最大的特点在于它们是不基于培养的方法——是以样品总DNA或RNA出发进行研究的，因此能检测到生态体系中大量的不可培养微生物。同时这三技术还具有可靠性强、重现性高、方便快捷的优点，目前被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、湖泊等各种环境的微生物生态解析中。
[0003]PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的选择对于特定微生物生态中菌群多样性的研究十分关键:如果引物和研究体系中某些微生物种群不匹配，结果就会导致相关菌群的遗漏，甚至包括优势菌群；如果引物扩增的片段可变性不足，就难以通过DGGE\TGGE\SSCP获得全面准确的菌群多样性信息。因此既要求引物要从研究体系中各微生物种群共有的保守序列中选取，又需要引物扩增的片段在研究体系的各菌群中具有足够的可变性。目前针对rDNA序列已经开发出了一些常用的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物，而当前大多数菌群多样性研究往往只选择其中的一对引物开展.一并未考查该引物是否适合于所研究体系，或者是否有更加合适的引物。有研究表明，选择不同的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物进行研究结果往往存在差异。针对适合于所研究体系菌群多样性研究的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的选择，有关研究表明可以采用比较不同类型的引物进行多样性分析的效果，然后从中筛选出最佳的引物；或者采用多对引物分别进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP分析，最后共同解析菌群多样性。然而多对引物择优或者联用的研究策略将大大增加工作量，此外还是具有一定的盲目性。因此应该采用从所研究的菌群体系出发选取或者设计PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的策略，这样则选取或者设计得到的引物将具有很强的针对性，同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种基于序列特性分析的PCR_DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，从而实现对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于:从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选，筛选指标包括引物匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量。
[0006]具体步骤如下:
步骤1:确定所研究体系涉及的微生物种属。
[0007]所研究体系涉及的微生物种属可以结合文献报道和前期研究进行确定，因此该方法更加适用于体系较为明确的研究。此外相关分析是基于已知涉及的菌群信息及其现有的DNA序列，随着相关研究的开展、进行和深入，菌群信息及其DNA序列将会得到更新或者补充，因此可以采用同样的方法进行完善。
[0008]步骤2:根据研究需要选择特定的DNA片段，收集步骤I所述微生物种属的该DNA片段并找出现有的靶向该片段的系列PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物对。
[0009]rDNA可变区常被选择作为菌群多样性研究的靶标片段，如采用16S rDNA的V3区研究细菌菌群多样性。而对于某一微生物种属，其特定DNA片段的检索最好是在专门的数据库中进行(如 RDP:http://rdp.cme.msu.edu/ 和 SILVA:http://www.arb-silva.de/等)，所得序列将更加可靠和具有代表性；此外检索结果可能不止一条，应选择长度最长的作为代表。
[0010]步骤3:将步骤2中收集到的微生物种属的DNA序列和各引物对分别进行比对，分析各引物对的匹配情况。
[0011]各引物对和收集的微生物种属DNA的比对可以采用生物信息学软件Clustal完成。引物的匹配情况是指引物与所研究体系各微生物种属相应靶标序列的匹配情况，这决定了 PCR扩增的成败以及扩增的好坏`，将直接影响到对菌群多样性的准确而有效的解析。理想的情况是最优引物和所研究体系各微生物种属相应靶标序列均能够完全匹配，以保证最佳的扩增(；邢德峰，任南琪.应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析.微生物学报，2006，46 (2):331-335.)。
[0012]步骤4:对各引物对扩增片段的序列特性进行包括区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量的分析。
[0013]引物一般设计在保守区内，其扩增的可变区片段需要尽可能多地区分研究体系中的微生物种属，这样才能保证获得准确而可靠的菌群多样性信息(59，695-700;Ercolini, D., 2004.PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection ofmicrobes in food.J Microbiol Methods.56, 297-314.);因此引物对扩增片段需要保证良好的区分度，这是非常重要的。对于所研究微生物体系，某一引物对扩增片段的区分度是指该片段序列存在差异的微生物种属数量占全体微生物种属数量的比例；该比例越高越好，最好的结果是I。对于某一引物对的扩增片段，各微生物种属之间该片段的差异度是指通过比对得到的差异碱基数占比对全长的百分数，这是一个与相似度相对的指标；而平均差异度为所有存在扩增片段序列差异的微生物种属片段差异度的平均值，表征了扩增片段的整体差异程度。由于序列差异越大其分离情况越复杂，因此平均差异度越低越好，其最低值在两两之间均只相差一个碱基的情况下取得(Lyons, J.1994.1dentificationof mutant forms of G-protein a subunits in human neoplasia by polymerase chainreaction-based techniques.Meth.Enzymo1.237: 295-308; Colin R.Jackson, EricE.Roden, Perry F.Churchill.Denaturing Gradient Gel Electrophoresis CanFail to Separate 16S rDNA Fragments with Multiple Base Differences.MolecularBiology Today 2000.1(2): 49-51.)