一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用的制作方法

一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种普通镰刀菌，利用该普通镰刀菌制备降粘酶的方法及其应用。针对现有技术中降低甘薯发酵醪液粘度存在的缺陷，本发明提供了一种能够生产降粘酶的菌种。普通镰刀菌CBS131819采集自随机选取的自然状下腐烂的甘薯块茎，已保藏于荷兰皇家艺术与科学学院荷兰微生物菌种保藏中心，保藏日期2012年1月27日。普通镰刀菌CBS131819可应用于制备降粘酶，所产降粘酶活性高、用量少、作用时间短、降粘效果好。该菌可应用于甘薯块茎发酵醪液降粘，并可进一步应用于甘薯类燃料乙醇发酵工艺的前期降粘预处理中。
【专利说明】—种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种普通镰刀菌、利用该菌种制备降粘酶的方法及其应用，特别是涉及一种可应用于甘薯块茎发酵降粘的普通镰刀菌及其应用，属于微生物及微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002]生物质燃料乙醇即采用植物等生物质原料发酵生产无水乙醇，再加入体积比5%左右的变性剂(一般为无铅汽油或无铅的烃类)使之成为含水量小于0.8%且不可食用的变性无水乙醇。燃料乙醇是一种良好的汽油增氧剂与辛烷值调和组分，能有效降低汽车尾气中的一氧化碳含量，从而真正实现节能减排。生物质燃料乙醇作为一种可再生能源，因其能缓解能源危机，稳定粮食生产，增加就业机会和农民收入，减少环境污染而备受关注并成为各国竞相研发的重要课题之一。2007年，我国正式宣布停止一切以粮食原料生产燃料乙醇的项目，鼓励发展甘薯、甘蔗、甜高粱等非粮食原料生产燃料乙醇。甘薯燃料乙醇发酵醪液是一种典型的非牛顿流体(一般的发酵液粘度小于0.1Pa.S)，具有粘度大的特点
IOOPa.S)，对发酵过程中传质传热等产生影响，从而降低发酵效率、延长发酵时间、减少最终乙醇浓度，并且容易堵塞管路、增加能耗。因而醪液粘度高是甘薯高浓度发酵生产燃料乙醇的瓶颈之一。
[0003]现有技术中，降低甘薯发酵醪液粘度基本有两种方法，一是添加发酵用水降低粘度，二是添加木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶等商品酶或者其混合物，促进α-淀粉酶与淀粉颗粒接触，提高淀粉颗粒利用效`率。这两种方法均存在各自的技术缺陷:前者不仅增加了生产用水量，还降低了酒精成品产量，不能解决实际问题；后者使用商品酶作为一种快速预处理方法，增加了生产成本，不利于燃料乙醇规模化生产。

【发明内容】

[0004]本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种能够生产降粘酶的菌种，及其制备降粘酶以及在甘薯发酵降粘中的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明首先提供一种普通镰刀菌:
[0006]普通镰刀菌XYL-1，保藏于CBS-KNAW，保藏号为CBS131819，保藏日期为2012年I月27日。
[0007]普通镰刀菌CBS131819属普通镰刀菌(Fusarium commune),已保藏于荷兰皇家艺术与科学学院荷兰微生物菌种保藏中心(Royal Netherlands Academy of Arts andSciences, The Centraalbureau voor Schimmelcultures, CBS-KNAW),保藏日期 2012 年 I月27日，保藏编号CBS131819。CBS-KNAW机构地址:8Uppsalalaan，3584CT，荷兰乌得勒支(Uppsalalaan8, 3584CT Utrecht the Netherlands)。
[0008]普通镰刀菌CBS131819采集自随机选取的自然状下腐烂的甘薯块茎。筛选过程为:腐烂的甘薯块茎制成菌悬液，经梯度稀释后接种至筛选培养基，30°C培养3d，PDA培养基分离培养，30°C培养7d，刚果红染液染色，挑选出黄色透明圈大且明显的菌株。筛选培养基的组成为:木聚糖(Xylan) 10g/L,酵母膏 4.5g/L，(NH4)2S044.5g/L，NaC15.0g/L,K2HP042.0g/L,MgSO4 *7H200.4g/L，琼脂15g/L，pH6.0。刚果红染液染色步骤为:菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色lOmin，倒掉染色液然后用lmol/L NaCl溶液润洗3次，每次lOmin。
[0009]本发明菌落在PDA培养基上菌丝白色，菌丝发达，疏松，四周扩展。显微镜下观察，菌株小型分生孢子卵形或微弯曲成肾型，大型分生孢子镰刀型，两端稍尖，3~5个分隔。
[0010]普通镰刀菌CBS131819可应用于降粘酶制备。
[0011]本发明还提供一种降粘酶制备方法，其技术方案如下:
[0012]一种降粘酶制备方法，其特征在于:将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30°C、130rpm下培养4d~5d，制得降粘酶粗酶液；所述发酵培养基是(g/L):风干玉米芯 20、蛋白胨 3.0、酵母膏 0.5、ΚΗ2Ρ042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005,ZnSO4.7Η200.0014,MnSO4.Η200.0016,COCl2.6Η200.0016,Tween-803.3、ρΗ5.00
[0013]在优选条件下，发酵培养基是(g/L):风干玉米芯20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ6.5。
[0014]以上述方法制得的降粘酶粗酶液，是多种酶的混合液，Pedersen et al.(2009)经报道的AZCL分析方法分析 显示，降粘酶粗酶液组成为:内切-l，4-13-D-木聚糖酶32 (蓝色水解环直径/_，下同)，内切-纤维素酶19.5,内切-1，4-β -D-半乳聚糖酶15.6,内切-1，4- β -D-甘露聚糖酶15，内切-1，5- a -L-阿拉伯聚糖酶14，α -淀粉酶14，β -葡聚糖酶13，内切-1，3- β -D-葡聚糖酶7，鼠李糖半乳聚糖醛酸裂解酶10。基于此，本发明提供一种降粘酶组合物，具体技术方案是:
