一种真核表达时酶切回收的方法
【专利摘要】本发明公开了一种真核表达时酶切回收pcDNA3.1(-)的方法。具体步骤为：首先与目的基因连接并鉴定阳性,重温质粒,应用EcoRI和BamHI对pcDNA3.1(-)进行双酶切反应,反应体系为50μl:质粒20μl,EcoRI、BamH各I1μl,10×kBuffer5μl加水至50μl。本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全长序列。结论:成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。
【专利说明】—种真核表达时酶切回收的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生化的实验方法，具体来说，一种真核表达时酶切回收PCDNA3.1 (-)的方法。
【背景技术】
[0002]]血管内皮生长因子C(VEGF-C)属VEGF/PDGF家族成员，其受体为VEGFR -2，VEGFR -3。VEGF通过VEGFR -2调节血管和淋巴管的增生，而VEGFR-3表达则局限于淋巴管内皮，VEGF -C为VEGFR-2的结合，产生生物学效应的所需浓度远高于VEGFR -C，因此，VEGFR -3是淋巴管增生特异性调节因子，用VEGF -C转基因鼠实验证实，VEGF -C的高表达可以选择性地引起淋巴管增生，经研究，VEGF -C表达与肿瘤淋巴管增生和转移的关系是VEGF -C高表达可促进肿瘤的淋巴转移，其机理是VEGF -C促进了肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。为进一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其机制，我们构建了携带人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表达载体，研究了它在真核细胞内的表达，为探讨VEGF -C与淋巴管增生的关系，VEGF -C基因用于治疗淋巴水肿和某些癌肿的可行性提供实验依据。
【发明内容】
[0003]为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案:
一种真核表达时酶切回收pc DNA3.1 (-)的方法，与目的基因连接并鉴定阳性，重温质粒，应用EcoR I和BamH I对pc DNA3.1 (-)进行双酶切反应，反应体系为50 μ 1:质粒 20 μ 1，EcoR 1、BamH 各 I I μ 1，IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I。37°C 水浴酶切反应2.5 μ I, 65°C水浴灭活30min，取10 μ I反应产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定；连接体系为10 μ 1，目的DNA片段I μ 1，pcDNA 3.1㈠双酶切回收片段I μ 1，T4连接酶I μ 1，10XBuffer I μ I,加dH20至10 μ I。反应条件:16 °C过夜，将连接后的pcDNA3.1㈠转化至DH5 α感受态细胞200 μ I中铺于LA平板，37°C孵育16h ;随机挑取LA平板上几个单菌落，分别接种于5ml LA培养液，37°C 180r/min震荡培养过夜，按质粒提取说明提取质粒，加入EcoR I和BamH I行双酶切反应。酶切体系:质粒20 μ 1，EcoR 1.BamH
I各 I μ 1，IOXk Buffer 5 μ 1，加 dH20 至 50 μ 1，37°C水浴酶切反应 2.5h, 65°C水浴灭活30min,取10 μ I反应产物进行1%琼脂糖凝胶反应，筛选阳性重组质粒。
[0004]本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT -PCR产物包含VEGF -C cDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF -C cDNA全长序列，Western -blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF -C蛋白存在。结论:成功构建了人类VEGF -C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。
【具体实施方式】
[0005]具体步骤为:首先与目的基因连接并鉴定阳性，重温质粒，应用EcoR I和BamHI对pc DNA3.1(-)进行双酶切反应，反应体系为50 μ 1:质粒20 μ I，EcoR I ,BamH各I 1μ I, IOXk Buffer 5μ I加水至50 μ I。37°C水浴酶切反应5 μ 1，65°C水浴灭活30min,取10 μ I反应产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定；连接体系为10 μ I，目的DNA片段I μ I, pcDNA 3.1 (-)双酶切回收片段 I μ I，Τ4 连接酶 I μ I，10 XBuffer I μ I，加dH20至10 μ I。反应条件:16 °C过夜，将连接后的pcDNA3.1 (-)转化至DH5 α感受态细胞200 μ I中铺于LA平板，37°C孵育16h;随机挑取LA平板上几个单菌落，分别接种于5ml LA培养液，37°C 180r/min震荡培养过夜，按质粒提取说明提取质粒，加入EcoRI和BamH I行双酶切反应。酶切体系:质粒20 μ 1，EcoR 1、BamH I各Ιμ?，IOXkBuffer 5μ I,加dH20至50μ1，37 °C水浴酶切反应2.5h，65°C水浴灭活30min，取10μ1反应产物进行1%琼脂糖凝胶反应，筛选阳性重组质粒。本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT -PCR产物包含VEGF -C cDNA全长。
[0006]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种真核表达时酶切回收的方法，其特征在于，与目的基因连接并鉴定阳性，重温质粒，应用EcoR I和BamH I对pc DNA3.1 (-)进行双酶切反应，反应体系为50 μ 1:质粒 20 μ I，EcoR 1、BamH 各 I I μ 1，IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I ;37°C 水浴酶切反应2.5 μ 1，65°C水浴灭活30min，取10 μ I反应产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定；连接体系为10 μ I,目的DNA片段Ιμ?，pcDNA 3.1 (-)双酶切回收片段I μ I，Τ4连接酶I μ I，10XBuffer I μ I，加dH20至10 μ I ;反应条件:16 °C过夜，将连接后的pcDNA3.1 (-)转化至DH5 α感受态细胞200 μ I中铺于LA平板，37°C孵育16h ;随机挑取LA平板上几个单菌落，分别接种于5ml LA培养液，37°C 180r/min震荡培养过夜，按质粒提取说明提取质粒，加入EcoR I和BamH I行双酶切反应；酶切体系:质粒20 μ 1，EcoR 1、BamH I各1μ I , IOXk Buffer 5 μ I,加 dH20 至 50μ1, 37 °C水浴酶切反应 2.5h，65°C水浴灭活30min,取10 μ I反应产物进行1%琼脂糖凝胶反应，筛选阳性重组质粒。
【文档编号】C12N15/10GK103602660SQ201310519305
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】王景文 申请人:王景文