。平均长度是指可变区核苷酸的平均数量，可变区长度一般在 200bp_500bp 之间(13，3131-3145; Freeman, K., Woods, E., ffelsby,S., Percival, S.L., Cochrane, C.A., 2009.Biofilm evidence and the microbialdiversity of horse wounds; Can J Microbiol.55, 197-202; Lee, S., Choi, B., Yi,S.-M., Ko, G., 2009.Characterization of microbial community during Asian dustevents in Korea.Science of the Total Environment.407, 5308-5314.),在此范围内一般越短分辨率越高。平均GC含量是指G碱基和C碱基之和占总碱基数的平均比例，相同长度的两个可变区相比，平均GC含量低的发生序列变异所引起的效果(解链或构象形成差异)会更明显，因此更有利于序列不同的片段的分离。
[0014]步骤5:根据各引物对的匹配情况和其扩增片段的序列特性进行综合分析，筛选最适的引物对。
[0015]进一步的，所述的步骤3和步骤4各引物对匹配情况及其扩增片段的序列特性，匹配情况和区分度是核心评估指标，需要首先保证良好的匹配度和区分度；而平均差异度、平均长度和平均GC含量是辅助评估指标，需要低的平均差异度、短的片段平均长度和低的平均GC含量。
[0016]进一步的，所述的步骤5各引物对的匹配情况及其扩增片段序列特性的综合分析将决定其是否适合于所研究微生物体系菌群多样性的解析，最适引物对是通过综合比较各弓I物对之间指标的优劣来确定的。
[0017]本发明是从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行引物筛选的，因此选取的引物将具有很强的针对性，同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作，这样将有助于采用PCR-DGGE\TGGE\SSCP技术对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。 【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是引物筛选方法实施步骤的简要流程。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0020]实施例1:
以红曲黄酒酿造体系中的真菌菌群为研究对象，通过三对靶向18S rDNA片段的引物对(FR1-FF390、NS3_YM951r和NSl-Fung)的匹配情况及其扩增片段序列特性的分析，筛选适合于该体系真菌菌群多样性研究的PCR_DGGE\TGGE\SSCP引物。具体步骤如下:
1、确定红曲黄酒酿造体系中的真菌菌群信息
根据本发明实施例的前期研究(Identification and characterization offilamentous fungi isolated from fermentation starters for Hong Qu glutinousrice wine brewing.Xu-Cong Lv, Zh1-Qing Huang, Li Ni*, et al.The Journal ofGeneral & Applied Microbiology.2012, 58 (I):33-42.另有部分结果尚未发表)和查阅相关文献，确定出红曲黄酒酿造体系中的主要真菌菌群共15种，如表I所示。
[0021]2、收集18S rDNA近全长序列
根据表I在SILVA数据库中检索各真菌种属的18S rDNA近全长序列(真菌的18S rDNA序列全长约有1800bp，但是目前数据库中仅有少数真菌种属的18S rDNA全长序列，因此本实施例收集的是18S rDNA近全长序列，至少不少于1500bp)，检索结果出现多条序列的则在保证测序质量的前提下选择最长的那条。各真菌种属18S rDNA近全长序列的AccessionNumber情况详见表I。
表I红曲黄酒酿造阵系中的真菌菌群及其I SSrDNA序列信息
【权利要求】
1.一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于:从微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选，筛选指标包括引物匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量。
2.根据权利要求1所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于:具体步骤如下: 步骤1:确定所研究体系涉及的微生物种属； 步骤2:根据研究需要选择特定的DNA片段，收集步骤I所述微生物种属的该DNA片段并找出现有的靶向该片段的系列PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物对； 步骤3:将步骤2中收集到的微生物种属的DNA序列和各引物对分别进行比对，分析各引物对的匹配情况； 步骤4:对各引物对扩增片段的序列特性进行包括区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量的分析； 步骤5:根据各引物对的匹配情况和其扩增片段的序列特性进行综合分析，筛选最适的引物对。
3.根据权利要求2所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于:所述的步骤3和步骤4各引物对匹配情况及其扩增片段的序列特性，匹配情况和区分度是核心评估指标，需要首先保证良好的匹配度和区分度；而平均差异度、平均长度和平均GC含量是辅助评估指标，需要低的平均差异度、短的片段平均长度和低的平均GC含量。
4.根据权利要求2所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于:所述的步骤5各引物对的匹配情况及其扩增片段序列特性的综合分析将决定其是否适合于所研究微生物体系菌群多样性 的解析，最适引物对是通过综合比较各引物对之间指标的优劣来确定的。
【文档编号】C12Q1/04GK103436615SQ201310372313
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月24日 优先权日:2013年8月24日
【发明者】倪莉, 黄志清, 陈芳, 黄山, 靳爽 申请人:福州大学