[0015]一种降粘酶组合物，其特征在于:依照如下方法制得:将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30°C、130rpm下培养4d~5d，制得降粘酶组合物；所述发酵培养基是如下二种之一:
[0016]发酵培养基一(g/L):风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016, Tween-803.3、ρΗ5.0 ；
[0017]发酵培养基二(g/L):风干玉米芯20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ6.5。
[0018]上述降粘酶组合物可以经离心，取上清液0.22 μ m过滤器过滤提纯。
[0019]利用上述方法制得的降粘酶组合物，本发明进一步提供一种甘薯块茎发酵降粘的方法，其技术方案如下:
[0020]一种利用上述降粘酶组合物实施的甘薯块茎发酵降粘的方法，其特征在于:向甘薯块茎浆中添加反应酶液，50°C、ISOrpm条件下灭菌2h ;所述反应酶液是降粘酶粗酶液。
[0021]在优选条件下，上述方法的甘薯块茎浆制备方法是:步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆；步骤S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α -淀粉酶，80°C~90°C反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115°C条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
[0022]上述甘薯块茎发酵降粘的方法可以应用于甘薯燃料乙醇发酵工艺中。具体是应用于鲜甘薯类燃料乙醇发酵工艺的前期降粘预处理中。
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果是:(1)提供了新的普通镰刀菌CBS131819(普通镰刀菌XYL-1) ;(2)普通镰刀菌CBS131819可应用于制备降粘酶，普通镰刀菌CBS131819所产降粘酶活性高、用量少、作用时间短、降粘效果好；(3)普通镰刀菌CBS131819可应用于甘薯块茎发酵醪液降粘；(4)利用普通镰刀菌CBS131819实施的甘薯块茎发酵降粘方法可应用于甘薯燃料乙醇发酵工艺中。
【具体实施方式】
[0024]下面结合优选实施例、对照例对本发明技术方案作进一步的描述。
[0025]实施例一
[0026]本实施例记载普通镰刀菌CBS131819的筛选方法。
[0027]腐烂甘薯块茎:自然状态下腐烂甘薯块茎。
[0028]筛选过程为:随机取自然状态下腐烂甘薯块茎5g于IOOmL三角瓶，加入20mL无菌水，室温180rpm，30min,得到菌悬液；按照经典的涂布稀释平板法，经10' 10_2、10' 10_4、ιο'ιο'ιο—7梯度稀释后，分别取ιοομυοΛιοΛιο—7浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，30°C培养3d，挑取平板上生长较大的单菌落到PDA斜面培养基上分离培养，30°C培养7d，然后用刚果红染液染色， 挑选出黄色透明圈大且明显的菌株。
[0029]筛选培养基的组成为:木聚糖(Xylan) 10g/L,酵母膏4.5g/L，(NH4)2S044.5g/L，NaC15.0g/L, K2HP042.0g/L, MgSO4.7H200.4g/L,琼脂 15g/L, pH6.0。
[0030]刚果红染液染色步骤为:菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色lOmin，倒掉染色液然后用lmol/L NaCl溶液润洗3次，每次lOmin。
[0031]本实施例筛选得到的菌落在PDA培养基上菌丝白色，菌丝发达，疏松，四周扩展。显微镜下观察，菌株小型分生孢子卵形或微弯曲成肾型，大型分生孢子镰刀型，两端稍尖，3~5个分隔。经鉴定属普通镰刀菌(Fusarium commune),命名为普通镰刀菌XYL-1。
[0032]实施例二
[0033]本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法。
[0034]发酵培养基(g/L):风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016, Tween-803.3、ρΗ5.0。
[0035]制备操作:将普通镰刀菌CBS131819接种于50mL发酵培养基，30°C、130rpm下培养4d，制得降粘酶粗酶液。
[0036]实施例三
[0037]本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法，其与实施例二相同之处不再重复，其不同之处在于，将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，300C、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
[0038]实施例四
[0039]本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法。[0040]优选发酵培养基(g/L):风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016, Tween-803.3、ρΗ5.0。
[0041]制备操作同实施例二。
[0042]实施例五
[0043]本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法，其与实施例四相同之处不再重复，其不同之处在于:将普通镰刀菌CBS131819接种于优选发酵培养基，30°C、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
[0044]实施例六
[0045]本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法，其与实施例五相同之处不再重复，其不同之处在于:将普通镰刀菌CBS131819接种于200ml发酵培养基(其中普通镰刀菌CBS131819接种量与发酵培养基用量放大相同倍数)，30°C、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
[0046]实施例七
[0047]本实施例记载甘薯块茎发酵降粘的方法。
[0048]粘度测定仪器:上海尼润智能科技有限公司生产的RDV-2+PR0型数字式旋转粘度计。
[0049]α -淀粉酶标准酶活力为90KNU/g，酶活定义为在37°C，pH5.6时，每小时水解5.26克淀粉的酶量为I个KNU。
[0050]步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆。
[0051]步骤S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α -淀粉酶，80°C~90°C反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115°C条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
[0052]步骤S3、降粘酶粗酶液经离心，取上清液经0.22 μ m过滤器过滤制得反应酶液。
[0053]步骤S4、向步骤S2所得甘薯块茎浆中添加反应酶液，50 0C、180rpm条件下反应2h，测量粘度值；降粘酶粗酶液来源、加入量及降粘效果如下表1所示。
[0054]对照处理:取50g或100g步骤S2所得甘薯块茎浆加入2mL或4mL无菌水，50°C、180rpm条件下作用2h后，测定粘度值为19686mPa.s~23042.5mPa.S。
[0055]表1反应酶液及粘度测定结果
[0056]
【权利要求】
1.普通镰刀菌CBS131819，保藏于CBS-KNAW，保藏号为CBS131819，保藏日期为2012年I月27日。
2.根据权利要求1所述的普通镰刀菌CBS131819在制备降粘酶中的应用。
3.根据权利要求1所述的普通镰刀菌CBS131819的筛选方法，其特征在于:腐烂的甘薯块茎制成菌悬液，经梯度稀释后接种至筛选培养基，30°C培养3d，PDA培养基分离培养，30°C培养7d，刚果红染液染色，挑选出黄色透明圈大且明显的菌株；所述筛选培养基为(g/L):木聚糖 10，酵母膏 4.5，(NH4) 2S044.5，NaC15.0, Κ2ΗΡ042.0, MgSO4.7Η200.4，琼脂 15，ρΗ6.00
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述菌悬液制备是将甘薯块茎5g于IOOmL三角瓶,加入20mL无菌水，室温180rpm, 30min,得到菌悬液；所述梯度稀释是按照经典的涂布稀释平板法，经梯度稀释后，分别取100 μ L10_5，10_6，10_7浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上。
5.—种降粘酶制备方法，其特征在于:将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30°C、130rpm下培养4d~5d，制得降粘酶粗酶液；所述发酵培养基是如下二种之一: 发酵培养基一(g/L):风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl 20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ5.0 ；
发酵培养基二(g/L):风干玉米芯 20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgS04.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005,ZnSO4.7Η200.0014,MnSO4.Η200.0016,COCl2.6Η200.0016,Tween-803.3、ρΗ6.5。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述发酵培养天数为5d。
7.—种降粘酶组合物，其特征在于:依照如下方法制得:将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30°C、130rpm下培养4d~5d，制得降粘酶组合物；所述发酵培养基是如下二种之一: 发酵培养基一(g/L):风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ5.0 ；
发酵培养基二(g/L):风干玉米芯 20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgS04.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005,ZnSO4.7Η200.0014,MnSO4.Η200.0016,COCl2.6Η200.0016,Tween-803.3、ρΗ6.5。
8.根据权利要求7所述的降粘酶组合物，其特征在于:经离心，取上清液经0.22 μ m过滤器过滤提纯。
9.利用权利要求7或8所述的降粘酶组合物实施的甘薯块茎发酵降粘的方法，其特征在于:向甘薯块茎浆中添加反应酶液，50°C、ISOrpm条件下反应2h ;所述反应酶液是降粘酶组合物。
10.根据权利要求9所述的甘薯块茎发酵降粘的方法在甘薯燃料乙醇发酵中的应用。
【文档编号】C12N9/00GK103525709SQ201310451257
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】赵海, 靳艳玲, 方扬, 黄玉红 申请人:中国科学院成都生物研究所